שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic
10 בדצמבר 2011
Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.
שלום, אני ג'רזי. היי, שמי שאבי ושנינו חוקרי פוסט-דוקטורט באימפריאל קולג' בלונדון, עובדים עם פרופסור אנדרו די מלו וד"ר ג'וש דל בפלטפורמות טיפות מיקרופלואידיות. פלטפורמות מיקרופלואידיות מבוססות טיפות מבטיחות מועמדים לניסויים בתפוקה גבוהה יותר מכיוון שניתן לייצר אותן בנפחים מוגדרים במדויק גבוהים מאוד והתחרויות שלהן, תדירות הייצור יכולה להיות גבוהה עד כמה קילוגרמים.
יתר על כן, מכיוון שניתן לעטוף את אזור העניין בתאים מאוחר יותר כמו כמה ליטר, ניתן לבטל גם ערב-דיבור וגם פיזור, וניתן לתזמן תהליכים אנליטיים בדיוק רב יותר. בקבוצה שלנו, כבר הטמענו בהצלחה פלטפורמות מיקרו טיפות להרבה יישומים. לדוגמה, תגובת שרשרת פולימראז, סינתזת ננו-חלקיקים ובדיקת התא המולקולרי היחיד.
יש לחלץ, לרתום ולנצל ביעילות את כמויות המידע הגדולות שנוצרות במערכות אלה. מבחינה זו, שיטת הזיהוי הנבחרת צריכה להיות נכונה, לספק רגישות גבוהה וגבולות זיהוי נמוכים, להיות ישימה למגוון מינים מולקולריים, להיות לא הרסנית ולהיות מסוגלת להשתלב עם מכשירים מיקרופלואידיים בצורה קלה. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו חבילה של כלים ופרוטוקולים ניסיוניים המאפשרים חילוץ כמויות גדולות של מידע פיזיקלי מסביבות בנפח קטן, והם ישימים לניתוח של מגוון רחב של טורים פיזיקליים, כימיים וביולוגיים.
בפרוטוקול זה נציג שיטות המיושמות לאיתור תאים בודדים ומיפוי תהליכי ערבוב בדרופבוקס. שבבים מיקרופלואידיים מיוצרים באופן מסורתי ב-PGMS פולי דימתיל סלואן באמצעות שיטות פוטוליתוגרפיה. תהליך זה צריך להתבצע במתקן חדר נקי כדי להשיג תעלות מיקרופלואידיות Spinco, SU 8 50 על אפייה רכה של פרוסת סיליקון על פלטה חמה ב-65 מעלות ו-95 מעלות כדי לאדות את הממס ולצפוף את הסרט לאחר התקררות, לחשוף את ה-SU שמונה, להתנגד לקרינת UV מתחת למסכה המתאימה, ואז אופים את הוופל בחום של 65 מעלות ו -95 מעלות לאחר הקירור.
פתח את האזורים הלא חשופים באמצעות תמיסת הפיתוח המתאימה תוך כדי ערבוב. השתמש בממס EC טרי כדי לשטוף את הוופל ולאחר מכן לייבש אותו מתחת לגז כדי ליצור משטח נקי. טפלו בפרוסה בשטיפות הקסאן ומתנול.
כמו כן, כדי להשלים את תהליך הייצור הראשי, אידוי חומר תופס על פני השטח בייבוש למשך 40 דקות. כדי ליצור מצעים מיקרופלואידיים מובנים, אנו מערבבים את S guard 1 8 4 ביחס של 10 לאחד של שרף צולב ומושכים אותו מעל המאסטר. הסר את זה בייבוש ורפא את המכשיר ב-65 מעלות.
חותכים את ה- PDMS הנרפא ומקלפים אותו מהמאסטר. צור חורי גישה לצינורות נוזליים באמצעות אגרוף ביופסיה. רפאו שכבה נוספת של PDMS למשך 20 דקות ב-65 מעלות.
מניחים את השכבה העליונה המוכנה על השכבה התחתונה ומרפאים לילה בחום של 65 מעלות. קולפים את הצ'יפס מצלחת הפטרי וחותכים לקוביות. לאחר ייצור השבבים, הם מוכנים לשימוש על ידי החדרת הפתרונות המעניינים.
