Name: Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למד למדוד פלישה מושרית TGF-β בסביבת קולגן תלת-ממדית באמצעות שיטת ספירואידים עם תאי MCF10A. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני פלישה בסרטן שד בצורה מדויקת יותר ממבחני שריטה מסורתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים קן איווטה (OSI Pharmaceuticals, ניו יורק, ארה&quot;ב) עבור ריאגנטים פרד מילר (ברברה אן Intitute Karmanos סרטן, דטרויט, ארה&quot;ב) על שורות תאים.

1. הכנת התמיסה methocel (500 מ"ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי 6 גרם של methylcellulose בבקבוק 500 מ"ל המכיל stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את methylcellulose ב 250 מ"ל של DMEM/F12 שחומם מראש ללא בסרום (60 מעלות צלזיוס) במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 250 מ"ל של DMEM/F12 (RT) המכילה סרום סוס 10%. מערבבים לילה (4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הפתרון על ידי צנטריפוגה (5000g, 2h, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פתרון צמיגה מאוד ברור צינור חדש (כ 90-95% של הפתרון המלאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 ° C עד השימוש. </li></ol> 2. Spheroid תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון methocel 20% (10 מ"ל ו - 40 methocel צמיחה בינוני מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמיים עם PBS, להוסיף טריפסין 0.1% ותאי לדגור על 37 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בינוני צמיחה לספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה של 10 תאים לכל 000 מ"ל ב methocel 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה תא 96 תחתית עגולה היטב suspension צלחות (100 μl לכל היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבדוק את היווצרות spheroid על צלחות ההשעיה. Spheroids יהיה מוכן לשימוש אחרי 1-3 ימים. </li></ol> 3. הכנה של קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן על הקרח פתרון של קולגן 8 מ"ל, 1 מ"ל PBS 10x, 1 מ"ל 0.1 N NaOH ו - 3 טיפות 0.1 N HCl. בדוק אם ה-pH 7.4 ידי תצפית חלק מהפתרון על רצועות אינדיקטור pH. התאם את ה-pH אם מחוץ לטווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון קולגן לנטרל בבארות של צלחת 96 באר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C עד קולגן הוא ביסס (90 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן methocel-קולגן ליגנד פתרונות על הקרח: עבור כל חלק פיפטה 1 ליגנד של הפתרון קולגן. הוסף 20 ננוגרם לכל מ"ל של קולגן TGF-β. לאחר דילול עם methocel ודיפוזיה על שכבות שונות, הריכוז הסופי של TGF-β יהיה 5 ng / ml מערבבים ידי vortexing. הוסף 1 חלק מהפתרון-methocel. מערבבים ידי vortexing. </li></ol> 4. Spheroid להטביעדינג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפ 200 μl אשר יש כ 5 מ"מ של קצה לחתוך, על פיפטה 200 μl. תמצצי את אחד spheroid עם פיפטה ובזהירות לוותר על המדיום לתוך צלחת ריקה. צפה spheroid אם נשאר בתוך קצה. Spheroid נראה כנקודה לבנה. מבלי לשחרר את הבוכנה, להתחנף 100 תערובת μl קולגן methocel ולחלק spheroid בתערובת הקולגן לתוך מצופה קולגן-96 גם כן. עשו זאת במשך 12 spheroids לכל מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הקולגן לחזק לפחות 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בועות אוויר עם טיפ 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של המדיום עם סרום 1.6% ו מעכבי מומס DMSO. עבור SB-431542 להוסיף 4 μl של פתרון המניות (10 mM) ל 1 מ"ל של מדיום. לאחר הקניה, את הריכוז הסופי של המעכב יהיה 10 מיקרומטר. TGF-β ו מעכבי יישאר את מהלך הניסוי. צלמו תמונות של spheroids תחת מיקרוסקופ באמצעות הגדלה 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48h של גירוי עם TGF-β ו / או מעכבי, לצלם spheroids תחת מיקרוסקופ באמצעות הגדלה 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את השטח של פולשים spheroids אחרי 2 ימים להחסיר את אזור ההתחלה. מדידת שטח של spheroid: פתח את התמונה