סינתזה, הרכבה, אפיון monolayer מוגן סרטים Nanoparticle זהב עבור אלקטרוכימיה monolayer חלבון

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לסנתז ננו-חלקיקי זהב מיוצבים על ידי אלקיליציה, הידועים כצבירים מוגנים בשכבה אחת (monolayer protected clusters) או MPCs, ולהרכיב חומרים אלו למבני שכבה דקה המשמשים כממשק ספיחה לאלקטרוכימיה של שכבת מונו-שכבה של חלבון azarin. דבר זה מושג תחילה על ידי הגנה על קולואידים של זהב באמצעות ליגנדים אורגניים כדי ליצור ננו-חלקיקי זהב המוקפים בשכבת Alcan Pholate. לאחר מכן, ה-MPCs מעוגנים למצעי זהב וזכוכית ומרושתים לשכבות רב-שכבתיות דקות המקושרות באופן קוולנטי, שגדילתן נמעקבת באמצעות מדידות אופטיות ואלקטרוכימיות, וכן מיקרוסקופיה של חתך רוחב.

לאחר מכן, חלבון העברת האלקטרונים azarin נספח בממשק, ומתבצעת מדידת וולטמטריה מחזורית עבור אלקטרוכימיה של שכבה מונולאית של חלבונים. התוצאות מראות כי ממשקי סרט MPC שנוצרו בדרך זו מאפשרים ניתוח אלקטרוכימי אופטימלי יותר של חלבון ספוח המבוסס על סרט MPC, תוך אספקת ממשק ספיחה הומוגני יותר וקינטיקה מהירה של העברת אלקטרונים שאינה תלויה במרחק באופן המסורתי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני אלקטרוכימיה מסורתית של חלבונים הוא שאלקטרודות ששופרו באמצעות סרטי ננו-חלקיקים מספקות ממשק ספיחה שמוביל להתנהגות אלקטרוכימית אידיאלית יותר, כפי שנמדד באמצעות וולטמטריה מחזורית.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהסינתזה כוללת רמזים חזותיים חשובים, בעוד שבניית הסרט ואפיון שלו כוללים מספר שלבים מורכבים וטכניקות אנליטיות. ניתן להרכיב סרטי NPC על אלקטרודות זהב שעברו מודיפיקציה או על תגית זכוכית באמצעות שיטת מחזורי טבילה של שכבות MPC לסירוגין ומולקולות קישור dile. כתוצאה מכך, ניתן לעקוב אחר שכבות אלו באופן אלקטרוכימי או אופטי עד להגעה לעובי הסרט הרצוי.

כדי לסנתז צבירי זהב תחת מנדף עם אוורור מתאים, התחל בהמסת 1.1 גרם של tetra oxide ammonium bromide ב-30 מיליליטר של toluene. המס 0.38 גרם של sodium borah hydride בכ-20 מיליליטר של מים אולטרה-טהורים של 18 mega ohms, והשאר אותם להתקרר על קרח למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, העבר כמותית תמיסה של hydrogen tetra chloro orating water אל תוך תמיסת ה-tetra ide ammonium bromide ב-toluene, תוך שימוש בחמישה מיליליטר נוספים של מים אולטרה-טהורים. כדי לבצע מעבר פאזה של תמיסת הזהב המימית לתמיסה הלא-מימית, סגור את הכלי קלות וערבב בעוצמה למשך 30 דקות.

כעת השלבים המימיים בצבע כתום-שרוף והלא-מימיים השקופים מעורבבים היטב. העבירו הן את השלב המימי השקוף והן את השלב הלא-מימי בצבע כתום-שרוף למשפך הפרדה. השליכו את השכבה המימית ודלקקו את השכבה הלא-מימית לבקבוק נקי.

הוסף C six ביחס של שניים לאחד לתמיסה הלא-מימית המכילה hydrogen tetra chloro or rate. ערבב במשך 30 דקות להיווצרות פולימר gold one, כפי שניתן לזהות על ידי שינוי צבע מכתום-אדמדם לתמיסה צהובה חיוורת, כמעט חסרת צבע. העבר את תערובת התגובה לאמבט קרח מבודד וקרר ל-0 °C למשך 30 דקות לפחות תוך כדי ערבוב; הוסף באופן כמותי ומהיר את תמיסת sodium borohydride המקוררת לתערובת התגובה על מנת לחזר את gold one לזהב מתכתי בנוכחות thighs.

עם ההוספה, ייווצר באופן מיידי תמיסה שחורה וסמיכה של אשכולות זהב מוגנים בשכבה אחת (MPCs). ערבבו את התגובה למשך הלילה בטמפרטורה של 0 °C. העבירו את תערובת התגובה למשפך הפרדה.

שפכו את השכבה המימית לכלי איסוף פסולת. אידו את שכבת הטולואן הבלתי מימית עד ליובש כמעט מלא, כך שיישאר בבקבוק בוץ שחור וסמיך. השקיפו את ה-MPCs על ידי הוספת אצטוניטריל והניחו לתמיסה לעמוד למשך לילה תוך שימוש במסנן זכוכית (glass frit) בעל נקבוביות בינוניות עם חיבורי גומי ובקבוק עם זרוע צד ומשאבת ואקום (aspirator).

