Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש במדד ההשפעה של מווסתים פוטנציאליים של פלישה הנגרמת על ידי TGF beta בסביבה תלת מימדית. זה מושג על ידי יצירת ספרואידים של התאים תחילה. לאחר מכן, ה-PHE מוטמעים בקולגן, המספק סביבה תלת מימדית.

לאחר מכן, מכמתים את האזור הפולשני. על מנת לקבוע את השפעת הטיפול על פלישה הנגרמת על ידי TGF beta, התוצאות מראות כי מודולטורים של מסלול TGF-beta משפיעים על התכונה הפולשנית של הסטרואידים במטריצת קולגן תלת מימדית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מאמר שריטה, הוא שהיא מסכמת טוב יותר את סביבת התלת מימד.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדות מד T, כגון זיהוי גנים חדשים המעורבים בפלישה הנגרמת על ידי בטא של מורה. כדי להכין תמיסת תאי מתיל לבדיקת הפלישה המושרה על ידי TGF beta, התחל בחיטוי שישה גרם של מתיל צלולוז בבקבוק של 500 מיליליטר המכיל ערבוב מגנטי. ממיסים את המתיל צלולוז ב-250 מיליליטר של D-M-E-M-F 12 שחומם מראש ללא סרום למשך 20 דקות, מוסיפים 250 מיליליטר של טמפרטורת החדר D-M-E-M-F 12 המכיל 10% תערובת סרום סוס למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת, נקה את התמיסה על ידי צנטריפוגה ב-5,000 גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.

העבירו את התמיסה השקופה והצמיגה מאוד לחנות שפופרת חדשה בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש לתרבית פה. הכן תמיסת תאי מתיל של 20% באמצעות 10 מיליליטר ממלאי תאי המתיל המוכן ו -40 מיליליטר גידול. שטיפה בינונית תאי MCF 10 A פעמיים עם PBS.

הוסיפו 0.1% טריפסין ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שכל התאים מנותקים. השעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר, מדיום גידול וספרו את התאים באמצעות מונה תאים. הכן תרחיף של 10,000 תאים למיליליטר בתא מתיל של 20%.

עבור כל תנאי בדיקה, הוסף 100 מיקרוליטר של מתלה התא ל-12 בארות של לוחית מתלה תחתונה עגולה של 96 בארות. דגרו את התאים למשך הלילה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת בדוק אם יש היווצרות ספרואידים.

ספרואידים יהיו מוכנים לשימוש תוך יום עד שלושה ימים. הכינו על הקרח תמיסה של שמונה מיליליטר קולגן, מיליליטר אחד של 10 XPBS, מיליליטר אחד של 0.1 נתרן הידרוקסיד רגיל ושלוש טיפות של 0.1 חומצה הידרוכלורית רגילה. בדוק שה-pH של התמיסה הוא 7.4 על ידי איתורו על רצועות מחוון pH.

התאם את ה-pH אם הוא מחוץ לטווח. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת קולגן מנוטרלת לבארות של צלחת 96 באר דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-90 דקות או עד שהקולגן מתמצק. עבור כל ליגנד לבדיקה, הכינו תמיסת ליגנד קולגן תאי מתיל על קרח.

התחל עם מיליליטר אחד של תמיסת קולגן לכל טיפול, והוסף 20 ננוגרם של TGF beta לריכוז סופי של חמישה ננוגרם למיליליטר מעורבב על ידי מערבולת. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת תאי מתיל לנפח סופי של שני מיליליטר ומערבולת. שוב, כדי להטמיע סטרואידים, הנח קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, שחמישה מילימטרים או יותר מהקצה שלו נחתך על פיפטה של 200 מיקרוליטר.

לאחר מכן קח כדור אחד עם הפיפטה. החלק בזהירות את המדיום לצלחת ריקה תוך הקפדה על כך שספרואיד ה-S יישאר בתוך הקצה. אל תשחרר את הבוכנה.

קח 100 מיקרוליטר מתערובת תאי מתיל הקולגן והוציאו את תערובת הקולגן הספרואיד S לבאר מצופה קולגן של 96. צלחת באר מלאה 12 בארות לכל מצב. תנו לקולגן להתמצק לפחות 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס והסירו את בועות האוויר בעזרת קצה של 200 מיקרוליטר.