מן spheroid ב-Adobe Photoshop Extended (דמות 2A) ובחר את הכלי בחירה מהירה (דמות 2B). מצביע העכבר משתנה לתוך מעגל עם 'פלוס' (+) סימן (דמות 2C). בעוד גרירת הסמן מעל spheroid, Photoshop יכירו את גבולות spheroid. אם האזור שמחוץ spheroid נבחר, באזור זה ניתן לשלול מהרשימה על ידי לחיצה על מקש Alt או באמצעות כלי הבחירה השלילית אשר מסומנת על ידי - סימן בסרגל הכלים (). השינויים הסמן לתוך מעגל עם 'מינוס' (-) לחתום על ידי גרירת הסמן מעל האזור הנבחר שלא בצדק, בתחום זה היא להסיר את הבחירה (דמות 2D). אם יש צורך, באזורים מרובים ניתן לבחור על ידי לחיצה על שכפתור IFT. כדי לעבוד בצורה מדויקת יותר, בגודל של מצביע העכבר יכול להיות מותאם על ידי שינוי קוטר המברשת בסרגל הכלים (2E דמות). כאשר spheroid כל נבחרת, אזור הבחירה מחושב דרך למדוד ניתוח בשורת התפריטים או על ידי לחיצה על Ctrl + Shift + M (דמות 2F). חלון ההקלטה מדידה יופיעו מראה את שם הקובץ ואת השטח של הבחירה בפיקסלים, כמו גם נתונים אחרים (דמות 2G). אם בחירות מרובות נמדדים, השורה הראשונה מציגה את הסכום של כל האזורים. המדידות של בחירות הפרט מוצגים קווי להלן. הנתונים של כל המדידות ניתן לייצא לקובץ טקסט ופתח ב-Excel. </li></ol> 5. נציג תוצאות: דוגמה של assay spheroid עם MCF10A1 (M1) בתאי אפיתל השד נורמלי, הפך H-RAS MCF10AneoT (M2) תאים M2-derived MCF10CA1a (M4) ניתנת באיור 3. תאים M1 הראו רק פלישה חלש ללאגירוי, אבל פלש באופן משמעותי יותר על ידי גירוי TGF-β. לעומת זאת, RAS-טרנספורמציה M1-M2 נגזרת פלשו כבר וביעילות ללא תוספת של גירויים, וזה היה גדל עוד יותר פי 4-5 על טיפול TGF-β. תאים M4 הראה את הפלישה החזק ביותר, עם או בלי תוספת TGF-β. בשלב הבא, בחנו אם נוכל להפריע הפלישה TGF-β-Induced במודל זה spheroid באמצעות מעכבי כימיים. לשם כך השתמשנו SB-431542, אנלוגי ו-ATP מעכב סלקטיבי של פעילות קינאז של TβRI, כמו גם סוג activin IB קולטן (ActRIB) ו activin קולטן כמו קינאז (ALK) 7 12. כצפוי, SB-431542 potently עכבות TGF-β-Induced הפלישה של M1, M2 ו M4 התאים (איור 4), המציין כי הפלישה TGF-β-Induced הוא TβRI-kinase תלויים. בנוסף, הפלישה הבסיס של spheroids היה גם מאוד עכבות, מה שמראה כי הפלישה הבסיס הוא גם דהתלוי על TGF-β. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> 1. תרשים זרימה תרשים של assay spheroid 3D. ראשית, התאים הלא מצופה תחת חסיד התנאים u בצורת צלחות השעיות. תאים aggregrate לתוך spheroids multcellular והוא יכול להיות מוטבע לתוך מטריצה ​​קולגן. למטריצה ​​זו קולגן, הם יכולים לפלוש. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. כימות שטח של spheroids באמצעות Adobe Photoshop Extended. (א) התמונה של spheroid הוא נפתח לבחירה Adobe Photoshop (ב) Extendend של הכלי בחירה מהירה (C) לגרור את הסמן מעל spheroid כדי לבחור את האזור של להסרת (ד) spheroid אזור כלול wongly באמצעות כלי Quick Selection שלילי (E) התאמת גודל המברשת של הכלי בחירה מהירה יותר מדויק לבחור את האזור (F) בחירה שלמדידה הפקודה להקלטה (G) דוגמה של רשומה המדידה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> באיור 3. TGF-β-Induced הפלישה spheroids של MCF10A1 הונצח באופן ספונטני (M1) (א), RAS-טרנספורמציה MCF10AneoT (M2 (B) נגזרת גרורתי שלה MCF10CA1a (M4) (ג). M1, M2 ו M4 spheroids מוטבע לתוך קולגן טופלו 5ng/ml של TGF-β עבור 48h כמצוין. AC תמונות נציג נלקחה ב יום הטבעה וכעבור יומיים. הפלישה D יחסית היה לכמת כהפרש באזור ביום יום מינוס 2 0. התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן מעובד מתוך 13. <img alt="איור 4א" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4 א"> <img alt="איור 4ב" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="תרשים 4 ב"> איור 4. הפלישה spheroid הבסיס, TGF-β-Induced מעוכבת בy SB-431542. Spheroids M1, M2 ו M4 היו מוטבע קולגן שטופלו 5ng/ml TGF-β ו / או 10 מיקרומטר SB-431542, כמצוין. נציג תמונות שצולמו לאחר 2 ימים (א '). הפלישה היתה יחסית לכמת כהפרש שטח ביום יום מינוס 2 0 (B). התוצאות הן כפי שבאה לידי ביטוי ממוצע ± סטיית תקן מעובד מתוך 13.

