שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic
December 10th, 2011
Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.
שלום, אני ג'רזי. היי, שמי שאבי ושנינו חוקרי פוסט-דוקטורט באימפריאל קולג' בלונדון, עובדים עם פרופסור אנדרו די מלו וד"ר ג'וש דל בפלטפורמות טיפות מיקרופלואידיות. פלטפורמות מיקרופלואידיות מבוססות טיפות מבטיחות מועמדים לניסויים בתפוקה גבוהה יותר מכיוון שניתן לייצר אותן בנפחים מוגדרים במדויק גבוהים מאוד והתחרויות שלהן, תדירות הייצור יכולה להיות גבוהה עד כמה קילוגרמים.
יתר על כן, מכיוון שניתן לעטוף את אזור העניין בתאים מאוחר יותר כמו כמה ליטר, ניתן לבטל גם ערב-דיבור וגם פיזור, וניתן לתזמן תהליכים אנליטיים בדיוק רב יותר. בקבוצה שלנו, כבר הטמענו בהצלחה פלטפורמות מיקרו טיפות להרבה יישומים. לדוגמה, תגובת שרשרת פולימראז, סינתזת ננו-חלקיקים ובדיקת התא המולקולרי היחיד.
יש לחלץ, לרתום ולנצל ביעילות את כמויות המידע הגדולות שנוצרות במערכות אלה. מבחינה זו, שיטת הזיהוי הנבחרת צריכה להיות נכונה, לספק רגישות גבוהה וגבולות זיהוי נמוכים, להיות ישימה למגוון מינים מולקולריים, להיות לא הרסנית ולהיות מסוגלת להשתלב עם מכשירים מיקרופלואידיים בצורה קלה. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו חבילה של כלים ופרוטוקולים ניסיוניים המאפשרים חילוץ כמויות גדולות של מידע פיזיקלי מסביבות בנפח קטן, והם ישימים לניתוח של מגוון רחב של טורים פיזיקליים, כימיים וביולוגיים.
בפרוטוקול זה נציג שיטות המיושמות לאיתור תאים בודדים ומיפוי תהליכי ערבוב בדרופבוקס. שבבים מיקרופלואידיים מיוצרים באופן מסורתי ב-PGMS פולי דימתיל סלואן באמצעות שיטות פוטוליתוגרפיה. תהליך זה צריך להתבצע במתקן חדר נקי כדי להשיג תעלות מיקרופלואידיות Spinco, SU 8 50 על אפייה רכה של פרוסת סיליקון על פלטה חמה ב-65 מעלות ו-95 מעלות כדי לאדות את הממס ולצפוף את הסרט לאחר התקררות, לחשוף את ה-SU שמונה, להתנגד לקרינת UV מתחת למסכה המתאימה, ואז אופים את הוופל בחום של 65 מעלות ו -95 מעלות לאחר הקירור.
פתח את האזורים הלא חשופים באמצעות תמיסת הפיתוח המתאימה תוך כדי ערבוב. השתמש בממס EC טרי כדי לשטוף את הוופל ולאחר מכן לייבש אותו מתחת לגז כדי ליצור משטח נקי. טפלו בפרוסה בשטיפות הקסאן ומתנול.
כמו כן, כדי להשלים את תהליך הייצור הראשי, אידוי חומר תופס על פני השטח בייבוש למשך 40 דקות. כדי ליצור מצעים מיקרופלואידיים מובנים, אנו מערבבים את S guard 1 8 4 ביחס של 10 לאחד של שרף צולב ומושכים אותו מעל המאסטר. הסר את זה בייבוש ורפא את המכשיר ב-65 מעלות.
חותכים את ה- PDMS הנרפא ומקלפים אותו מהמאסטר. צור חורי גישה לצינורות נוזליים באמצעות אגרוף ביופסיה. רפאו שכבה נוספת של PDMS למשך 20 דקות ב-65 מעלות.
מניחים את השכבה העליונה המוכנה על השכבה התחתונה ומרפאים לילה בחום של 65 מעלות. קולפים את הצ'יפס מצלחת הפטרי וחותכים לקוביות. לאחר ייצור השבבים, הם מוכנים לשימוש על ידי החדרת הפתרונות המעניינים.
מלאו את המזרקים בתמיסות הנדרשות, וודאו שלא יישארו בועות אוויר באף חלק של הצינור. ליצירת טיפות משתמשים בשני שלבים. השלב המפוזר המימי מכיל את הריאגנטים המעניינים.
שלב השמן משמש כצינור מתאים לשלב הרציף באותו קוטר פנימי כמו קצות מחט המזרק בקצה אחד למחטים, מרכיב את המזרקים על משאבת מזרק ומגדיר את קצב זרימת ההזרקה הרצוי. עבור כל שלב, מומלץ יחס מינימלי של קצבי זרימה מימיים של שמן אחד כדי למנוע הרטבה של ה-PDMS בשלב הימי, מה שיוביל להיווצרות טיפות לא יציבות. חבר את הקצוות האחרים של הצינור ישירות לחורים המנוקבים במצע ה-PDMS.