הכן תמיסה של 40 מיקרו-מולרית של מעכב הבטא TGF SB 4 31 542 על ידי הוספת ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי SB 4 31 542 למיליליטר אחד של D-M-E-M-F 12 המכיל סרום 1.6% סוס. הוסף 50 מיקרוליטר בינוני עם מעכב לכל באר לאחר דיפוזיה. הריכוז הסופי של המעכב יהיה 10 מיקרומולר.

צלם תמונות של הסטרואידים תחת המיקרוסקופ באמצעות הגדלה של פי 40, ולאחר מכן דגירה באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר יומיים של דגירה, צלמו שוב תמונות ומדדו את שטח הסטרואיד הפולש על ידי פתיחת תמונה ספרואידית בפוטושופ של אדובי. מורחב ובחר בכלי הבחירה המהירה.

מצביע העכבר ישתנה לעיגול עם סימן חיבור בעת גרירת הסמן מעל הספרואיד. התוכנה תזהה את גבולות הספרואיד. אם נבחר אזור מחוץ לסטרואידים, אל תכלול את האזור על ידי לחיצה על מקש alt או על ידי שימוש בכלי הבחירה השלילית, שהוא סימן שלילי בסרגל הכלים.

גרור את הסמן מעל האזור שנבחר באופן שגוי והתוכנה תסיר אותו מהבחירה. אם מבטלים את הבחירה באזור בתוך הספרואיד, ניתן לכלול את האזור שוב בגרירה תוך כדי לחיצה על סרגל ההעברה. כדי לעבוד בצורה מדויקת יותר, התאם את גודל מצביע העכבר על-ידי שינוי קוטר המברשת בסרגל הכלים.

כדי לחשב את השטח של כל הבחירות הפעילות, בחר Analysis measure בשורת התפריטים. יופיע חלון הקלטת מדידה המציג את שם הקובץ ואת אזור הבחירה בפיקסלים. אם נמדדות בחירות מרובות בתוך ספרואיד אחד, השורה הראשונה תציג את סכום כל האזורים והשורות שמתחת.

הוא יפרט את הערכים של הבחירות הבודדות. ייצא את הנתונים לקובץ טקסט ופתח אותו באקסל. דוגמה לבדיקת הספרואיד S עם MCF 10 A, תאי אפיתל שד תקינים אחד, HAS הפך תאי MCF 10 A neo T ו-M שני MCF 10 CA נגזר אחד A מוצג כאן.

תאי M1 הראו רק פלישה חלשה ללא גירוי, אך פלשו טוב יותר באופן משמעותי לאחר גירוי על ידי TGF beta. לעומת זאת, ה-RAs הפכו את נגזרת M1 M 2 פלשו ביעילות ללא תוספת של גירויים, וזה הוגדל עוד פי ארבעה עד חמישה. לאחר טיפול בבטא TGF, תאי M ארבעה הראו את הפלישה החזקה ביותר הן ללא מהדורת בטא TGF והן איתה.

ייצוג גרפי של תוצאות ניסוי זה הושג באמצעות פוטושופ ומוצג כאן בדוגמה זו, SB 4 31 5 42 אנלוגי A TP ומעכב סלקטיבי של פעילות הקינאז של קולטן TGF beta 1, כמו גם פעיל בקולטן B מסוג 1 ופעיל בקולטן כמו קינאז 7 נוסף לתרביות התאים SB 4 31 5 42, מעוכב בעוצמה, TGF beta גרם לפלישה של תאי M1, M 2 ו-M 4, מה שמצביע על כך שפלישה הנגרמת על ידי TGF-beta תלויה בקולטן TGF-beta קינאז אחד. בנוסף, הפלישה הבסיסית ל-PHE נבלמה מאוד. ייצוג גרפי של תוצאות הניסוי הזה נוצר שוב באמצעות פוטושופ ומוצג כאן.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד RNA או בידוד חלבונים כדי לענות על שאלות נוספות כמו אילו גנים מתבטאים או אילו חלבונים מתבטאים לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למצוא מודולטורים חדשים של פלישה הנגרמת על ידי טביטה.