<ol><li>Akhurst, R. J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+cancer--a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword.</a> Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-β in Cancer.</a> Cell. 134, 215-215 (2008).</li>
<li>Ghellal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+TGF-%CE%B21+and+TGF-%CE%B2+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma.</a> Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).</li>
<li>Sheen-Chen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Surg%22%5BJournal%5D)">Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer.</a> Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).</li>
<li>ten Dijke, P., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+TGF-%CE%B2-Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">New insights into TGF-β-Smad signaling.</a> Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).</li>
<li>Moustakas, A., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Smad+TGF-%CE%B2+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-Smad TGF-β signals.</a> J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).</li>
<li>Soule, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+human+breast+epithelial+cell+line%2C+MCF-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10.</a> Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).</li>
<li>Strickland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+premalignant+MCF10AT+generates+heterogeneous+malignant+variants+with+characteristic+histologic+types+and+immunohistochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers.</a> Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).</li>
<li>Santner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+multicellular-mediated+resistance+to+alkylating+agents+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).</li>
<li>Inman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-b+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+%28ALK%29+receptors+ALK4%2C+ALK5%2C+and+ALK7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).</li>
<li>Wiercinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSmad+pathway+induces+breast+cancer+cell+invasion+through+the+up-regulation+of+matrix+metalloproteinase+2+and+9+in+a+spheroid+invasion+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system.</a> Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).</li>
<li>Tang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC. Med. 6, 11-11 (2008).</li>
<li>Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).</li>
<li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).</li>
<li>Lee, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).</li>
<li>Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> 30, 256-256 (2011).</li>
<li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21-Activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> 10, 314-314 (2011).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים.

