Name: באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את גין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: חקור שיטת גנטיקה הפוכה ליצירת מוטנטים של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 עם מוטציות בחלבון NSs. השיטה מאפשרת אפיון תכונות לפיתוח חיסונים מוחלשים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מספר גרנט 5 U54 AI057156-07 באמצעות המרכז האזורי המערבי של אקסלנס (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 מ - המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, וכן מימון פנימית מהמרכז Sealy לפיתוח חיסון באוניברסיטת סניף טקסס רפואי.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

הפוך גנטיקה מערכות RVFV פותחו על ידי מספר קבוצות על ידי ניצול האמרגן T7 2,4,5 או עכבר 3 או 4 pol האדם, אני מקדם. בכתב היד הזה, אנו מתארים פרוטוקול ליצור רקומביננטי MP-12 RVFV זנים באמצעות BHK/T7-9 תאים 15 כי פולימראז ביציבות להביע T7-RNA. את היעילות של התאוששות ויראלי מגוונות בהתאם למצבו של BHK/T7-9 תאים, כמות פלסמידים, מספר תאים transfected וכן הלאה. אנחנו תמיד להגביר את הנגיף P0 ב Vero E6 תאים כדי להשיג גבוה וירוס מניות titer לניסויים....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> בינוני Essential Minimum (ממ) אלפא </td><td> Invitrogen </td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco של מדיום שונה חיוני מינימום </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> השתנה הנשר בינוני (ממ 2x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Cellgro </td><td> 30-240-CR </td><td></td></tr><tr><td> Tryptose פוספט מרק </td><td> MP biomedicals </td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td> נובל אגר </td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> Opti-ממ </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td> מכסה הדוק תרסיס </td><td> Eppendorf </td><td> C-2223-25 </td><td></td></tr><tr><td> 0.33% פתרון אדום נייטרלי </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> N2889-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT MEF תאים </td><td> InvivoGen </td><td> MEF-c57wt </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> InvivoGen </td><td> Ant-BL-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> InvivoGen </td><td> נמלים Zn-1 </td><td></td></tr><tr><td> QUANTI-Blue </td><td> InvivoGen </td><td> נציג-qb1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9 תאים 15 </td><td> גיפא באוניברסיטה, יפן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vero E6 תאים </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td><td></td></tr></table>

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין nss של וירוס קדחת עמק השבר mp-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

בקעת חום וירוס (RVFV), מה שגורם קדחת מדממת, הפרעות נוירולוגיות או לעיוורון אצל בני אדם, שיעור ההפלות גבוה למום עוברי מעלי גירה 1, סווגה HHS / USDA חפיפה סוכן לבחור קבוצת סיכון 3 הפתוגן. היא שייכת Phlebovirus הסוג של Bunyaviridae המשפחה הוא אחד מחברי ארסית ביותר של משפחה זו. מספר מערכות גנטיקה הפוכה עבור זן MP-12 חיסון RVFV 2,3 וכן wild-type זנים RVFV 4-6, כולל ZH548 ו ZH501, פותחו מאז 2006. המתח-12 מגה פיקסל (שהיא קבוצת סיכון 2 הפתוגן ואת סוכן לא לבחור) הוא נחלש מאוד על ידי מוטציות במספר שלה-M ו-L-מגזרים, אך עדיין נושאת ארסית S-RNA קטע 3, אשר מקודד ארסיות תפקודית , גורם NSS. RMP12-C13type (C13type) נושאת 69% ב-מסגרת מחיקה של NSS ORF חסר כל הפונקציות NSS ידוע, ואילו זה משכפל effic כמוient כפי שעושה MP-12 VeroE6 תאים חסר סוג אני IFN. NSS משרה כיבוי שעתוק של המארח כולל אינטרפרון (IFN)-beta-mRNA 7,8 ומקדם השפלה של קינאז RNA תלויי פעמיים תקועים חלבון (PKR) ברמה שלאחר translational. 9,10 IFN-beta הוא transcriptionally שהוגברו על ידי גורם אינטרפרון רגולטוריות 3 (IRF-3), NF-kB ו activator חלבון-1 (AP-1), ואת הקישור של IFN-ביתא IFN-alpha/beta קולטן (IFNAR) מגרה את שעתוק של IFN-alpha גנים או גנים אינטרפרון גירה אחרים (ISGs) 11, אשר גורם לפעילות אנטי המארח, ואילו תעתיק מארח כולל דיכוי גנים IFN-ביתא על ידי NSS מונע upregulations הגן של ISGs אלה בתגובה שכפול נגיפי למרות IRF-3, NF-kB ו activator חלבון-1 (AP-1) יכול להיות מופעל על ידי RVFV7. . לפיכך, NSS היא יעד מצוין נוסף להחליש MP-12, כדי לשפר את התגובה החיסונית המולדת מארח ידי ביטול פונקציית IFN-beta דיכוי. כאןאנו מתארים פרוטוקול להפקת רקומביננטי MP-12-NSS קידוד מוטציה, ולספק דוגמה של שיטת ההקרנה לזהות מוטציות NSS חסרה הפונקציה לדכא IFN-beta סינתזת mRNA. בנוסף תפקיד חיוני שלה חסינות מולדת, סוג אני IFN חשוב ההבשלה של תאים דנדריטים ואת אינדוקציה של תגובה חיסונית אדפטיבית 12-14. לפיכך, NSS גרימת מוטציות מסוג אני IFN הם נחלש עוד יותר, אבל באותו זמן הם יעילים יותר בתגובות המערכת החיסונית מארח מגרה מאשר wild-type MP-12, מה שהופך אותם למועמדים אידיאליים עבור גישות החיסון.

