הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק
8 בדצמבר 2011
מפתח טכניקות כדי לשמש להערכת קנדידה דלקת הנרתיק במודל חיה ניסיוני מתוארים. שיטות תאפשר איסוף מהיר של דגימות מן הנרתיק לימפוציטים ניקוז בלוטות לימפה המותני. טכניקות אלה יכולים להצמיח מודלים העכבר של מחלות אחרות בדרכי המין הנשי התחתון.
המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים סוגיות פרוצדורליות ספציפיות הקשורות לשימוש במודל חיות ניסוי של קנדידה נרתיקית כאמצעי לכימות העומס הפטרייתי בנרתיק, וכן להשתמש בתאים נרתיקיים או לימפואידיים בבדיקות ספציפיות כגון בדיקות אימונולוגיות והיסטולוגיות. מטרה זו תושג תחילה על ידי הדגמת טכניקת ההזרקה לנרתיק בעכברים שטופלו באסטרוגן. לאחר מכן, לאחר הדממה של העכבר, יבוצע שטיפה נרתיקית (lavage) לשחזור הקנדידה.
לאחר מכן יחלצו את רקמת הנרתיק ו/או את קשרי הלימפה המנקזים של הנרתיק. ניתן לבחון את נוזל השטיפה תחת מיקרוסקופ כדי לזהות קנדידה המלווה תאי אפיתל נרתיקיים, או לזרוע אותה על אגר כדי לכמת את העומס הפטרייתי בנרתיק. ניתן להשתמש בפריכה של הפракציה התאית גם לצביעה של תאי אפיתל ותאים לימפואידיים.
היתרון המרכזי בהדגמת טכניקה זו הוא לאפשר למשתמשים במודל החייתי של דלקת הנרתיק (vaginitis) לבצע אותה בצורה היעילה והאפקטיבית ביותר. השאלות המרכזיות שנענות באמצעות טכניקה זו הן בתחומי דלקת הנרתיק והאקולוגיה, והיא עונה על שאלות מפתח כגון תגובות חיסוניות של המאכסן, התפלגות תאית, יעילות של תרופות, יעילות אימונותרפית, וכן השפעות של חיסון והדגמת הטכניקה. היום, סטודנטית לתארים מתקדמים במעבדתי, junco yano, תדגים כיצד להדביק עכבר ב-C albicans שלושה ימים לאחר מתן זריקה של beta estradiol.
התחל בייצוב העכבר על משטח gRED שטוח כדי שיוכל להיאחז בו. לאחר מכן, החזק את בסיס הזנב בשתי אצבעות והרם את ירך העכבר כלפי מעלה כך שפתח הנרתיק יפנה אליך. הכנס את טיפ הפ pipette לעומק של כ-5 mm לתוך חלל הנרתיק ושאב עד 20 µL מת сусפנסיית האינוקולום.
בצע שלב זה במהירות ובעדינות רבה ככל האפשר כדי למזער את הסטרס של העכבר. לאחר תקופת האינקובציה הרצויה, בצע הריגה של בעל החיים בהתאם לפרוטוקול של המוסד שלך. לאחר מכן, החזק את העכבר כלפי מטה בעזרת שתי אצבעות בבסיס הזנב, כך שפתח הנרתיק יהיה חשוף עבור הפפטה.
החדירו 100 µL של PBS סטרילי אל תוך הלומן הנרתיקי, ובצעו שטיפה (lavage) באמצעות שאיבה וערבוב חוזרים. אם קצה הפפטה נחסם על ידי תאים, פלטו את התאים החוסמים והמשיכו בשטיפה עם ה-PBS שנותר. אספו את נוזל השטיפה למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה.
בעקבות הליך שטיפת הנרתיק, הנח את העכבר על גבו והרבה את אזור המפשעה ב-70% ethanol. באמצעות פינצטה, הרם את פתח השתן כלפי מעלה כך שפתח הנרתיק ייחשף. הכנס זוג פינצטות קמורות לתוך חלל הנרתיק ואתר את צוואר הרחם תוך שמירה על אחיזה חזקה עם הפינצטות.
הוציאו את צוואר הרחם דרך חלל הנרתיק, כרסמו את הנרתיק בבסיס פתח הנרתיק, ולאחר מכן הסירו את צוואר הרחם מהנרתיק באמצעות מספריים כירורגיים. מכיוון שרקמת הנרתיק מכווצת, הפכו אותה כדי לשמור על הכיוון המקורי, או פתחו אותה לצורת דף על ידי ביצוע חתך צדי לצורך כריתת קשריים לומבריים כאשר בעל החיים שוכב על גבו. השביעה את הבטן ב-70% ethanol.
בצעו חתך צדי החל מהבטן התחתונה ועד לחזה, וחשפו את האיברים הפנימיים באמצעות פינצטה בכל אחת מהידיים. הזיזו את המעיים כלפי מעלה כך שכלי הדם המרכזיים יהיו גלויים. אתרו את ה-inferior vena cava ואת ה-abdominal aorta.