הקמנו מודל spheroid שבו MCF10A1 תאים ממאירים ונגזרות שלו לפלוש לתוך מטריצה ​​קולגן בצורה TGF-β תלויים. ראשית, spheroids נוצרות 96-בארות ההשעיה בסיבוב צלחות התחתונה בנוכחות methylcellulose. כמובן, גם בצורת U מרובה המה צלחות מצופה יכול לשמש למטרה זו. Methylcellulose דרושה לחלוטין בשלב זה, שכן התאים ימותו בהעדר methylcellulose. TGF-β הוא הוסיף ישירות תערובת קולגן methocel מאז מצאנו כי תאים הגיב פחות טוב את TGF-β, כאשר גורם זה התווסף העליון אופ בינוני של הקולגן. עם זאת, מומלץ להוסיף מ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> מתיל צלולוזה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> מתקדם Biomatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> אינדיקטור pH רצועות </td><td> מרק </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96, גם השעיה צלחות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96-TC גם הידבקות צלחות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

assay spheroid למדוד tgf-β-induced invasion

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-β יש המתנגדים תפקידים התקדמות סרטן השד על ידי מתנהג כמו מדכאי גידול בשלב הראשוני, אבל מגרה הפלישה גרורות ב 1,2 בשלב מאוחר יותר. יתר על כן, TGF-β הוא overexpressed לעתים קרובות סרטן השד וביטויו בקורלציה עם תחזית גרועה וגרורות 3,4. המנגנונים שבאמצעותם TGF-β גורם הפלישה אינם מובנים היטב. TGF-β מעורר תגובות הסלולר שלה באמצעות TGF-β מסוג II (TβRII) ואת סוג I (TβRI) קולטנים. עם היווצרות TGF-β-Induced מורכב heteromeric, TβRII phosphorylates TβRI. TβRI מופעל יוזם מסלול איתות תאיים הקנונית שלה על ידי Smads קולטן phosphorylating (R-Smads), כלומר Smad2 ו Smad3. אלה מופעלים R-Smads טופס מתחמי heteromeric עם Smad4, אשר מצטברים בגרעין ולווסת את שעתוק של גני מטרה 5. בנוסף ד בעברמסלול Smad escribed, הפעלת קולטן תוצאות ההפעלה של מספר אי - Smad מסלולים אחרים איתות, למשל Mitogen הופעל חלבון kinase (MAPK) 6 מסלולים. כדי לחקור את תפקידה של TGF-β בשלבים שונים של סרטן השד, עשינו שימוש במערכת תא MCF10A. מערכת זו מורכבת הנציח ספונטני MCF10A1 (M1) בתאי אפיתל השד 7, הפך את H-M1-RAS נגזרת MCF10AneoT (M2), אשר מייצרת נגעים טרום ממאיר בעכברים 8, ו-M2 נגזרת MCF10CA1a (M4), אשר הוקמה מ xenografts M2 וצורות קרצינומות ציון גבוה עם היכולת ליצור גרורות לריאות 9. סדרה זו MCF10A מציע את האפשרות ללמוד את תגובותיהם של תאים עם דרגות שונות של ממאירות שאינם מוטים על ידי רקע גנטי שונה. ניתוח הפלישה TGF-β-Induced, אנחנו שנוצר homotypic MCF10A embe תרבויות spheroid תאdded במטריצה ​​קולגן 3D במבחנה (איור 1). מודלים כאלה דומים גידולים אנושיים in vivo על ידי הקמת שיפוע של חמצן וחומרים מזינים, וכתוצאה מכך התאים פעיל פולשני על תאים בחוץ שקט או אפילו נמקי בפנים של 10 spheroid. מבחני מבוסס Spheroid יש גם הוכח בצורה טובה יותר לסכם את עמידות לתרופות מאשר תרבויות monolayer 11. מערכת זו MCF10 מודל 3D אפשרה לנו לחקור את ההשפעה של איתות TGF-β על המאפיינים פולשני של תאים השד בשלבים שונים של ממאירות.

