צומת Murine שטחית לימפה ניתוח
21 במאי 2012
כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תגובה חיסונית לאורך זמן בתוך העכבר זאת, בלוטות הלימפה ניתן להסיר ברצף על ידי ניתוח. כאן, אנו מתארים כיצד טכניקה זו ניתן לבצע.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להסיר בניתוח בלוטות לימפה מעכבר מורדם. זה מושג על ידי לוקליזציה ראשונה של בלוטות הלימפה. בלוטות הלימפה נקצרות ואז החתך נסגר.
לבסוף, ניתן להשיג תרחיף תא בודד לניתוח ניסיוני. בסופו של דבר, ניתן להעריך אוכלוסיות לימפוציטים ברות קיימא על ידי זרימה ציטומטרית. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית מכיוון שיש לראות לוקליזציה והסרה של בלוטות הלימפה על מנת לשלוט בהן.
לאחר הרדמת העכבר, יש למרוח משחת עיניים, להזריק בופרנורפין ולאשר טשטוש על ידי צביטת הבוהן, ואז להפוך את העכבר על צדו. ראשית, יש למקם את בלוטת הלימפה הברכיאלית ולאחר מכן לגלח את האזור שיש לנתח. לאחר הברשה של כל השערות הרופפות, מרחו חומר חיטוי על האזור ולאחר מכן בצעו חתך זעיר של כחמישה מילימטרים בגב ארבעת ה-Legg.
השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי למתוח את החתך עד שניתן לראות את בלוטת הלימפה הברכיאלית, שיכולה להיראות אפרפרה או כהה יותר מהשומן שמסביב. לאחר מכן צבט את הפאשיה המכסה את בלוטת הלימפה בזוג מלקחיים אחד. הניחו את זוג המלקחיים השני רחוק ככל האפשר מתחת לבלוטת הלימפה ומשכו קלות את הממברנה מבלי לשבור את הרקמה שמסביב.
לאחר מכן השתמש בזוג המלקחיים הראשון כדי לשבור את הפאשיה ולהסיר את בלוטת הלימפה. אם בלוטת הלימפה נקצרה בהצלחה, יופיע כתם דם במקום בו הייתה בעבר בלוטת הלימפה. הנח את בלוטת הלימפה שנכרתה בתמיסה איזוטונית אם היא שוקעת, זה יאשר שהרקמה שנקטפה היא בלוטת לימפה ולא שומן.
לאחר מכן, ודא שאין שערות בפצע וסגור את החתך על ידי הדבקת שני החלק הפנימי של העור יחד ועל ידי הידוקם עם קליפס אחד עד שניים, בהתאם לגודל החתך. כעת מקם בלוטת לימפה מפשעתית וגלח את האזור שיש לנתח. לאחר הברשה של שערות רופפות, מרחו חומר חיטוי על האזור ולאחר מכן בצעו חתך זעיר של כחמישה מילימטרים מעל הכף האחורית ליד הבטן.
לאחר פתיחת החתך בשני זוגות מלקחיים כפי שהוצג זה עתה עבור בלוטת הלימפה הברכיאלית, זהה את בלוטת הלימפה המפשעתית השוכנת בתוך רקמת השומן שמסביב. לאחר מכן הסר את בלוטת הלימפה עם שני זוגות המלקחיים כפי שהודגם זה עתה. שוב, אשר קציר מוצלח של בלוטת הלימפה על ידי ציון כתם הדם המופיע במקום בו הייתה בלוטת הלימפה בעבר, ולאחר מכן זרוק את בלוטת הלימפה המפשעתית למיכל נפרד של תמיסה איזוטונית.
לאחר שנקטפו כל בלוטות הלימפה, הכניסו את העכבר לכלוב והוסיפו מזון רטוב כדי שהעכבר יוכל להאכיל בקלות. לאחר הניתוח כשש עד שמונה שעות לאחר מכן, בדוק את העכבר כדי לוודא שהוא אינו חווה כאב. שימו לב היטב כי היציבה, האינטראקציה בהליכה עם הקונגן ומראה הפרווה דומים לזו של עכבר בריא רגיל.