מלאו את המזרקים בתמיסות הנדרשות, וודאו שלא יישארו בועות אוויר באף חלק של הצינור. ליצירת טיפות משתמשים בשני שלבים. השלב המפוזר המימי מכיל את הריאגנטים המעניינים.
שלב השמן משמש כצינור מתאים לשלב הרציף באותו קוטר פנימי כמו קצות מחט המזרק בקצה אחד למחטים, מרכיב את המזרקים על משאבת מזרק ומגדיר את קצב זרימת ההזרקה הרצוי. עבור כל שלב, מומלץ יחס מינימלי של קצבי זרימה מימיים של שמן אחד כדי למנוע הרטבה של ה-PDMS בשלב הימי, מה שיוביל להיווצרות טיפות לא יציבות. חבר את הקצוות האחרים של הצינור ישירות לחורים המנוקבים במצע ה-PDMS.
עבור פתרונות מורכבים יותר, ניתן ליישם גם סיליקה, יציאות נימיות או מחברים. חבר את יציאת היציאה של השבב לצינור והפנה לקולט לאיסוף פסולת או עיבוד ניתוח נוסף. לאחר הגדרה זו, ישנן שתי תצורות עיקריות של מיקרו-ערוצים ליצירת מיקוד זרימת טיפות או פורמט צומת T כתוצאה מהכוחות העצומים הנובעים משימוש בגיאומטריות אלה כדי להפגיש את שני הנוזלים הקבילים ואת הנימים הבאים המתפתחים בממשק.
טיפות מפזרות אחת קטנות כמו כמה פמטוליטרים נוצרות באופן ספונטני. לאחר יצירת הטיפות, ניתן לחקור אותן באמצעות הגדרה אופטית. המערכת האופטית מוגדרת לפי הפרוטוקול הבא.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם יכולת מיקום תת-מיקרונית אוטומטית ולייזר הפועל באורך גל התואם את ספיגת נפילות הפלואור המעורבות. כדי לרגש אותם, השתמש בלייזר דופק הפועל בקצבי חזרה של כמה מגה-הרץ להדמיה פלואורסצנטית לכל החיים. ניסויי ליחה משתמשים במראות היגוי קרן ואופטיקה כדי לשלוט בגובה האלומה כמו גם בכיוון האלומה.
השתמש במראה דיכרואית כדי לשקף את קרן הלייזר לעדשת האובייקטיב. אם משתמשים בשני לייזרים בו זמנית, ניתן להתקין מראה diic כפולה. כדי לאפשר השתקפות של שתי קרני הלייזר, השתמש במטרת מיקרוסקופ NA עם צמצם מספרי גבוה מתוקן אינסוף כדי להביא את אור הלייזר למיקוד הדוק בתוך תעלה מיקרופלואידית.
אסוף פלואורסצנטיות הנפלטת מהדגימה בתוך התעלה המיקרופלואידית, תוך שימוש באותה מטרת NA גבוהה ומועברת דרך אותה מראה דיכרואית. הסר כל אור עירור שיורי באמצעות מסנן פליטת פס יחיד או כפול. מקד את פליטת הקרינה על חור סיכה של 75 מיקרומטר.
שימוש בעדשת פלאנו קמורה. מקם את חור הסיכה במישור הקונפוקלי של מטרת המיקרוסקופ. השתמש במראה דיכרואית אחרת כדי לפצל את האות הפלואורסצנטי לשני גלאים.
סנן את הקרינה המשתקפת על ידי המראה הדיכרואית עם מסנן פליטה ומקד אותה עם עדשה קמורה פשוטה על הגלאי הראשון. עבור ניסויים הכוללים פלואור אדום משני, סנן את הקרינה המועברת על ידי מראה ה-diic עם מסנן פליטה אחר, ולאחר מכן מקד אותה עם עדשת פלאנו קמורה נוספת על הגלאי השני. השתמש בדיודות צילום מפולת לזיהוי פוטונים פלואורסצנטיים.