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג&#39;ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

ל-TGF-&beta; תפקידים מנוגדים בהתקדמות סרטן השד, בכך שהוא פועל כמדכא גידולים בשלב הראשוני, אך מעודד פלישה גרורה ומטסטזיס...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד את ההשפעה של רגולטורים פוטנציאליים על פלישה המושרית על ידי TGF beta בסביבה תלת-ממדית. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת ספרואידים של התאים. לאחר מכן, תאי ה-PHE מוטמעים בקולגן, המספק סביבה תלת-ממדית.בשלב הבא, נבצע כימות של שטח הפלישה. כדי לקבוע את השפעת הטיפול על פלישה המושרית על ידי TGF beta, התוצאות מראות כי מודולטורים של מסלול ה-TGF-beta משפיעים על תכונות הפלישה של הסטרואידים במטריצת קולגן תלת-ממדית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת שריטה (scratch assay), הוא שהיא מדמה טוב יותר את הסביבה התלת-ממדית.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי ה-T meter, כגון זיהוי גנים חדשים המעורבים בפלישה המושרה על ידי TGF beta. כדי להכין תמיסת מתיל-צלולוז עבור בדיקת פלישה המושרה על ידי TGF beta, התחילו בסטריליזציה במערכת אוטוקלאב של 6 g של Methylcellulose בבקבוק של 500 mL המכיל מגנט לערבוב. המסו את ה-Methylcellulose ב-250 mL של DMEM/F12 שחומם מראש ללא סרום למשך 20 דקות, הוסיפו 250 mL של DMEM/F12 בטמפרטורת החדר המכיל 10% סרום סוס, וערבבו למשך לילה ב-4 °C. למחרת, הבהירו את התמיסה באמצעות סנטריפוגציה ב-5,000 ×g למשך שעתיים ב-4 °C.העבר את התמיסה הצלולה והצמיגית מאוד למבחנה חדשה ואחסן בטמפרטורה של four degrees Celsius עד לשימוש לתרבית phe. הכן תמיסת methyl cell בריכוז 20% באמצעות 10 milliliters של מלאי ה-methyl cell שהוכן ו-40 milliliters של growth Medium. שטוף תאי MCF 10 A פעמיים עם PBS.הוסיפו 0.1% trypsin והדגירו את התאים ב-37 degrees Celsius עד שכל התאים יסתלקו. השהו מחדש את התאים ב-10 milliliters של מצע גידול, וספרו את התאים באמצעות סופר תאים. הכינו תרחיף של 10,000 תאים למילליליטר ב-20% methyl cell.עבור כל תנאי בדיקה, הוסף 100 µL מתלי suspension התאים ל-12 בארות של פלטת תרחיף בעלת תחתית עגולה עם 96 בארות. הדגר את התאים למשך לילה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. למחרת, בדוק אם נוצרו ספרואידים.הספרואידים יהיו מוכנים לשימוש תוך יום עד שלושה ימים. הכין על קרח תמיסה של שמונה מיליליטר של collagen, מיליליטר אחד של 10 XPBS, מיליליטר אחד של 0.1 normal sodium hydroxide ושלוש טיפות של 0.1 normal hydrochloric acid. ודא כי ה-pH של התמיסה הוא 7.4 באמצעות בדיקה על נשאי pH.כווננו את ה-pH אם הוא מחוץ לטווח. הוסיפו 50 µL של תמיסת קולגן מנוטרלת לבארות של פלטת 96 בארות והדגירו ב-37 °C למשך כ-90 דקות או עד שהקולגן יתמצק. עבור כל ליגנד שייבדק, הכינו תמיסת ליגנד קולגן של תאי מיתיל על קרח.התחילו עם מיליליטר אחד של תמיסת קולגן לטיפול, והוסיפו 20 ננוגרם של TGF beta לריכוז סופי של חמישה ננוגרם למיליליטר, תוך ערבוב באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת מתיל-סלולוז לנפח סופי של שני מיליליטרים וערבבו בוורטקס. כדי להטמיע סטרואיד, השתמשו בקצה של פיפטה של 200 מיקרוליטר, שבו נגזרו 5 מילימטרים או יותר מהקצה, על פיפטה של 200 מיקרוליטר.לאחר מכן, שאבו ספרואיד S אחד באמצעות הפ pipette. העבירו בזהירות את המצע לצלחת ריקה תוך הקפדה על כך שספרואיד ה-S יישאר בתוך הטיפ. אין לשחרר את הבוכנה.