ניתן לזהות זוג קשרי לימפה מותניים (lumbar lymph nodes) הסמוכים לאבי העורקים הבטני, הממוקמים בערך במחצית הדרך בין מקור העורקים הכליתיים לעורקי השקיק (common iliac arteries). ניתן להבחין בקשרי לימפה אלו מרקמת שומן על פי מרקמם הגמיש, והם בעלי צבע בהיר ועכור יותר בהשוואה לרקמת שומן. כמו כן, הם גדולים באופן ניכר בבעלי חיים מזוהמים בהשוואה לאלו שלא הוחדרו בפתוגן.
הוצא את קשרי הלימפה מהבעלי החיים על ידי הנחת מיקרו-פינצטה מתחת לקשר, ולאחר מכן משוך בעדינות כלפי מעלה כדי להפרידו מהרקמה שסביבו. לאחר הוצאת הרקמה, העבר את קשרי הלימפה למסננת רשתית סטרילית המוצבת בתוך צלחת פטרי זכוכית סטרילית המכילה כ-10 milliliters של תמיסת מלח מאוזנת של Hank's. כדי לבודד תאי לימפויד, עיין בפרוטוקול הכתוב.
הפרקציות התאיות של נוזל שטיפה נרתיקי מעכברים שהוחדרו לפחות ארבעה ימים קודם לכן מורכבות בדרך כלל מתאי אפיתל עם קנדידה ומנfiltrats תאיים, כפי שמוצג כאן במיקרוסקופיה של דגימה רטובה. ניתן לזהות Candida על ידי נוכחות של PHA וכן שמרים. כאן נצבעו תכשירי מריחה של נוזל שטיפה נרתיקי.
שימוש בטכניקת משטח פאפ (pap smear) לבחינת תאים אפיתליאליים ולבנויקocytes חודרים, כאשר התאים העיקריים הם נויטרופילים, כפי שניתן לזהות לפי הגרעינים בעלי הפלחים. נויטרופילים מעטים מאוד, אם בכלל, מזוהים בעכברים שלא חוללו להם הדבקה. איור זה מציג דוגמה לעומס פטרייתי נרתיקי.
נוזל שטיפה נרתיקי נאסף בנקודות זמן ספציפיות ומזו 여기서 לתרבית לצורך ספירת CFU. בדוגמה זו, הנוזל נאסף בחמישה ימים לאחר ההחדרה, עבר דילול סדרתי, נזרע על מצע גידול ודגרו למשך 48 שעות. לאחר מכן נספרות המושבות ומחושב העומס הפטרייתי הנרתיקי; התנחלות נרתיקית או זיהום ב-candida נמשכים שבועות בעכברים שהוחדרו וקיבלו טיפול באסטרוגן.
בעוד שקנדידה אינה מצליחה להקים יישוב נרתיקי בעכברים ש接חוללו אך לא טופלו באסטרוגן, עכברים שטופלו באסטרוגן אך לא חוללו נשארים שליליים לקנדידה לאורך כל הזמן. בנוסף, ניתן לבצע שטיפות נרתיקיות פעם אחת בעכברים נפרדים בכל נקודת זמן, או באופן אורך באותם עכברים תחת הרדמה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לקבע את בעלי החיים בצורה מאובטחת כדי למנוע טראומה לנרתיק, ויש להקדיש את הזמן הדרוש לשטיפה יסודית כדי לקבל מדד מדויק של העומס הפטרייתי הנרתיקי בעת הפקת רקמות נרתיקיות.
השתמשו ב-PBS סטרילי כדי למנוע מהם התייבשות, ושימו לב שלא לפגוע בורידים ובעורקים מרכזיים בעת הסרת קשרי הלימפה; בזמן עיבוד תאי קשרי הלימפה, שמרו אותם על קרח או בטמפרטורה של ארבע מעלות כדי לשמר את חיוניות התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו הבנה טובה כיצד להשתמש במודל העכבר הניסויי של ואגיניטיס קנדידה כדי לכמת באופן הדיר באופן רב את העומס הפטרייתי הנרתיקי ולהוציא רקמות נרתיקיות או לימפואידיות לצורך בדיקות אימונולוגיות או היסטולוגיות ספציפיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקות מרכזיות להערכה של ואגיניטיס מקנדידה (Candida vaginitis) באמצעות מודל בעלי חיים ניסויי. השיטות מאפשרות איסוף מהיר של דגימות מהנקיב ולימפוציטים מקשרי לימפה לומבריים מנקזים, דבר שעשוי להוביל לפיתוח מודלים של עכברים למחלות אחרות בדרכי השתן והנקיב של הנקבה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מיקרוביולוגיה
- אימונולוגיה
רקע
- ואגיניטיס קנדידאלית (Candida vaginitis) היא מצב שכיח המשפיע על דרכי השתן והמין בנקבה.