עבור פתרונות מורכבים יותר, ניתן ליישם גם סיליקה, יציאות נימיות או מחברים. חבר את יציאת היציאה של השבב לצינור והפנה לקולט לאיסוף פסולת או עיבוד ניתוח נוסף. לאחר הגדרה זו, ישנן שתי תצורות עיקריות של מיקרו-ערוצים ליצירת מיקוד זרימת טיפות או פורמט צומת T כתוצאה מהכוחות העצומים הנובעים משימוש בגיאומטריות אלה כדי להפגיש את שני הנוזלים הקבילים ואת הנימים הבאים המתפתחים בממשק.
טיפות מפזרות אחת קטנות כמו כמה פמטוליטרים נוצרות באופן ספונטני. לאחר יצירת הטיפות, ניתן לחקור אותן באמצעות הגדרה אופטית. המערכת האופטית מוגדרת לפי הפרוטוקול הבא.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם יכולת מיקום תת-מיקרונית אוטומטית ולייזר הפועל באורך גל התואם את ספיגת נפילות הפלואור המעורבות. כדי לרגש אותם, השתמש בלייזר דופק הפועל בקצבי חזרה של כמה מגה-הרץ להדמיה פלואורסצנטית לכל החיים. ניסויי ליחה משתמשים במראות היגוי קרן ואופטיקה כדי לשלוט בגובה האלומה כמו גם בכיוון האלומה.
השתמש במראה דיכרואית כדי לשקף את קרן הלייזר לעדשת האובייקטיב. אם משתמשים בשני לייזרים בו זמנית, ניתן להתקין מראה diic כפולה. כדי לאפשר השתקפות של שתי קרני הלייזר, השתמש במטרת מיקרוסקופ NA עם צמצם מספרי גבוה מתוקן אינסוף כדי להביא את אור הלייזר למיקוד הדוק בתוך תעלה מיקרופלואידית.
אסוף פלואורסצנטיות הנפלטת מהדגימה בתוך התעלה המיקרופלואידית, תוך שימוש באותה מטרת NA גבוהה ומועברת דרך אותה מראה דיכרואית. הסר כל אור עירור שיורי באמצעות מסנן פליטת פס יחיד או כפול. מקד את פליטת הקרינה על חור סיכה של 75 מיקרומטר.
שימוש בעדשת פלאנו קמורה. מקם את חור הסיכה במישור הקונפוקלי של מטרת המיקרוסקופ. השתמש במראה דיכרואית אחרת כדי לפצל את האות הפלואורסצנטי לשני גלאים.
סנן את הקרינה המשתקפת על ידי המראה הדיכרואית עם מסנן פליטה ומקד אותה עם עדשה קמורה פשוטה על הגלאי הראשון. עבור ניסויים הכוללים פלואור אדום משני, סנן את הקרינה המועברת על ידי מראה ה-diic עם מסנן פליטה אחר, ולאחר מכן מקד אותה עם עדשת פלאנו קמורה נוספת על הגלאי השני. השתמש בדיודות צילום מפולת לזיהוי פוטונים פלואורסצנטיים.
לרכישת נתוני הקרינה, חבר את האות האלקטרוני מגלאי דיודות הצילום של מפולת להתקן DAQ רב תכליתי לרישום נתונים הפועל במחשב אישי. עבור ניסויי ליחה, השתמש בלייזר דופק וחבר את הגלאים לכרטיס מחשב TCS של ספירת פוטונים בודדים בקורלציה בזמן הפועל על מחשב נפרד. כרטיס זה מאפשר לקבל את נתוני אורך החיים הפלואורסצנטי.
שימוש במתודולוגיית TCS PC. כל פוטון פלואורסצנטי שזוהה מתואם לפולס לייזר תקרית ולכן לכל פוטון פלואורסצנטי שנפלט מוקצה זמן עיכוב. ניתן להתאים נתונים אלה לעקומת דעיכה מעריכית אחת או רב-מעריכית כדי לקבל הערכה של קצב הקרינה של הפלואורופורים.
כיום אנו יודעים שתאים הם הטרוגניים מאוד הן מבחינה ביולוגית, פיזיקלית והן מבחינה כימית. לכן, באופן אידיאלי, עלינו לנתח כל תא בכל פעם. עם זאת, יש לבצע את הבדיקות עם תפוקה גבוהה יותר כדי שנוכל לאסוף מספיק מידע כמותי כדי להגיע למסקנה אמינה ומשמעותית.