לרכישת נתוני הקרינה, חבר את האות האלקטרוני מגלאי דיודות הצילום של מפולת להתקן DAQ רב תכליתי לרישום נתונים הפועל במחשב אישי. עבור ניסויי ליחה, השתמש בלייזר דופק וחבר את הגלאים לכרטיס מחשב TCS של ספירת פוטונים בודדים בקורלציה בזמן הפועל על מחשב נפרד. כרטיס זה מאפשר לקבל את נתוני אורך החיים הפלואורסצנטי.
שימוש במתודולוגיית TCS PC. כל פוטון פלואורסצנטי שזוהה מתואם לפולס לייזר תקרית ולכן לכל פוטון פלואורסצנטי שנפלט מוקצה זמן עיכוב. ניתן להתאים נתונים אלה לעקומת דעיכה מעריכית אחת או רב-מעריכית כדי לקבל הערכה של קצב הקרינה של הפלואורופורים.
כיום אנו יודעים שתאים הם הטרוגניים מאוד הן מבחינה ביולוגית, פיזיקלית והן מבחינה כימית. לכן, באופן אידיאלי, עלינו לנתח כל תא בכל פעם. עם זאת, יש לבצע את הבדיקות עם תפוקה גבוהה יותר כדי שנוכל לאסוף מספיק מידע כמותי כדי להגיע למסקנה אמינה ומשמעותית.
כאן יש לנו דוגמה לתאי אי קולי עוטפים בטיפה אחת, כך שניתן לבצע כפי שהוא. השתמשו בזן אי קולי טופ 10 שעבר תרבית בן לילה. על מנת לזהות את כדאיות התאים, השתמש ב-cyto nine ו-propidium iodide.
שני הצבעים הם צבעי DNA שאוספים ועוצמת הקרינה שלהם גדלה ביותר מפי 20. עם הקישור ל-DNA, cyto nine הוא צבע פלואורסצנטי ירוק שהוא חדיר לממברנה ופרופידיום יודיד. זהו צבע פלואורסצנטי אדום, שהוא אטום לממברנה.
לפיכך, תאים חיים זוהרים בירוק בעוד שתאים מתים מציגים פליטות ירוקות ואדומות כאחד. כאן אנו יכולים לראות יצירת טיפות ואנקפסולציה של תא בודד עם צומת T. הסרטון הזה הוקלט במצלמה במהירות גבוהה, אך ניתן לייצר טיפות בקצב של אלפים בשנייה.
בעת עטיפת תאים, יש לוודא שתרבית התאים מדוללת כך שיהיו פחות תאים מאשר טיפות שנוצרות, שהתאים מונעים שקיעה, מה שיכול להתרחש במזרק או בצינור. השתמש במוט ערבוב מגנטי בתוך המזרק כדי לשמור על התאים מפוזרים באופן שווה בתמיסה. השתמש בצינורות דקים מאוד, 50 מיקרומטר כדי לחבר את המזרק לשבב.
זה מבטיח קצב זרימה מהיר בתוך הצינור ולכן מונע מהתאים לשקוע. להלן הדוגמאות האופייניות לספירת תמונות כפונקציה של זמן עבור ניסויים מבוססי תאים. למפות תהליכי ערבוב בתוך טיפות.
ניתן ליצור טיפות באמצעות שתי ארבע פלואורו שונות עם אורך חיים שונה. בתוך טיפה זורמת, נוצר שדה זרימה, שבסופו של דבר מערבב את שני הפתרונות שהופרדו במקור כדי לשפר את תהליך הערבוב. ניתן לשנות את הסימטריה של שדה הזרימה באמצעות תעלות מפותלות.
על מנת לחקור את הטיפות, מקד את נפח הבדיקה האופטית במחצית גובה המיקרו-ערוץ שלאורכו זורמות טיפות, החל מצד אחד של התעלה, בצע כל ניסוי לכל רוחב התעלה. במרווחים של מיקרומטר אחד. יישם אלגוריתם כדי להבדיל בין התפרצויות בודדות הקשורות לטיפות מרקע הרעש של שלב השמן, ולקבוע את משך כל התפרצות.
יישם אלגוריתם שני כדי לחלץ את ערכי זמן העיכוב והעוצמה לאורך כל טיפה ברוחב המסוים שבו בוצע הניסוי. לאחר מכן השתמש באלגוריתם MLE של אומדן סבירות מקסימלית כדי להעריך את אורך חיי הקרינה של כל טיפה בניסוי. חישוב ממוצע ערכי אורך החיים של כל הטיפות בניסוי מפחית את השגיאה הסופית של חישוב ה-MLE.