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

נגיף חום עמק הסדיר (RVFV), הגורם לחום המגורי, להפרעות נוירולוגיות או לעיוורון בבני אדם, ושיעור גבוה של הפלות ומיתות עובריות...

פרוצדורה זו יוצרת נגיף מחלה של עמק הריפט (rift valley fever virus), זן MP 12 רקומביננטי המקודד ל-NSS מוטג, באמצעות גנטיקה הפוכה, ומטרתה לאפיין את הפנוטיפים לצורך פיתוח חיסון. ראשית, באמצעות מערכת טרנספקציה בתאי Bhk T seven nine, המבטאים באופן יציב T seven RNA polymerase, שחזר את המוטנטים של זן MP 12 הרקומביננטי, לאחר מכן הגבר את המוטנט של זן MP 12 הרקומביננטי המשוחזר בתאי Vero E six ובצע טיטרציה למוטנטים של MP 12 שהוגברו באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay). השלב האחרון של הפרוצדורה הוא סריקה לאיתור היעדר דיכוי של interferon, alpha או beta על ידי חלבוני NS מוטגנים.בסופו של דבר, התוצאות יכולות לסייע בהכנת מועמדים לחיסון חי מוחלש עבור Rift Valley Fever באמצעות מערכת גנטיקה הפוכה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הכנסה אקראית של מוטציות לגנום הוויראלי באמצעות חנקן כימי או מעברים סדרתיים, הוא היכולת להכניס מוטציה מוגדרת לגנום הוויראלי באמצעות מערכת גנית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום חיסוני ה-valley fever, כגון המשמעות של גורם ה-ence המרכזי NSS באימונוגניות של מועמדים לחיסון.באופן כללי, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקשיים, שכן עבור נגיף hantavirus, בדומה לנגיפים אחרים, נדרשת טכניקה מותאמת עבור חסימת מטרות והדמיה של החסימה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי השחזור הנגיפי וההידרציה קשה ללמוד, כיוון שפרוטוקול שלב-אחרי-שלב עבור שיטה זו לא פורסם. באמצעות צלחים של 6 cm, הניחו תאי כליות של חולדה צעירה מסוג T79, המבטאים באופן יציב T7 RNA polymerase, והכניסו לאינקובטור כאשר התאיים הגיעו ל-70% עד 80% confluence. החליפו את המצע ל-MEM alpha מלא ללא hygromycin B. בתוך שעה, התחילו בתהליך הטרנספקציה לשחזור של נגיף hantavirus.צור סט אחד של פלסמידים המקודדים ל-RNAs גנומיים ויראליים לצורך ביטוי RNA ויראלי באורך מלא, וסט שני המקודד למסגרות קריאה פתוחות (ORFs) של גנים ויראליים לצורך ביטוי חלבון ויראלי. כעת הוסף 30 µL של transit LT one ל-385 µL של Optum במבחנה של 1.5 mL. ערבב באמצעות וורטקס לזמן קצר והדגר למשך חמש דקות.בטמפרטורת החדר, הוסיפו באיטיות את הליפוזומים שהתקבלו למערכי הפלסמידים בריכוז 10 microgram שערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג, והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לתאי bhk T seven nine בטיפות, והדגירו למשך 24 שעות. החליפו את העל-נוזל (supernatant) של התרבית ב-MEM alpha מלא והדגירו למשך ארבעה ימים נוספים. אספו את העל-נוזל של התרבית למבחנה של 50 milliliter והסירו פסדורי תאים באמצעות צנטריפוגה.כעת העבירו את התו층 לאنبובות קריו בנפח 5 mL עם פקק הברגה ואחסנו מלאי נגיף P0 זה בטמפרטורה של 80- °C כדי להקל על ניסויים המשכיים. להגברה של נגיף P0 בתאים נטולי גנים של interferon alpha ו-beta, גדלו תרבועות Vero E6 ב-DMEM מלא עד להגעה ל-80% התמזגות (confluency), החליפו את המצע בנגיף P0 המדולל והדגרירו למשך שעה.הוציאו את האינוקולום וטפחו ב-10 milliliters של DMEM מלא למשך שלושה עד ארבעה ימים, עד להופעת האפקט הציטופתי של תאי Vero E6. אספו את העילאי כפי שתואר קודם לכן והגדירו את הדגימות כ-E6 P1. השתמשו בלוחיות בעלות שישה בארות כדי לגדל תאי Vero E6 עד להגעה ל-80% התקבצות (confluency) ב-DMEM מלא. שאבו את המצע מתאי ה-Vero E6 והוסיפו 400 microliters של דילולים סדרתיים פי-10 של תכשיר נגיף E6 P1. דגרו למשך שעה אחת.