שאבו 100 µL מתערובת התאיים עם הקולגן והעבירו את תערובת הקולגן לספרואידים לבאר מצופה קולגן בתוך פלטת 96 בארות. מלאו 12 בארות עבור כל תנאי. הניחו לקולגן להתמצק לפחות 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C והסירו בועות אוויר באמצעות טיפ של 200 µL.הכינו תמיסה של 40 micromolar של מעכב TGF beta מסוג SB 4 31 542 על ידי הוספת ארבעה microliters של תמיסת מלאי (stock solution) של SB 4 31 542 לתוך מיליליטר אחד של D-M-E-M-F 12 המכיל 1.6% horse serum. הוסיפו 50 microliters של מצע עם המעכב לכל באער לאחר הדיפוזיה. הריכוז הסופי של המעכב יהיה 10 micromolar.צלם את הספרואיד תחת המיקרוסקופ בהגדלה של 40x, ולאחר מכן דגרו באינקובטור לח במעלה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר דגירה של יומיים, צלם שוב ומדוד את שטח הספרואיד הפולש על ידי פתיחת תמונת הספרואיד ב-Adobe Photoshop. הרחב ובחר בכלי הבחירה המהירה (quick selection tool).סמן העכבר ישתנה לעיגול עם סימן פלוס בעת גרירת הסמן מעל הספרואיד. התוכנה תזהה את גבולות הספרואיד. אם נבחר אזור מחוץ לספרואיד, יש להחריג את האזור על ידי לחיצה על מקש ה-alt או על ידי שימוש בכלי הברירה השלילית, המיוצג על ידי סימן מינוס בסרגל הכלים.גררו את הסמן מעל האזור שנבחר בטעות והתוכנה תסיר אותו מהבחירה. אם אזור בתוך הספרואיד הוסר מהבחירה, ניתן לכלול אותו שוב על ידי גרירה תוך לחיצה על מקש ה-shift. לעבודה מדויקת יותר, התאימו את גודל סמן העכבר על ידי שינוי קוטר המברשת בסרגל הכלים.כדי לחשב את השטח של כל הבחירות הפעילות, בחרו ב-analysis measure בסרגל התפריטים. יופיע חלון הקלטת מדידות שיציג את שם הקובץ ואת שטח הבחירה בפיקסלים. אם נמדדו מספר בחירות בתוך ספרואיד אחד, השורה הראשונה תציג את סכום כל השטחים והשורות שמתחתיה.הרשימה תציג את הערכים של הבחירות האינדיבידואליות. ייצאו את הנתונים לקובץ טקסט ופתחו אותו ב-excel. דוגמה לבדיקת S spheroid עם תאי MCF 10 A one, תאי אפיתל שד נורמליים, תאי MCF 10 A neo T שעברו טרנספורמציה ותאי MCF 10 CA one A נגזרים מ-M two מוצגת כאן.תאי M1 הראו פלישה חלשה בלבד ללא גרייה, אך פלשו באופן משמעותי יותר לאחר גרייה על ידי TGF beta. לעומת זאת, תאי M four, נגזרים של M1 שעברו טרנספורמציה על ידי RAs, פלשו ביעילות ללא הוספת גרייה, ושיעור זה עלה פי ארבעה עד חמישה. לאחר טיפול ב-TGF beta, תאי M four הראו את הפלישה החזקה ביותר, הן ללא והן עם הוספת TGF Beta.ייצוג גרפי של התוצאות עבור ניסוי זה הופק באמצעות Photoshop ומוצג כאן; SB 4 31 5 42, אנלוג של ATP ומעכב סלקטיבי של פעילות הקינאז של TGF beta receptor one, הפעיל גם ב-type one B receptor וב-receptor like kinase seven, הוסף לתרביות התאים. SB 4 31 5 42 עיכב בעוצמה את הפלישה המושרה על ידי TGF beta של תאי M1, M two ו-M four, דבר המעיד על כך שפלישה המושרה על ידי TGF-beta תלויה בקינאז של TGF-beta receptor one. בנוסף, הפלישה הבסיסית של ה-PHE עיכבה באופן חזק. ייצוג גרפי של התוצאות עבור ניסוי זה נוצר שוב באמצעות Photoshop ומוצג כאן.בעקבות נוהל זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בידוד RNA או בידוד חלבונים כדי לענות על שאלות נוספות, כמו אילו גנים באים לידי ביטוי או אילו חלבונים באים לידי ביטוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למצוא מודולטורים חדשים של פלישה המושרה על ידי tavita.