ככל שנבדקו יותר טיפות, כך השגיאה קטנה יותר לאחר שהתקבל מסלול חיים שלם. עבור כל רוחב, שלב את כל המסלולים במפה דו-ממדית. מכיוון שכל ערך אורך חיים קשור לתערובת מסוימת של שתי ארבע הצומחים, ניתן להשיג מפת ריכוז או ערבוב.
תיארנו את הייצור של מכשיר מיקרו ומערך ניסיוני ופרוטוקולים נלווים להיווצרות מיקרו טיפות ואנקפסולציה של האזור והזיהוי האופטי של התהליך, הטיפות. שתי הדוגמאות בחרו את הזיהוי של תאים בודדים בטיפות ואת המיפוי של תהליכי הערבוב. בתוך הטיפה הזורמת מייצגים יישומים נפוצים שנחקרים כעת עם מיקרופלואידיקה טיפתית.
כפי שהניסויים המוצגים ממחישים, השימוש בפלטפורמות מיקרופלואידיות טיפתיות מציגות מאפיינים אטרקטיביים מסוימים כגון תפוקה גבוהה גורמת לכליאה מושלמת ושחזור גבוה יותר. כמות המידע הגדולה המיוצרת והמהירות הגבוהה ביותר שבה מידע זה נוצר. DU דרש שימוש בשיטות זיהוי מהירות עם רזולוציה זמנית מרחבית גבוהה ביותר אם רוצים להפיק את מלוא היתרון מפלטפורמות ממוזערות אלה.
במקרה זה, אנו מדגימים שזה אפשרי באמצעות טכניקות ספקטרוסקופיות פלואורוס מדויקות ביותר.
סקירה כללית
מאמר זה דן בשימוש בפלטפורמות מיקרופלואידיקה מבוססות טיפות לניסויים בעלת תפוקה גבוהה. פלטפורמות אלו יכולות לייצר תאים מבודדים בנפח של picoliter בתדרים גבוהים, מה שמאפשר חילוץ וניתוח יעיל של נתונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ניסויים בתפוקה גבוהה
- ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- מיקרופלואידיקה של טיפות מאפשרת בקרה מדויקת על נפחים קטנים.
- ביטול דיבדובי (crosstalk) ופיזור משפרים את הדיוק האנליטי.
- היישומים כוללים PCR, סינתזה של ננו-חלקיקים ובדיקות של תא בודד.
- שילוב עם שיטות זיהוי רגישות הוא חיוני לצורך חילוץ נתונים.
מטרת המחקר
- פיתוח כלים לחילוץ כמויות גדולות של מידע ממערכות מיקרופלואידיות.
- הצגת שיטות לזיהוי תאים בודדים ומיפוי תהליכי ערבוב.
- שיפור הרגישות והישימות של שיטות הזיהוי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור שבבים מיקרופלואידיים באמצעות פוטוליתוגרפיה.
- הפקת טיפות באמצעות גאומטריות של מיקוד זרימה (flow focusing) וצומת-T.
- הסדרה אופטית לבדיקת טיפות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- שימוש בלייזרים עבור הדמיית זמן חיים של פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של טיפות קטנות עד לגודל של מספר פמטוליטרים.
- פותחו שיטות זיהוי בעלות רגישות גבוהה.
- השיטות הדגימו כמיסה ואנליזה יעילים של דגימות.
- נקבעו פרוטוקולים ליישומים שונים במיקרופלואידיקה.
מסקנות
- פלטפורמות מבוססות טיפות יעילות עבור ניתוחים בתפוקה גבוהה.
- שילוב של שיטות זיהוי משפר את יכולות חילוץ הנתונים.