בינתיים, הכינו שתי מבחנות בנפח 15 מיליליטר עבור שכבת האגר. מבחנה A תכיל שבעה מיליליטר של 1.2% noble agar במים, ומבחנה B תכיל שבעה מיליליטר של 2x complete MEM ו-10% trip dose phosphate broth. לאחר 15 דקות במכשירי החממה (water baths), שפכו את תכולת מבחנה B לתוך מבחנה A ועזרו בפיפט כדי לערבב אותן יחד. החליפו את התוך הנגיפי בשני מיליליטר לבאר של תערובת ביחס של 1:1 של מבחנות A ו-B. המשיכו בתרבית התאים למשך שלושה עד ארבעה ימים.הכינו את שכבת ה-agar overlay על ידי הוספת 1.2% noble agar, כמות כפולה של complete MEM ו-neutral red למבחנה A ולמבחנה B, ומבחנה שלישית המסומנת כ-neutral red. הניחו את מבחנה A במקלח מים בטמפרטורה של 42 °C ואת שתי המבחנות האחרות במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, ערבבו יחד שבעה מיליליטרים ממבחנה A, שבעה מיליליטרים ממבחנה B ו-0.5 מיליליטר של aliquots של neutral red. העבירו שני מיליליטרים מהתערובת לכל באער של פלטת שש באערים והדגירו את הפלטה למשך הלילה. כעת קבעו את מספר יחידות ה-platforming למבליליטר. פיברובלסטים עובריים של עכבר C57 wild type מקודדים לגן embryonic alkaline phosphatase מופרש, הניתן להשראה על ידי NF kappa B ו-IRF 3 או 7.כאן אנו בוחנים פעילות seep המושרה על ידי תגובות חיסוניות מולדות. הדבקו תאים שאינם תופסים את כל שטח הפני השטח (sub confluent) בלוחיות 12 בארות באמצעות MP 12 רקומביננטי המקודד למוטציות ב-NS או MP 12 כביקורת, והדגרימו למשך שעה אחת. הסירו את התמיס ההדבקה, הוסיפו מילליטר אחד של DMEM מלא לכל בארה והדגרימו למשך 14 שעות. אספו את העל-נוזל (supernatants) מהתרבית עבור בדיקת seep; לכל בארה בלוחית 96 בארות הוסיפו 200 µL של quantum blue והוסיפו 50 µL מכל דגימה. אטמו והדגרימו את הלוחית בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.מדוד את ה-OD ב-650 ננומטרים באמצעות קורא לוחות. לנגיף חום עמק הריפט (Rift Valley fever virus) יש גנום RNA בעל חושן שלילי תלת-חלקי המכונה מקטעים SM ו-L בהשוואה ל-NSS של זן MP 12. מסגרת הקריאה הפתוחה מסוג C 13 קטועה ב-69%. בדרך כלל, מערכת הגנטיקה ההפוכה מייצרת נגיפי MP 12 רקומביננטיים חיוניים עם טיטרים הגבוהים מ-1×10⁶ PFU למיליליטר של נגיף מסוג C 13.תאי lacking N'S יצרו פלאקים עכורים וגדולים, בעוד ש-MP 12 יצר פלאקים שקופים בגדלים שונים בהשוואה לתאים שעברו זיהום דמה (mock infected) לאחר 14 שעות מהזיהום. תאי C 57 wild type meth שזוהמו ב-MP 12 אינם מגבירים את רמת ה-seep בתרבית.לעומת זאת, זיהום מסוג C 13 משרה רמה מוגברת של seep ב-14 שעות לאחר הזיהום. בדיקות Northern blot באמצעות גשש RNA ספציפי ל-mRNA של ISG 56 בעכברים מאשרות את העלייתו של mRNA של ISG 56 בהיעדר ביטוי של N'S. ביצוע פרוצדורה זו כשיטה לחיסון עכברים ובדיקת נוגדנים מנטרלים יכולים לבחון שאלות כגון האימונוגניות של מוטציית NSS. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום של Valley Fever לחקור את תפקודי הגנים הבלתי מבניים בתאים ובבעלי חיים נגועים.זכרו כי עבודה עם נגיפים זיהומיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כדי למנוע שאיפה של אירוסולים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה של אופן השחזור והתיחור של זני MP 12 רקומביננטיים, וכיצד לסנן מוטציות NSS חסרות פונקציונליות של דיכוי interferon alpha beta.