spheroid-assay-to-measure-tgf-induced-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: Guyon, J., et al. מודל ספרואיד תלת מימדי לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מדגים את היצירה של מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול. ספרואידים נוצרים מתאי גידול מוח אנושיים ומוטמעים במטריצת קולגן. תאי הגידול בפריפריה הספרואידית מאמצים פנוטיפ פולשני, מפרישים פרוטאזות כדי לפרק את הקולגן ומתקדמים לפלוש למטריצה שמסביב.

יצירת מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול

פלישת תאי סרטן השחלות לmesothelial הבטנה של הצפק היא תהליך דינמי לאורך זמן. ניצול מנתח בזמן אמת, את היכולת פולשני של תאי סרטן שחלות במודל תא שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial ניתן לכמת על פני תקופות זמן ממושכות, המספקת תובנות גורמים המסדירים את התהליך גרורתי.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

צלחת הדמיה המבוססת על HMCA מוצג לביצועים assay הפלישה. הצלחת הזו מקלה על היווצרות הגידול תלת מימדי (3D) spheroids והמידה של סרטן תאים פלישת מטריצות (ECM). כימות assay הפלישה מושגת על ידי ניתוח חצי-אוטומטי.

ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות

מיקרוסביבה הגידול הוא חלק חיוני של גידול בסרטן ופלישה. כדי לחקות התקדמות קרצינומה, צריך מטריצה אנושית רלוונטית ביולוגית. פרוטוקול זה מציג שיפור לגבי שיטת החדירה החיצונית התלת-ממדית של שלושה מימדים על-ידי החלת מטריצה אנושית המבוססת על מייומה. הפרוטוקול גם מציג ניתוח הפלישה לתא מבוסס-מחשב.

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל 3D בתחום החוץ כדי ללמוד את הבידול של סרטן הקשורות בגידולים סרטניים (CAFs) בסביבה בצובר כמו גידול, אשר ניתן לטפל במערכות ניתוח שונות, כגון immunofluorescence ההמרה ניתוח והדמיה של תאי החיים.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

פלישה היא תופעה ביולוגית מרכזית בהתפתחות והתקדמות סרטן. תהליך זה מושפע מתאים שאינם ניאופלסטיים ומרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול. מטרת מחקר זה היא לתאר שיטה חלופית לניתוח פלישת תאי גידול במבחנה באמצעות תרביות תלת ממדיות (3D).

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקירת האינטראקציה של מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים עם ספרואיד גידול במטריצת קולגן I תלת מימדית (תלת מימדית), עם אפשרות להשוות את ההשפעה של תכונות מסיסות ופיזיקליות של המיקרו-סביבה על פלישת התאים.

בדיקת פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול ספרואידים

למד למדוד פלישה מושרית TGF-β בסביבת קולגן תלת-ממדית באמצעות שיטת ספירואידים עם תאי MCF10A. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני פלישה בסרטן שד בצורה מדויקת יותר ממבחני שריטה מסורתיים.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

גלה סרטונים נוספים