Name: הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: חקור שכפול וגילוי של קלון מולקולרי זיהומי של נגיף Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאי מוח כבשים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי שכפול ויראלי באמצעות מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר האיסלנדי של אוניברסיטת קרן מחקר איסלנד.

1. Transfection שיבוט מולקולרי נכלל בשני פלסמידים, p8XSp5-egfp ו p67r, של 12 קילו ו 4.5 kb בהתאמה. 9,10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור כמויות equimolar של שני פלסמידים, כלומר 4.4 מיקרוגרם של p8XSp5-egfp ו -1.6 מיקרוגרם של p67r עם XbaI ו ולקשור לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קשירת, השתמש וייס 1 יחידה של האנזים בתגובה 50 דגירה μl ובו 16 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קשירת הושלמה, דגירה תמהיל קשירת על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עבור איון של האנזים. צעד זה עשוי להיות מושמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני, transfection זרע 10 SCP 6 תאים בקבוקון T25 תרבות רקמות, לגדל תאים יומיים 5 מ"ל DMEM + 10% בשר כבש בסרום גלוטמין 2mm ללא אנטיביוטיקה monolayer של 90% confluency. אם התאים לא הגיעו 90% confluency אחרי יומיים, לעזוב את התאים לגדול יום אחד נוסף. </li></ol> הערה: סרום כבש ניתן להחליף על ידי עוברי בסרום שור (FBS). אנו משתמשים באופן שגרתי כבש בסרום, שכן כמה זנים של MVV מעוכבים על ידי FBS, זה זן MVV אינה מעוכבת על ידי FBS, עם זאת. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים מוכנים transfection, לשנות בינוני עד DMEM עם סרום 1% (טלה או בסרום FBS) ללא אנטיביוטיקה. אנו משתמשים Lipofectamin 2000 (Invitrogen) עבור transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ה-DNA בינוני Opti-ממ 500μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 20μl Lipofectamin 2000 במדיום Opti-ממ 500μl ומשאירים בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 5 דקות, לשלב את ה-DNA מדולל Lipofectamine בדילול 2000 (הנפח הכולל μl = 1000). מערבבים בעדינות דגירה של 20-30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת transfection (1 מ"ל) ל T25 בקבוקון המכיל תאים SCP ובינוניים (5 מ"ל). מערבבים בעדינות על נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 בלילה (18 - 24 ש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי יום בינוני הבאה כדי DMEM עם סרום 1%, 2mm גלוטמין, 100IU פניצילין וסטרפטומיצין 100IU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג את הייצור של ה-GFP בתאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי SCP הפוכה. יעילות נמוכה transfection ניתן לצפות עם תאים ראשוניים אלה, בדרך כלל 5 - 15%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוסף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך מספר ימים כדי לאפשר התפשטות של הנגיף בבקבוק. בדרך כלל לוקח 7-14 ימים עבור זיהום מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את הנגיף על ידי aliquoting supernatant לתוך צינורות Eppendorf. ספין microfuge בסל"ד 3000 דקות 5 להסיר את פסולת התא. מעבירים את supernatant המכילים את הנגיף כדי צינורות חדשים. חנות ב -80 ° C. </li></ol> 2. טיטרציה של הנגיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 3x10 4 תאים SCP בינוני 100 DMEM μl בתוספת סרום 10%, 2mm גלוטמין, 100IU/ml פניצילין וסטרפטומיצין 100IU/ml, לכל היטב צלחת 96 היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים הם ומחוברות למחרת, לשנות בינוני עד DMEM עם סרום 1%, 2mm גלוטמין, 100IU/ml פניצילין וסטרפטומיצין 100IU/ml, 100 μl בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הווירוס באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 180 μl DMEM עם סרום 1%, 2mm גלוטמין, 100IU/ml פניצילין וסטרפטומיצין 100IU/ml לכל היטב 4 x 10 בארות בתחתית 96 עגול טוב או V-בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור דילולים סדרתי פי עשרה ארבע פעמים, להוסיף 20 μl של הנגיף לכל אחד 4wells בעמודה הראשונה של הבסיס, באמצעות ארבעה ערוצים פיפטה, פיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח כי דגימות מעורבבים היטב. שינוי עצות פיפטה והעברת 20 μl של 4 בארות הבא וכן הלאה. השאירו את בארות האחרון בלי וירוס עבור פקד שלילית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של דילולים הנגיף לתאים SCP ובינוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2. שימו לב ל-GFP הקרינה ותופעות cytopathic במשך שבועיים. תופעות Cytopathic מורכב של תאים הופכים מעוגל ושקוף פחות מאשר תאים נורמליים עם תהליכים מתמתח, וכלה בתאים multinuclear המופיעים ומוות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב וירוס titer (TCID50) בשיטת Muench ריד 11. </li></ol> 3. FACS ניתוח של תאים נגועים הערה: ניטור מהיר של שכפול הנגיף, תאים נגועים ניתן לבדוק על ידי cytometry הזרימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים נגועים (ca 10 5), לשטוף 1x עם PBS ו resuspend ב 500μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl paraformaldehyde פתרון 4% (הריכוז הסופי 2%), דגירה על RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים microfuge בסל"ד 3000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS 2x5 דקות ולנתח על נתח FACScan. ספירת 10,000 האירועים. </li></ol> 4. נציג התוצאות: וירוס זה צריך להיות מדבק באופן מלא לשכפל כייל של יוני 10 - יולי 10 TCID 50 / מ"ל. תאים נגועים הם פלורסנט ניתן Detected ידי cytometry זרימה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל, GFP ניתן לאתר למעלה מ -60% של התאים בתרביות תאים נגועים באמצעות cytometry הזרימה (איור 1). כמו כן, כאשר דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, רוב התאים הם פלורסנט (איור 2A ו-B). <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ניתוח FACScan של תאים נגועים בנגיף SCP-KV1772 egfp לאחר 7 ימים של זיהום. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> 2. איור שלב בניגוד מיקרוסקופית של תאים נגועים SCP-KV1772 egfp לאחר 7 ימי דגירה (A). תאים אותו דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (B).