אסוף את ה-MPCs באמצעות סינון בוואקום ושטוף בכמות גדולה של aceto nitrile. לאחר הרכבת תא הסנדוויץ' באופן אלקטרוכימי, נקה את מצע הזהב על ידי ביצוע וולטמטריית מחזור או CV בחלונות פוטנציאל של 0.2 עד 0.9 וולט, 0.2 עד 1.2 וולט ו-0.2 עד 1.35 וולט במהירות של 100 millivolts per second בתמיסה של 0.1 molar sulfuric acid ו-0.01 molar potassium chloride. מדוד את זרם טעינת השכבה הכפולה של מצע הזהב הנקי והחשוף על ידי ביצוע CV בתנאי סטנדרט, הכוללים חלון פוטנציאל של 0.1 עד 0.4 וולט ביחס ל-silver cy chloride בסריקה של 100 millivolts per second בבופר פוטסיום פוספאט או KPB.

יש להסיר את הבאפר ולשטוף פעמיים ביסודיות עם מים אולטרה-מזוקקים ואתנול. יש לחשוף את מצע הזהב המנוקה לכ-300 µL של תמיסת C6 בריכוז 5 mM באתנול ולהמתין לילה שלם להיווצרות שכבת C6 SAM מסודרת. יש להסיר את תמיסת ה-C6 מהתא ולשטוף אותו פעמיים ביסודיות עם אתנול ומים אולטרה-מזוקקים.

מדדו את זרם הטעינה של ה-SAM בתנאים סטנדרטיים. השליכו את ה-KPB ושטפו פעמיים ביסודיות עם מים אולטרה-מזוקקים ואתנול. זרם הטעינה אמור לרדת באופן ניכר.

לאחר המדידות של הזהב הנקי, חשוף את תשתית הזהב שעברה שינוי באמצעות SAM לכ-300 µL של תמיסת NDT בריכוז 5 mM באתנול, והשאר אותה למשך שעה כדי לאפשר התפזרות של מולקולות הקישור NDT בתוך ה-C six Sam. השלך את תמיסת ה-NDT ושטוף פעמיים באופן יסודי ומקיף באתנול ובמים מזוקקים במיוחד, ולאחר מכן פעם אחת ב-diam methane. חשוף את תשתית הזהב לתמיסת MPC של DIAM methane תחת ערבול, על ידי הבעבוע איטי של גז חנקן למשך שעה אחת.

זוהי שכבת ה-MPC המעגנת של הרכבת הסרט. יש להסיר את תמיסת ה-MPC ולשטוף שוב באופן רצף עם dichloro methane, מים אולטרה-טהורים ו-KPB. מדוד את זרם הטעינה של שכבת ה-MPC בתנאים סטנדרטיים.

שפכו את ה-KPB ושטפו היטב במים אולטרה-מטוהרים וב-DIAM methane. חשפו את תשתית הזהב לכ-300 µL של תמיסת NDT בריכוז 5 mM ב-DIAM methane, תוך ערבוב על ידי הבעבוע איטי של גז חנקן למשך 20 דקות. שפכו את ה-NDT ושטפו היטב ב-DIAM methane כדי להשקיע את שכבת ה-MPC השנייה.

טבול מחדש את מכלול הסרט בתמיסת ה-MPC של DIAM methane והשאר אותו תחת ערבול על ידי הבעבוע איטי של גז חנקן למשך שעה אחת לפני השטיפות. לאחר מכן, מדוד שוב את זרם הטעינה של שכבת ה-MPC בתנאים סטנדרטיים ושטוף שוב תוך שימוש באותו הליך. ניתן להשקיע שכבות MPC נוספות במידת הצורך.

לאחר השלמת יצירת שכבת ה-MPC הרשתית, שטפו את המצע המודגש ב-KPB כדי לספוג חלבון AZ אל תוך מבנה שכבת ה-MPC. הזריקו כ-150 µL של תמיסת AZ בריכוז של 5 עד 10 µM ב-KPB אל תוך תא ה-E chem sandwich והשאירו אותו סגור ובקירור למשך שעה אחת לפחות. לאחר שתא ה-ECM יחזור לטמפרטורת החדר, שטפו אותו ביסודיות עם KPB, מלאו שוב את תא ה-ECM ב-KPB והעבירו בתוכו בועות של גז חנקן למשך 10 דקות.

בצע מחקרים אלקטרוכימיים של שכבה אחת, כגון CV, בחלון פוטנציאלים מ-0.25- וולט עד 0.25 וולט. סריקה במהירות של 100 מילי-וולט לשנייה ב-KPB Rinse A על גבי שקופית זכוכית ששונה ב-3M PT MS עם DIAM methane; הנח אותה בתמיסת MPC של DIAM methane למשך שעה אחת תוך ערבוב על שייקר במהירות נמוכה. שלב זה משלים את שכבת ה-MPC הראשונה של הרכבת הסרט על ידי עיגון של MPCs לקבוצות הקצה של ME captan של ה-sane.