לבסוף, נתק את בלוטת הלימפה על ידי לחיצה עליה כנגד שקופיות חלביות בצלחת פטרי ולאחר מכן העביר אותה לצינור כדי לקבל תרחיף תא בודד. לאחר צביעת התאים עבור אנטיגנים מעניינים על פני התא, נתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה. כאן, דגימה קדימה וצדדית, מוצגות תרשימי פיזור עבור בלוטות לימפה שנקטפו מבעלי חיים מורדמים או שהוקרבו.
הפרופילים ואחוזי התאים בשערי הלימפוציטים החיים של שתי חלקות הפיזור זהים. הוכחה שניתוח בלוטות לימפה הוא טכניקה מתאימה לקצירת תאים לאחר השליטה בניתוח בלוטות הלימפה ניתן לבצע תוך חמש עד 10 דקות לכל עכבר אם הוא מבוצע כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר טכניקה כירורגית להסרה רציפה של בלוטות לימפה מעכבר מורדם כדי לעקוב אחר התגובה החיסונית לאורך זמן. ההליך כולל לוקליזציה של בלוטות לימפה, קטיף וסגירת החתך, ואחריו השגת השעיה של תא יחיד לצורך ניתוח.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- טכניקות כירורגיות
- ניתוח ניסויים
רקע
- הבנת תגובות חיסוניות היא קריטית במחקר.
- בלוטות לימפה ממלאות תפקיד מרכזי במערכת החיסון.
- הסרה רציפה מאפשרת ניתוח טמפורלי של תגובות חיסוניות.
- טכניקות ויזואליות משפרות למידה ושליפה של ההליך.
מטרת המחקר
- להדגים את ההסרה הכירורגית של בלוטות לימפה בעכברים.
- להקל על המחקר של התקדמות התגובה החיסונית.
- לספק מדריך ויזואלי לחוקרים.
שיטות בשימוש
- לוקליזציה של בלוטות לימפה בעכבר מורדם.
- הסרה כירורגית של בלוטות לימפה.
- סגירת החתך לאחר הניתוח.
- הכנת השעיה של תא יחיד לניתוח.
תוצאות עיקריות
- הושגה הסרה מוצלחת של בלוטות לימפה.
- הושגו אוכלוסיות לימפוציטים ברות-קיימא.
- שימש ציטומטריה של זרימה להערכת לימפוציטים.
- הדגמות ויזואליות שיפרו את ההבנה של הטכניקה.
מסקנות
- הטכניקה מאפשרת מעקב יעיל אחר תגובות חיסוניות.
- עזרים ויזואליים הם חיוניים להשליטה בהליכים כירורגיים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על השיטה זו לתובנות עמוקות יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Sequential lymph node surgery enables longitudinal tracking of immune responses within the same animal, reducing experimental variability and supporting mechanistic de-risking in target validation. This approach provides sufficient viable lymphocytes for phenotypic and functional assays, enhancing predictive confidence in preclinical immunology studies. By facilitating time course experiments, the technique supports translational continuity from discovery through preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through temporal analysis of lymphocyte expansion in lymph nodes.
- Operational Value: Reduces animal usage and experimental variability by performing repeated sampling in the same mouse.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by characterizing lymph node-residing lymphocyte phenotypes over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields 1-2x10⁶ cells per lymph node, sufficient for phenotypic characterization and functional assays.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible cell suspensions for downstream flow cytometry analysis.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for reliable compound evaluation in immunology screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by tracking immune cell dynamics in lymph nodes over time.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment through longitudinal immune monitoring.
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in preclinical models by enabling mechanistic de-risking of immune-mediated pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through preclinical validation, supporting immune response tracking and lymphocyte functional analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via temporal immune response profiling.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible single-cell suspensions from harvested lymph nodes.
- Analytics: Generates quantitative lymphocyte populations for flow cytometry-based comparison across time points.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation through continuous immune monitoring in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable surgical capability for longitudinal immunology studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through longitudinal immune response tracking.
- Operational Value: Standardization and reproducibility in lymphocyte harvesting and processing.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reduced mechanistic ambiguity in immunology programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on temporal immune response data from sequential sampling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and anesthesia protocols.
- Necessitates sterile instrumentation and isotonic solutions for tissue preservation.
- Demands cross-team standardization for consistent lymph node localization and harvesting.
- Involves adaptation considerations for different lymph node sites (brachial, inguinal) and mouse strains.
- Limited by postoperative recovery intervals, allowing sampling every second day per node.