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

GFP להביע שיבוט מולקולרי של MVV המוצגים כאן צריך להיות שימושי לניתוח מארח תאים אינטראקציות pathogenicity של MVV הן במבחנה in vivo. הווירוס מתקבל לאחר 7-14 ימים של שכפול רכשה ללא ספק כמה מוטציות עקב אי דיוק של reverse transcriptase. עם זאת, ישנן מגבלות על השימוש שיבוט זה כמו וקטור מחזור אחד. האחת היא השימוש המשובט מוגבל תאים של כבשים ממוצא עז. יעילות transfection של תאים אלה באמצעות לבנות שלנו הוא רק 5-15%, ושימוש וקטור pEGFP-N3 את היעילות transfection הוא 15-20% לעומת 90% מעל 293 ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-ממ </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

הפצת ועל גילוי clone מולקולרית זיהומיות של וירוס maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna וירוס (MVV) הוא lentivirus כבשים, גורם לדלקת ריאות ביניים מתקדמת לאט דלקת קרום המוח 1. התאים היעד העיקרי של MVV in vivo נחשבים של 2 את השושלת מונוציטים. זנים מסוימים של MVV יכול לשכפל סוגי תאים אחרים, לעומת זאת 3,4. חלבון פלואורסצנטי ירוק הוא סמן הנפוץ לחקר lentiviruses בתאים חיים. אנחנו צריכים להכניס את הגן egfp לתוך הגן עבור dUTPase של MVV. הגן dUTPase נשמרת היטב זנים lentivirus ביותר צאן ו הוכח להיות חשוב שכפול של CAEV 5. עם זאת, dUTPase הוכח להיות מיותר עבור שכפול של שיבוט מולקולרי של MVV השתמשו במחקר זה הן במבחנה in vivo 6. שכפול MVV מוגבל אך ורק תאים של כבש או עז מוצא. אנו משתמשים בקו התא הראשוני של מקלעת דמית העין של כבשים (תאים SCP) עבור transfection ואת התפשטות של הנגיף 7. MVV פלורסנט מדבק מלא הבעה EGFP יציב על לפחות 6 קטעים 8. קיימת קורלציה טובה בין מדידות של TCID 50 ו EGFP. וירוס זה ולכן צריך להיות שימושי עבור זיהוי מהיר של תאים נגועים במחקרים של כמיהות התא pathogenicity במבחנה in vivo 8.

אנו מתארים שיבוט מולקולרי של הנגיף maedi-visna המבטא GFP ו מדבק לחלוטין. שכפול של וירוס זה ניתן לגילוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.

הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

נגיף המאדי-ויסנה (Maedi-visna virus, MVV) הוא לנטיווירס של כבשים, הגורם לדלקת ריאות אינטרסטיציאלית ולדלקת מוח המתקדמות לאט1. תאי המטרה העיקריים של MVV ב...