using-reverse-genetics-to-manipulate-nss-gene-rift-valley-fever-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Noroviruses הם אחד הגורמים העיקריים של הקיבה והמעיים עדיין בטכניקות מולקולריות לאפיון שלהם עדיין חדש יחסית. כאן אנו מדווחים על שתי גישות שונות גנטיקה הפוכה להתאוששות יעילה של norovirus Murine (MNV), הנציג היחיד של סוג זה אשר ניתן מופצות על תרבית תאים.

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

וירוס Vaccinia (VV) כבר בשימוש נרחב במחקר ביו ושיפור בריאות האדם. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה, מאוד לערוך את הגנום VV באמצעות מערכת CRISPR-Cas9.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

ההרפס של תרנגולי הודו (גבוהה) משמש כפלטפורמה וקטור לדור של recombinant חיסונים נגד מספר מחלות העופות. מאמר זה מתאר גישה פשוטה ומהירה לדור של recombinant חיסונים HVT-הווקטורי שימוש משולב NHEJ-CRISPR/Cas9 ומערכת Cre-לקס.

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

זוהי שיטה להפקת וירוסים "להוריד" רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

הפרוטוקול מתאר שיטה להחדרת מגוון גנטי נשלט בגנום נגיף הפטיטיס C על ידי שילוב סינתזת RNA מוטנטית באורך מלא באמצעות PCR נוטה לשגיאות וגנטיקה הפוכה. השיטה מספקת מודל לבחירת פנוטיפ וניתן להשתמש בה עבור גנומים ארוכים של 10 קילובייט של נגיף RNA בעל חוש חיובי.

גנטיקה הפוכה כדי להנדס וריאנטים של נגיף RNA בעל חוש חיובי

חקור שיטת גנטיקה הפוכה ליצירת מוטנטים של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 עם מוטציות בחלבון NSs. השיטה מאפשרת אפיון תכונות לפיתוח חיסונים מוחלשים חיים.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג'ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

גלה סרטונים נוספים