כאן יש לנו דוגמה לתאי אי קולי עוטפים בטיפה אחת, כך שניתן לבצע כפי שהוא. השתמשו בזן אי קולי טופ 10 שעבר תרבית בן לילה. על מנת לזהות את כדאיות התאים, השתמש ב-cyto nine ו-propidium iodide.
שני הצבעים הם צבעי DNA שאוספים ועוצמת הקרינה שלהם גדלה ביותר מפי 20. עם הקישור ל-DNA, cyto nine הוא צבע פלואורסצנטי ירוק שהוא חדיר לממברנה ופרופידיום יודיד. זהו צבע פלואורסצנטי אדום, שהוא אטום לממברנה.
לפיכך, תאים חיים זוהרים בירוק בעוד שתאים מתים מציגים פליטות ירוקות ואדומות כאחד. כאן אנו יכולים לראות יצירת טיפות ואנקפסולציה של תא בודד עם צומת T. הסרטון הזה הוקלט במצלמה במהירות גבוהה, אך ניתן לייצר טיפות בקצב של אלפים בשנייה.
בעת עטיפת תאים, יש לוודא שתרבית התאים מדוללת כך שיהיו פחות תאים מאשר טיפות שנוצרות, שהתאים מונעים שקיעה, מה שיכול להתרחש במזרק או בצינור. השתמש במוט ערבוב מגנטי בתוך המזרק כדי לשמור על התאים מפוזרים באופן שווה בתמיסה. השתמש בצינורות דקים מאוד, 50 מיקרומטר כדי לחבר את המזרק לשבב.
זה מבטיח קצב זרימה מהיר בתוך הצינור ולכן מונע מהתאים לשקוע. להלן הדוגמאות האופייניות לספירת תמונות כפונקציה של זמן עבור ניסויים מבוססי תאים. למפות תהליכי ערבוב בתוך טיפות.
ניתן ליצור טיפות באמצעות שתי ארבע פלואורו שונות עם אורך חיים שונה. בתוך טיפה זורמת, נוצר שדה זרימה, שבסופו של דבר מערבב את שני הפתרונות שהופרדו במקור כדי לשפר את תהליך הערבוב. ניתן לשנות את הסימטריה של שדה הזרימה באמצעות תעלות מפותלות.
על מנת לחקור את הטיפות, מקד את נפח הבדיקה האופטית במחצית גובה המיקרו-ערוץ שלאורכו זורמות טיפות, החל מצד אחד של התעלה, בצע כל ניסוי לכל רוחב התעלה. במרווחים של מיקרומטר אחד. יישם אלגוריתם כדי להבדיל בין התפרצויות בודדות הקשורות לטיפות מרקע הרעש של שלב השמן, ולקבוע את משך כל התפרצות.
יישם אלגוריתם שני כדי לחלץ את ערכי זמן העיכוב והעוצמה לאורך כל טיפה ברוחב המסוים שבו בוצע הניסוי. לאחר מכן השתמש באלגוריתם MLE של אומדן סבירות מקסימלית כדי להעריך את אורך חיי הקרינה של כל טיפה בניסוי. חישוב ממוצע ערכי אורך החיים של כל הטיפות בניסוי מפחית את השגיאה הסופית של חישוב ה-MLE.
ככל שנבדקו יותר טיפות, כך השגיאה קטנה יותר לאחר שהתקבל מסלול חיים שלם. עבור כל רוחב, שלב את כל המסלולים במפה דו-ממדית. מכיוון שכל ערך אורך חיים קשור לתערובת מסוימת של שתי ארבע הצומחים, ניתן להשיג מפת ריכוז או ערבוב.
תיארנו את הייצור של מכשיר מיקרו ומערך ניסיוני ופרוטוקולים נלווים להיווצרות מיקרו טיפות ואנקפסולציה של האזור והזיהוי האופטי של התהליך, הטיפות. שתי הדוגמאות בחרו את הזיהוי של תאים בודדים בטיפות ואת המיפוי של תהליכי הערבוב. בתוך הטיפה הזורמת מייצגים יישומים נפוצים שנחקרים כעת עם מיקרופלואידיקה טיפתית.
כפי שהניסויים המוצגים ממחישים, השימוש בפלטפורמות מיקרופלואידיות טיפתיות מציגות מאפיינים אטרקטיביים מסוימים כגון תפוקה גבוהה גורמת לכליאה מושלמת ושחזור גבוה יותר. כמות המידע הגדולה המיוצרת והמהירות הגבוהה ביותר שבה מידע זה נוצר. DU דרש שימוש בשיטות זיהוי מהירות עם רזולוציה זמנית מרחבית גבוהה ביותר אם רוצים להפיק את מלוא היתרון מפלטפורמות ממוזערות אלה.
במקרה זה, אנו מדגימים שזה אפשרי באמצעות טכניקות ספקטרוסקופיות פלואורוס מדויקות ביותר.