המטרה הכללית של הליך זה היא להרבות ולזהות שיבט זיהומי של Mildy vs. No virus המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק. חלבון פלואורסצנטי ירוק זה שובש לתוך הגן המקודד ל-D utp Ace בתוך הגנום של נגיף Myy Ner.השבט הזיהומיי מכיל שני פלסמידים. ראשית, שני הפלסמידים הנושאים את רצפי myy Ner נחתכים עם אנזים ההגבלה xpa one ועוברים ליגציה. שנית, תאי פלקסוס כורואידי של כבשים עוברים טרנספקציה עם המבנה.לבסוף, תאים שנדבקו בנגיף myy vino מזוהים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה. שלום, אני סטפנו נרון ממכון TER לפתולוגיה ניסויית באוניברסיטת איסלנד. היום נראה לכם הליך להרבייה ולזיהוי של שיבט מולקולרי מידבק של נגיף my vascular המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק.השבט המולקולרי מוכיל את הפלסמידים P8XSP5EGFP ו-P67or בגדלים של 12 kilobases ו-4.5 kilobases בהתאמה. גזרו כמויות אקו-מולריות של שני הפלסמידים, דהיינו 4.4 µg של P8XSP5EGFP ו-1.6 µg של P67or עם XPA1, ובצעו ליגציה לפני הטרנספקציה. עם השלמת הליגציה, דגרו את תערובת הליגציה בטמפרטורה של 65 °C למשך 15 דקות. יומיים לפני הטרנספקציה, זרעו 10⁶ תאי SCP בבקבוק תרבית רקמה T25 וגדלו את התאים למשך יומיים ב-5 mL של DMEM בתוספת 10% lamb serum ו-2 mM גלוטמין ללא אנטיביוטיקה, עד להגעה לשכבה אחת בהספקה (confluency) של 90%.אם התאים לא הגיעו ל-90%CO לאחר יומיים, השאירו את התאים לגדול יום נוסף. ניתן להחליף את סרום הכבש בסרום עוברי בקר FBS. אנו משתמשים באופן שגרתי בסרום כבש מכיוון שזנים מסוימים של MVV מעוכבים על ידי FBS.זן MVV זה, לעומת זאת, אינו מעוכב על ידי FBS. כאשר התאים מוכנים לטרנספקציה, יש להחליף את המצע ל-DMEM עם 1% סרום כבש או FBS ללא אנטיביוטיקה. אנו משתמשים ב-Lipofectamine 2000 לטרנספקציה: יש לדלל את ה-DNA ב-500 microliters של מצע opti MEM, לדלל 20 microliters של lipofectamine 2000 ב-500 microliters של מצע opti MEM, ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לאחר דגירה של חמש דקות, ערבבו את ה-DNA המדולל עם lipofectamine 2000 מדולל לנפח סופי של 1000 microliters. ערבבו בעדינות ודגרו למשך 2230 דקות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לבקבוק T 25 המכיל תאי SCP ותערובת מדיום, תוך כדי ניעור עדין.דגירה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide למשך לילה. למחרת, החליפו את המצע ל-DMEM עם 1% serum, 2 mM glutamine, 100 IU/mL penicillin ו-100 IU/mL Streptomycin. עקבו אחר ייצור ה-GFP ועל תאי ה-SCP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הפוכה.ניתן לצפות ליעילות טרנספקציה נמוכה בתאים ראשוניים אלו, בדרך כלל בין 5% ל-15%. דגרו באופן המשכי ב-37 °C, 5% carbon dioxide למשך מספר ימים כדי לאפשר את התפשטות הנגיף בבקבוק. הדבר דורש בדרך כלל שבעה עד 14 ימים להדבקה מלאה. אספו את הנגיף על ידי העברת העלייה (supernatant) לשפרורות אפלורון.סובב במערך סרטורגפה (microfuge) במהירות של 3000 rpm למשך חמש דקות, כדי להסיר פסדתיים של תאים. העבר את העליון (supernatant) המכיל את הווירוס למבחנות חדשות.הזרק 3*10⁴ תאי SCP המאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס, לתוך 100 µL של מצע DMEM המועשר ב-10% סרום, 2 mM גלוטמין, 100 IU/mL פניצילין ו-100 IU/mL סטריפטומייצין לכל באר.בפלטה בעלת 96 בארות, דגרו בטמפרטורה של 37 °C וריכוז של 5% carbon dioxide. אם התאים הגיעו למצב של התלכדות (confluence) למחרת, החליפו את המצע למצע DMEM עם 1% serum. כאשר בכל בארה יש 100 µL, דללו את הווירוס באופן הבא.הוסיפו 180 µL של DMEM עם 1% serum לכל באער ב-40 באערים (ארבע פעמים 10 באערים) בפלטה בעלת 96 באערים עם תחתית עגולה או תחתית V, לצורך דילול סדרתי של פי עשרה בארבעה כפילויות. הוסיפו 20 µL של וירוס לכל אחד מארבעת הבאערים בעמודה הראשונה של הפלטה. בעזרת פפית ארבעה ערוצים, בצעו שאיבה ושחרור חוזר (pipet up and down) כדי להבטיח שהדגימות מעורבבות היטב.החליפו את טיפי הפיפטה והעבירו 20 µL לארבעת הבארים הבאים, וכן הלאה. השאירו את הבארים האחרונים ללא וירוס לצורך בקרה שלילית. הוסיפו 100 µL של מהולל הוירוס לתאי ה-SEP ולמצע בדגירה.37 °C ו-5% carbon dioxide. יש לעקוב אחר פלואורסצנציית GFP ואפקטים ציטופתיים במשך שבועיים. האפקטים הציטופתיים כוללים הפיכה של התאים לעגולים ופחות שקופים מתאים רגילים עם שלוחות שנמתחות, ומסתיימים בהופעת תאים רב-גרעיניים ובמוות תאי.חשב את תרגיז הנגיף באמצעות שיטת Reid Munch לניטור מהיר של שכפול הנגיף. ניתן לבחון תאים נגועים באמצעות פלוו-ציטומטריה לאחר עיכול בטריפסין. נצפו כ-10⁵ תאים נגועים.שטפו פעם אחת עם PBS והשביחו שוב ב-500 microliters של PBS. הוסיפו 500 microliters של תמיסת Para formaldehyde בריכוז 4% (ריכוז סופי של 2%) והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. השקיעו את התאים ב-3000 or PMM למשך חמש דקות.שטפו עם PBS פעמיים למשך חמש דקות ובצעו ניתוח במנתח fact scan. ספרו 10,000 אירועים. השיבוב המולקולרי המבטא GFP של הווירוס המוצג כאן יכול להועיל לניתוח אינטראקציות בין הווירוס למארח ופתוגניות של הנוירו-ווירוס שלי, הן in vivo והן in vitro.על אף שלא הוכח כי הנוירו-וירוס (neurovirus) שלי יכול להשפיע על תאים אנושיים, חשוב להקפיד על כל אמצעי הזהירות של רמת הבטיחות הביולוגית (biosafety level); ניתן להשיג הן את התאים והן את הפלסמיד מהמעבדה שלנו. בהצלחה בניסויים שלכם.