שטפו היטב את העגלה ב-Dior methane, ייבשו אותה באמצעות גז חנקן ובצעו מדידת ספקטרום UV vis של העגלה לאחר השרייתה בתמיסת NDT ב-diam methane. הניחו את העגלה בתמיסת MPC למשך שעה אחת תוך כדי ערבוב במנער במהירות נמוכה. בכך נשלמת השכבה השנייה של MPC במבנה הסרט.

שטוף את הזכוכית היטב עם DIAM methane, ייבש בעזרת גז חנקן ובצע מדידת ספקטרום UV vis של הזכוכית. הבליעה לאורך הספקטרום צריכה לעלות ככל ששכבות MPC נוספות נספגות למבנה הסרט. כדי להצמיד סרט MPC שהורכב על זכוכית שעברה שינוי באמצעות 3M PT MS אל זכוכית מיקרוסקופ סטנדרטית.

הכינו את שרף האפוקסי embed eight 12 והניחו לו להסמיך למשך 12 שעות לפחות. מלאו קפסולת קרן בשרף אפוקסי והפכו אותה על גבי דגימת סרט ה-MPC. הפילו לחץ על הקפסולה כך שבועה תעלה לחלק העליון של הקפסולה, ובכך תיווצר אטימה בין שרף האפוקסי לבין דגימת סרט ה-MPC.

השאר את הדגימה לפולמריזציה למשך 18 שעות לפחות בטמפרטורה של 60 °C, ולאחר מכן קרר את השקופיות המורכבות לטמפרטורת החדר. חמם את השקופיות המורכבות למשך 20 שניות על פלטה חמה מאלומיניום יצוק בטמפרטורה של 200 °C כדי להקל על הסרת הבלוק עם ה-MPC המחובר על סרט מהיר. חתוך את הדגימה המכילה את הסרט מבלוק קפסולת הקרן באמצעות מסור תכשיטנים, והנח את החלק שהוסר בתבנית סיליקון שטוחה כאשר צד סרט ה-MPC פונה כלפי מעלה, אל פנים הסיליקון.

מלאו את באר הסיליקון בשרף אפוקסי בטמפרטורת החדר והניחו לו להתפלמר למשך 18 שעות לפחות ב-60 °C. לאחר מכן, צננו את הדגימה לטמפרטורת החדר. חתכו חתכים דקים של הדגימה בעובי 60 עד 80 nanometers באמצעות אולטרה-מיקרוטום Leica UCT וסכין יהלום, כך שהחתכים יהיו בניצב לקצה הסכין. הניחו את החתכים על סרט תמיכה פחמני מסוג form VAR על גבי רשתות נחושת של 400 mesh, וצלמו תמונות TEM של חתכי הרוחב של מכלולי סרטי ה-MPC המוצגים.

להלן תוצאות ניטור זרם טעינה של שכבה כפולה במהלך גידול סרט MPC, עבור סך של חמישה מחזורי טבילה הכוללים חשיפה לסירוגין לתמיסות MPC ו-NDT. זרמי הטעינה עולים באופן שיטתי עם כל מחזור טבילה. הוספת שכבות של MPC לסרט.

להלן גרף וולטמטריה ציקלית טיפוסי עבור ספיח AZ למערך סרט MPC, שנאסף באמצעות חלון פוטנציאל מ-0.25- עד 0.25+ וולט שנסרק ב-100 מיליוולט לשנייה בבופר פוטסיום פוספט בריכוז 4.4 מילימולר. כאן מוצג ניטור ספקטרלי ב-UV-vis מייצג של צמיחת סרט MPC מקושר בדיול על גבי שקופית זכוכית שעברה מודיפיקציה של 3M PT MS. מחזור טבילה מורכב מחשיפת שקופית הזכוכית לתמיסת מקשר NDT, ולאחריה חשיפה לתמיסת MPC.

כל טבילה עוקבת גורמת לעלייה בעובי הסרט ולעלייה נלווית בבליעה. איור זה מציג ניתוח של תמונת חתך במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) של הרכבת סרט MPC המקושרת ל-DIA. התמונה המוקטנת מציגה תמונת TEM טיפית של MPCs פונקציונליים עם hexa methol ששימשו בניתוח ה-TEM של הרכבת הסרט.

באמצעות Image J נקבע כי קוטר הליבה הממוצע של הזהב ב-MPCs הוא כ-two nanometers. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הסינתזה, האפיון וההרכבה של שכבות דקות של MPC מזהב המשמשות כממשק לספיחה ולאחר מכן לניתוח אלקטרוכימי של חלבוני רדוקס. ניתן להתאים בקלות את תהליך הרכבת השכבה על ידי מניפולציה של הליך הסינתזה של ה-MPC וכן של מנגנון הקישור הפנימי של החלקיקים כדי להתאימו לספיחה של מגוון רחב של חלבונים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האלקטרוכימיה של ספיגת חלבונים לפלטפורמות סינתטיות משופרות, ניתן ליישם אותה גם לפיתוח מערכות למידול מעבר אלקטרונים, תכניות לחשיפה ביולוגית (biosensing) וחומרים סינתטיים תואמים ביולוגית.