סקירה כללית
מאמר זה דן בשימוש בפלטפורמות מיקרו-נוזליות מבוססות טיפות לניסויים בתפוקה גבוהה. פלטפורמות אלו יכולות ליצור כלי פיקוליטר, בעלי מתחם עצמי בתדרים גבוהים, ומאפשרות חילוץ ניתוח נתונים יעיל.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרו-נוזליקה
- ניסויים בתפוקה גבוהה
- ספקטרוסקופית פלואורסצנציה
רקע
- מיקרו-נוזליקה מבוססת טיפות מאפשרת שליטה מדויקת בנפחים קטנים.
- חיסול דיבורים מוצלבים ופיזור משפר את הדיוק האנליטי.
- היישומים כוללים PCR, סינתזת ננו-חלקיקים ובדיקות תא בודד.
- שילוב עם שיטות גילוי רגישות הוא קריטי לחילוץ נתונים.
מטרת המחקר
- לפתח כלים לחילוץ כמויות גדולות של מידע ממערכות מיקרו-נוזליות.
- להציג שיטות לגילוי תאים בודדים ומיפוי תהליכי ערבוב.
- לשפר את הרגישות והיישום של שיטות הגילוי.
שיטות ששימשו
- ייצור שבבי מיקרו-נוזליקה באמצעות פוטוליתוגרפיה.
- יצירת טיפות באמצעות התמקדות זרימה וגיאומטריות של צומת T.
- התקן אופטי לבדיקת טיפות עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- שימוש בלייזרים לדימות זמן חיים של פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של טיפות קטנות עד כמה פמטוליטרים.
- פותחו שיטות גילוי רגישות גבוהה.
- השיטות הוכיחו קפסולציה וניתוח יעילים של דגימות.
- נוסחו פרוטוקולים ליישום שונים במיקרו-נוזליקה.
מסקנות
- פלטפורמות מבוססות טיפות יעילות לניתוח בתפוקה גבוהה.
- שילוב שיטות גילוי משפר את יכולות חילוץ הנתונים.
- פלטפורמות אלו ניתנות להתאמה למגוון רחב של יישומי מדע.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Microfluidic droplet platforms enable high-throughput screening by generating picoliter-volume compartments that eliminate cross-talk and dispersion, supporting precise analytical timing. This capability enhances predictive confidence in early discovery by allowing rapid, quantitative assessment of biological and chemical parameters at scale. Integration with sensitive fluorescence detection methods provides the spatial and temporal resolution needed to leverage miniaturization for de-risking target validation and lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through single-cell encapsulation and viability assessment using DNA-intercalating dyes.
- Operational Value: Facilitates high-frequency droplet generation (kHz range) for scalable screening of heterogeneous cell populations.
- Predictive Value: Supports functional target validation by isolating cellular responses in confined volumes, reducing mechanistic ambiguity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence lifetime and intensity readouts for mapping molecular mixing and reaction kinetics within droplets.
- Operational Value: Enables standardization of assay conditions via precise volumetric control and elimination of wall adsorption losses.
- Platform Reuse: Supports multiplexed detection through dual-laser excitation and spectral splitting for concurrent parameter measurement.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase phenotypic screening to preclinical validation through reproducible, droplet-based encapsulation of biological systems.
- Risk Mitigation: Enhances confidence in lead selection by enabling time-resolved analysis of mixing processes that influence reaction efficiency and product consistency.
- Continuity: Facilitates transfer of optimized droplet protocols from early discovery to preclinical models via standardized chip fabrication and optical detection.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself in the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, where quantitative droplet-based outputs inform go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling single-cell analysis and mixing kinetics mapping in isolated compartments.
- Screening: Delivers assay readiness through high-sensitivity, non-destructive fluorescence detection compatible with frequent droplet generation.
- Analytics: Provides fluorescence lifetime and intensity measurements that allow teams to compare reaction progress and molecular interactions under controlled conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating reproducible, quantifiable data from encapsulated biological samples applicable to dose-response and toxicity profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform capability where standardized microfluidic chips and optical setups can be applied across multiple projects in chemistry, biology, and materials science.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through single-cell resolution and elimination of cross-talk in high-throughput formats.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via precise droplet generation and integrated optical detection.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through quantitative, kinetically resolved data from picoliter reactors.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization enabled by mechanistic de-risking of lead candidates through mixing and viability profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic chip fabrication, fluorescence spectroscopy, and confocal microscopy alignment.
- Needs instrumentation including pulsed lasers, high-NA objectives, dichroic mirrors, emission filters, and time-correlated single-photon counting detectors.
- Demands cross-team standardization of droplet generation parameters and optical probe positioning for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols across different cell types, reagents, or channel geometries.
- Practical limitations include the need for cleanroom access for master fabrication and careful optimization of flow rates to prevent aqueous phase wetting of PDMS channels.
