הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים סוגיות פרוצדורליות ספציפיות הקשורות לשימוש במודל החיות הניסיוני של קנדידה נרתיקית כאמצעי לכימות עומס פטרייתי בנרתיק, וגם להשתמש בתאי נרתיק או לימפה במבחנים ספציפיים כגון בדיקות אימונולוגיות והיסטולוגיות. זה יושג על ידי הדגמה ראשונה של טכניקת החיסון הנרתיקית בעכברים שטופלו באסטרוגן. לאחר מכן, לאחר המתת חסד של העכבר, תבוצע שטיפת נרתיק לשחזור קנדידה.

לאחר מכן יופקו רקמת הנרתיק ו/או בלוטות הלימפה המנקזות את הנרתיק. ניתן לראות את נוזל השטיפה במיקרוסקופ כדי להראות קנדידה הקשורה לתאי אפיתל בנרתיק או מצופה על אגר כדי לכמת את העומס הפטרייתי בנרתיק. מריחה של השבר הסלולרי יכולה לשמש גם לצביעה של תאי אפיתל ותאי לימפה.

אז היתרון העיקרי בהדגמת טכניקה זו הוא כדי שהמשתמשים במודל החייתי של דלקת הנרתיק יוכלו לעשות זאת בצורה היעילה והאפקטיבית ביותר. ושאלות המפתח שנענות באמצעות הטכניקה הן בתחום דלקת הנרתיק והאקולוגיה ועונות על שאלות מפתח כגון תגובות חיסוניות של מארח, התפלגות תאית, יעילות תרופות, יעילות אימונותרפית, וגם השפעות של חיסון והדגמת הטכניקה. היום אהיה סטודנט לתואר שני במעבדה שלי, ג'ונקו יאנו, להדביק עכבר ב-C albicans שלושה ימים לאחר מתן זריקה של בטא אסטרדיול.

התחל בייצוב העכבר על משטח gRED שטוח כדי שיוכל לאחוז בו. לאחר מכן החזק את בסיס הזנב בשתי אצבעות והרם את הירך כלפי מעלה כך שפתח הנרתיק פונה אליך. הכנס את קצה הפיפטה בעומק של כחמישה מילימטרים לתוך לומן הנרתיק ופיפטה עד 20 מיקרוליטר מתרחיף החיסון.

השלם שלב זה במהירות ובעדינות ככל האפשר כדי למזער את המצוקה בעכבר. לאחר תקופת הדגירה הרצויה, המתת חסד של החיה בהתאם לפרוטוקול של המתקן שלך. ואז בשתי אצבעות, החזק את העכבר כלפי מטה בבסיס הזנב כך שפתח הנרתיק ייחשף בעזרת פיפטה.

הכניסו 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי ללומן הנרתיק, ועם שאיפה ותסיסה חוזרות ונשנות, בצעו שטיפה. אם קצה הפיפטה נסתם בתאים, הוציאו את התאים החוסמים והמשיכו להרוס עם ה-PBS הנותר. אוספים את נוזל השטיפה בצינור מיקרו צנטריפוגה.

לאחר הליך שטיפת הנרתיק, השכיבו את העכבר על גבו והרוויו את אזור המפשעה באתנול 70%. בעזרת זוג מלקחיים מרימים את פתח השתן כלפי מעלה כך שפתח הנרתיק ייחשף. הכנס זוג מלקחיים מעוקלים ללומן הנרתיק ואתר את צוואר הרחם תוך שמירה על אחיזה איתנה עם המלקחיים.

חלץ את צוואר הרחם דרך חלל הנרתיק, כרת את הנרתיק בבסיס פתח הנרתיק ולאחר מכן הסר את צוואר הרחם מהנרתיק בעזרת מספריים כירורגיים. מכיוון שרקמת הנרתיק מפותלת, הפוך אותה כדי לשמור על הכיוון המקורי או פתח אותה לסדין על ידי ביצוע חתך רוחבי לכריתת בלוטת המותניים כשהחיה על גבה. להרוות את הבטן באתנול 70%.