- הבנת התגובה החיסונית היא קריטית לפיתוח טיפולים.
- מודלים ניסיוניים מסייעים בחקר מנגנוני המחלה.
- ניתן לכמת קנדידיאזיס וגינלי באמצעות בדיקות ספציפיות.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקות פרוצדורליות למחקרי קנדידה וגינלית.
- לכימות העומס הפטרייתי בנקירי הוגינה במודל ניסויי.
- לשימוש בתאי וגינה ותאי מערכת לימפתית בבדיקות אימונולוגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת הזרקה נרתיקית בעכברים שטופלו באסטרוגן.
- שטיפה נרתיקית לשחזור Candida לאחר הד르면 של העכבר.
- חילוץ רקמה נרתיקית וקשרי לימפה מנקזים.
- בדיקה מיקרוסקופית וזריעת נוזל השטיפה על אגר.
תוצאות עיקריות
- השגה מוצלחת של Candida משטיפה נרתיקית.
- כימות העומס הפטרייתי באמצעות זריעה על מצע אגר.
- זיהוי תאי אפיתל ותאי לימפואידים באמצעות צביעה.
- הדגמת ההיתכנות של המודל למחקרים עתידיים.
מסקנות
- הטכניקות המתוארות מספקות שיטה חסונה לחקר קנדידזיס נסוכי (vaginal candidiasis).
- ניתן להתאים מודל זה למחלות אחרות בדרכי השתן והמין התחתונות של הנקבה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון תגובות אימונולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
המודל הניסויי של ואגיניטיס הנגרם על ידי Candida בעכברים מספק פלטפורמה חסונה לכימות העומס הפטרייתי בנקיד וּלהערכת התגובה החיסונית של המארח במערכת מבוקרת הרלוונטית למחלה. מודל זה מאפשר הערכה הדירה של דינמיקת הזיהום ושל נקודות קצה אימונולוגיות, ובכך תומך בגילוי מוקדם ובהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור מועמדים לתרופות אנטי-פטרייתיות ואימונותרפיוטיות. ההלימה התרגומנית שלו לתכונות הזיהום בבני אדם מגבירה את רמת הביטחון החזיוית לקבלת החלטות בפורטפוליו הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של אינטראקציות בין מאחס לפתוגן ומנגנוני תגובה חיסונית בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות הזיהום והסנfiltration של תאי חיסון ללא משתנים מבלבלים של דיכוי חיסוני.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור אסטרטגיות נוגדות פטריות ומסייעות לוויסות חיסוני.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק פרוטוקולים סטנדרטיים להדבקה, איסוף דגימות וכמותיות של העומס הפטרייתי.
- מספק תוצאים כמותיים הניתנים לשחזור, כגון ספירת CFU ואפיון תאי מערכת החיסון.
- מאפשר דגימה לאורכית מאותו בעל חיים, דבר התומך בפיתוח בדיקות חסון ובזרימות עבודה של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם האימונולוגיה של זיהומים בבני אדם, ובכך מגביר את הרלוונטיות התרגומית להערכת מועמדים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח נקודות קצה אימונולוגיות והיסטולוגיות.
- מאפשר קידום של מועמדים anitfungal ואימונותרפויטיים תוך התאמה לסיכונים, בהתבסס על מדדים כמותיים של זיהום ותגובה חיסונית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהוא מאפשר בדיקת היפותזות, תיקוף מטרות והערכה כמותית של זיהומים ותגובות חיסוניות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך במחקרים מונחי-השערה על אינטראקציות בין מארח לפתוגן ומנגנוני חיסון.
- סריקה: מספק בדיקות מהימנות וניתנות לשחזור למדידת עומס פטרייתי וכמות תאי חיסון.
- אנליטיקה: מייצר תוצרים כמותיים (ספירות CFU, פרופילי תאים) לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסויים.
- מחקר תרגומי: מציע המשכיות עבור נקודות קצה אימונולוגיות וזיהומיות הרלוונטיות למחלות בבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת השערות זיהומיות ואימונולוגיות מגוונות בדרכים העגנוניות הנמוכות של הנשיאה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים אנטי-פטרייים ואימונולוגיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי זיהום ודגימה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי אספקת נתונים פרה-קליניים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של מועמדים טיפוליים המכוונים לזיהומים ריריים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בבעלי חיים, מודלים של זיהום ובדיקות אימונולוגיות.
- דורש גישה למכשור לאיסוף דגימות, מיקרוסקופיה וזריעה כמותית.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולים בין צוותים כדי להבטיח הדירות בין המחקרים.
- ניתן להתאימו למודלים אחרים של מחלות זיהומיות של דרכי השתן והמין התחתונות של הנקבה באמצעות שינויים בפרוטוקול.
- טיפול זהיר ועיבוד דגימות הם קריטיים לשמירה על חיוניות התאים ועל שלמות הנתונים.