propagating-detecting-an-infectious-molecular-clone-maedi-visna-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

פיתחנו וקטור lentiviral שיש לה, בנוסף LTR תאת מגיב, את אלמנט Rev-תגובה (RRE) כי ניתן לווסת את ביטוי הגן הכתב בצורה HIV-1 ו-תאת Rev-מותנה. וקטור מאפשר את זיהוי ספציפי של שכפול HIV בתאים חיים באמצעות ביטוי ה-GFP.

סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה של הזרקה תוך חדרית ותוך וסקולרית של חלקיקים נגיפיים או מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים למוח העכבר היילוד. ניתן לזהות את דפוס הלוקליזציה של הנגיף והננו-חלקיקים על ידי הערכה מיקרוסקופית או על ידי הכלאה באתר.

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

שפעת וירוסים (IAVs) הם פתוגנים הנשימה מדבקת הגורמות מגיפה שנתית ומדי פעם גיפות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר זיהומים ויראליים בvivo באמצעות רומן רקומביננטי לוציפראז והבעת הביטוי הדו-כתבת b IAV (בירפעת). גישה זו מספקת לחוקרים כלי מצוין כדי ללמוד IAV ב-vivo.

לוציפראז-כתבת פלורסנט וירוס שפעת עבור הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי

פרוטוקול זה מתאר את הדינמיקה של זיהומים נגיפיים באמצעות לוציפראז ופלואורסצנציה המבטאת רקומביננט (r)SARS-CoV-2 ומערכות הדמיה in vivo (IVIS) בעכברים מהונדסים K18 hACE2 כדי להתגבר על הצורך בגישות משניות הנדרשות לחקר זיהומי SARS-CoV-2 in vivo.

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

וירוסים מדומים (PVs) הם נגיפים פגומים בשכפול המשמשים לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בתנאים בטוחים יותר מאשר טיפול בנגיפים אותנטיים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המראה כיצד ניתן להשתמש ב- SARS-CoV-2 PVs כדי לבדוק את יכולת הנטרול של נסיוב החולים לאחר חיסון COVID-19.

וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול

חקור שכפול וגילוי של קלון מולקולרי זיהומי של נגיף Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאי מוח כבשים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי שכפול ויראלי באמצעות מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה.

הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

גלה סרטונים נוספים