בצע חתך רוחבי החל מהבטן התחתונה ועד החזה וחשוף את האיברים הפנימיים באמצעות זוג מלקחיים בשתי הידיים. הזיזו את המעיים כלפי מעלה כך שכלי הדם המרכזיים יהיו גלויים. אתר את הווריד הנבוב התחתון ואת אבי העורקים הבטני.

ניתן לזהות זוג בלוטות לימפה מותניות בסמוך לאבי העורקים הבטני הממוקם בערך באמצע הדרך בין מקור עורקי הכליה לעורקי הכסל הנפוצים. ניתן להבחין בין בלוטות לימפה אלו לבין רקמת שומן על ידי המרקם האלסטי שלהן והן בהירות ואטומות יותר בצבע בהשוואה לרקמת השומן. הם גם גדולים יותר באופן ניכר בבעלי חיים נגועים בהשוואה לבעלי חיים לא מחוסנים.

בעלי חיים כרתו את בלוטות הלימפה על ידי הנחת מיקרו מלקחיים מתחת לצומת ואז משכו בעדינות כלפי מעלה כדי להפריד אותן מהרקמה שמסביב. לאחר כריתת הרקמה, העבירו את בלוטות הלימפה לרשת תיל סטרילית המונחת בתוך צלחת פטרי מזכוכית סטרילית המכילה כ-10 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק. כדי לבודד תאי לימפה יש לעיין בפרוטוקול הכתוב.

השברים התאיים של נוזל שטיפת הנרתיק מעכברים שחוסנו לפחות ארבעה ימים קודם לכן מורכבים בדרך כלל מתאי אפיתל קנדידה וחדירות תאיות כפי שמוצג כאן במיקרוסקופ הר רטוב. ניתן לזהות קנדידה על ידי נוכחות של PHA כמו גם שמרים. כאן מוכתמים תכשירי מריחה של נוזל שטיפת הנרתיק.

שימוש בטכניקת מריחת פאפ לבחינת תאי אפיתל ולויקוציטים חודרים שהתאים העיקריים שלהם הם נויטרופילים, כפי שניתן לזהות על ידי אונות הטרקליר. מעט מאוד נויטרופילים, אם בכלל, מתגלים בעכברים לא מחוסנים. איור זה מציג דוגמה לעומס פטרייתי בנרתיק.

נוזל שטיפת הנרתיק נאסף בנקודות זמן ספציפיות ומתורבת לספירת CFU. בדוגמה זו, הנוזל נאסף ביום החמישי לאחר החיסון, באופן סדרתי, מדולל בציפוי והודגר במשך 48 שעות. לאחר מכן סופרים מושבות ומחושב עומס פטרייתי בנרתיק קולוניזציה בנרתיק או זיהום בקנדידה נמשך שבועות בעכברים מחוסנים שטופלו באסטרוגן.

בעוד שקנדידה לא מצליחה לבסס קולוניזציה נרתיקית בעכברים מחוסנים שלא טופלו באסטרוגן, עכברים לא מחוסנים שטופלו באסטרוגן נשארים שליליים לקנדידה לאורך כל הזמן. בנוסף, שטיפות נרתיקיות יכולות להתבצע פעם אחת בעכברים נפרדים בכל נקודת זמן או לאורך באותם עכברים בהרדמה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לרסן את בעלי החיים בצורה מאובטחת כדי למנוע טראומה לנרתיק, ואנא הקדישו את הזמן הדרוש לשטיפה יסודית כדי להשיג עומס פטרייתי נרתיקי מדויק בעת חילוץ רקמות הנרתיק.

השתמש ב-PBS עדיין כדי למנוע מהם להתייבש, ואנא היזהר לא לפגוע בוורידים ובעורקים הראשיים בעת הסרת בלוטות הלימפה ובזמן עיבוד תאי בלוטות הלימפה, שמור אותם על קרח או בארבע מעלות כדי לשמור על כדאיות התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במודל העכבר הניסיוני של קנדידה וגיניטיס כדי לכמת באופן שחזורי את העומס הפטרייתי בנרתיק ולכרות רקמות נרתיקיות או לימפואידיות לבדיקות אימונולוגיות או היסטולוגיות ספציפיות.