- ניתן להתאים פלטפורמות אלו למגוון רחב של יישומים מדעיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמות מיקרופלואידיקה של טיפות מאפשרות סריקה בתושבה גבוהה באמצעות יצירת תאים בנפח של פיקוליטרים המבטלים דיפוזיה וערבוב (cross-talk), ובכך תומכות בתזמון אנליטי מדויק. יכולת זו מגבירה את רמת הביטחון בחיזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית ומהירה של פרמטרים ביולוגיים וכימיים בקנה מידה רחב. שילוב עם שיטות רגישות לגילוי פלואורסצנציה מספק את הרזולוציה המרחבית והזמנית הדרושה כדי לנצל את המיניאטוריזציה להפחתת סיכונים בתהליכי תיקוף מטרות וזיהוי מובילים (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כליאה של תא בודד והערכת חיוניות באמצעות צבעים המשתלבים ב-DNA.
- ערך תפעולי: מקל על יצירת טיפות בתדר גבוה (בטווח של kHz) לצורך סריקה ניתנת להרחבה של אוכלוסיות תאים הטרוגניות.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד תגובות תאיות בנפחים מוגבלים, ובכך מפחית עמימות מכניסטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק קריאות כמותיות של זמן חיים ועוצמת פלואורסצנציה למיפוי ערבוב מולקולרי וקינטיקה של תגובות בתוך טיפות.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה באמצעות בקרה נפחית מדויקת ומניעת הפסדים עקב ספיחה לדפנות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תומך בזיהוי מרובה (multiplexed) באמצעות עירור על ידי לייזר כפול ופיצול ספקטרלי למדידה סימולטנית של פרמטרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקשר בין סריקה פנוטיפית בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות כליאה הניתנת לשחזור של מערכות ביולוגיות מבוססות טיפות.
- הפחתת סיכונים: מגביר את הביטחון בבחירת המועמדים המובילים על ידי מתן אפשרות לניתוח רזולוציית-זמן של תהליכי ערבוב המשפיעים על יעילות התגובה ועקביות המוצר.
- רציפות: מקל על העברת פרוטוקולי טיפות מותאמים מ되גילוי מוקדם למודלים פרה-קליניים באמצעות ייצור שבבים סטנדרטי וגילוי אופטי.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד (Pipeline)
השיטה ממקמת את עצמה ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), כאשר פלטים כמותיים מבוססי טיפות מספקים מידע לקבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) לפני השקעה בשלב הפרה-קלניקה.
- ביולוגיית גילוי (Discovery Biology): תומכת בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לניתוח תאים בודדים ומיפוי קינטיקה של ערבוב במדורים מבודדים.
- סריקה (Screening): מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות זיהוי פלואורסצנציה ברגישות גבוהה שאינו הרסני, התואם ליצירה תכופה של טיפות.
- אנליזה: מספקת מדידות של זמן חיים ועוצמת פלואורסצנציה המאפשרות לצומים להשוות את התקדמות התגובה ואינטראקציות מולקולריות תחת תנאים מבוקרים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי יצירת נתונים הדירים וכמותיים מדגימות ביולוגיות עטופות, הישימים לאפיון תגובה למינון ורעילות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת פלטפורמה לשימוש חוזר, שבה ניתן להחיל שבבים מיקרופלואידיים והגדרות אופטיות סטנדרטיות על פני פרויקטים מרובים בכימיה, ביולוגיה ומדעי החומרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות רזולוציה של תא בודד ומניעת הפרעות הדדיות (cross-talk) בפורמטים של תפוקה גבוהה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות יצירה מדויקת של טיפות וגילוי אופטי משולב.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות נתונים כמותיים עם רזולוציה קינטית מריאקטורים בנפח פיקוליטר.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מועמדים מובילים באמצעות ניתוח ערבוב וחיוניות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בייצור שבבים מיקרופלואידיים, ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה וכיוון מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- נדרש ציוד הכולל לייזרים פועמים, עדשות בעלות NA גבוה, מראות דיכרואיות, מסנני פליטה וגלאי ספירת פוטון בודד במתאם זמן (TCSPC).
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי יצירת טיפות ומיקום גששים אופטיים לצורך פירוש נתונים עקבי.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת פרוטוקולים בין סוגי תאים, ריאגנטים או גיאומטריות תעלות שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בגישה לחדר נקי עבור ייצור התבנית הראשית ואופטימיזציה קפדנית של קצבי הזרימה כדי למנוע הרטבה של תעלות PDMS על ידי הפאזה המימית.
