הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

המטרה הכללית של הליך זה היא להרבות ולזהות שיבט זיהומי של Mildy vs. No virus המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק. חלבון פלואורסצנטי ירוק זה שובש לתוך הגן המקודד ל-D utp Ace בתוך הגנום של נגיף Myy Ner.

השבט הזיהומיי מכיל שני פלסמידים. ראשית, שני הפלסמידים הנושאים את רצפי myy Ner נחתכים עם אנזים ההגבלה xpa one ועוברים ליגציה. שנית, תאי פלקסוס כורואידי של כבשים עוברים טרנספקציה עם המבנה.

לבסוף, תאים שנדבקו בנגיף myy vino מזוהים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה. שלום, אני סטפנו נרון ממכון TER לפתולוגיה ניסויית באוניברסיטת איסלנד. היום נראה לכם הליך להרבייה ולזיהוי של שיבט מולקולרי מידבק של נגיף my vascular המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק.

השבט המולקולרי מוכיל את הפלסמידים P8XSP5EGFP ו-P67or בגדלים של 12 kilobases ו-4.5 kilobases בהתאמה. גזרו כמויות אקו-מולריות של שני הפלסמידים, דהיינו 4.4 µg של P8XSP5EGFP ו-1.6 µg של P67or עם XPA1, ובצעו ליגציה לפני הטרנספקציה. עם השלמת הליגציה, דגרו את תערובת הליגציה בטמפרטורה של 65 °C למשך 15 דקות. יומיים לפני הטרנספקציה, זרעו 10⁶ תאי SCP בבקבוק תרבית רקמה T25 וגדלו את התאים למשך יומיים ב-5 mL של DMEM בתוספת 10% lamb serum ו-2 mM גלוטמין ללא אנטיביוטיקה, עד להגעה לשכבה אחת בהספקה (confluency) של 90%.

אם התאים לא הגיעו ל-90%CO לאחר יומיים, השאירו את התאים לגדול יום נוסף. ניתן להחליף את סרום הכבש בסרום עוברי בקר FBS. אנו משתמשים באופן שגרתי בסרום כבש מכיוון שזנים מסוימים של MVV מעוכבים על ידי FBS.

זן MVV זה, לעומת זאת, אינו מעוכב על ידי FBS. כאשר התאים מוכנים לטרנספקציה, יש להחליף את המצע ל-DMEM עם 1% סרום כבש או FBS ללא אנטיביוטיקה. אנו משתמשים ב-Lipofectamine 2000 לטרנספקציה: יש לדלל את ה-DNA ב-500 microliters של מצע opti MEM, לדלל 20 microliters של lipofectamine 2000 ב-500 microliters של מצע opti MEM, ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר דגירה של חמש דקות, ערבבו את ה-DNA המדולל עם lipofectamine 2000 מדולל לנפח סופי של 1000 microliters. ערבבו בעדינות ודגרו למשך 2230 דקות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לבקבוק T 25 המכיל תאי SCP ותערובת מדיום, תוך כדי ניעור עדין.

דגירה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide למשך לילה. למחרת, החליפו את המצע ל-DMEM עם 1% serum, 2 mM glutamine, 100 IU/mL penicillin ו-100 IU/mL Streptomycin. עקבו אחר ייצור ה-GFP ועל תאי ה-SCP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הפוכה.

ניתן לצפות ליעילות טרנספקציה נמוכה בתאים ראשוניים אלו, בדרך כלל בין 5% ל-15%. דגרו באופן המשכי ב-37 °C, 5% carbon dioxide למשך מספר ימים כדי לאפשר את התפשטות הנגיף בבקבוק. הדבר דורש בדרך כלל שבעה עד 14 ימים להדבקה מלאה. אספו את הנגיף על ידי העברת העלייה (supernatant) לשפרורות אפלורון.

סובב במערך סרטורגפה (microfuge) במהירות של 3000 rpm למשך חמש דקות, כדי להסיר פסדתיים של תאים. העבר את העליון (supernatant) המכיל את הווירוס למבחנות חדשות.

הזרק 3*10⁴ תאי SCP המאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס, לתוך 100 µL של מצע DMEM המועשר ב-10% סרום, 2 mM גלוטמין, 100 IU/mL פניצילין ו-100 IU/mL סטריפטומייצין לכל באר.

בפלטה בעלת 96 בארות, דגרו בטמפרטורה של 37 °C וריכוז של 5% carbon dioxide. אם התאים הגיעו למצב של התלכדות (confluence) למחרת, החליפו את המצע למצע DMEM עם 1% serum. כאשר בכל בארה יש 100 µL, דללו את הווירוס באופן הבא.

הוסיפו 180 µL של DMEM עם 1% serum לכל באער ב-40 באערים (ארבע פעמים 10 באערים) בפלטה בעלת 96 באערים עם תחתית עגולה או תחתית V, לצורך דילול סדרתי של פי עשרה בארבעה כפילויות. הוסיפו 20 µL של וירוס לכל אחד מארבעת הבאערים בעמודה הראשונה של הפלטה. בעזרת פפית ארבעה ערוצים, בצעו שאיבה ושחרור חוזר (pipet up and down) כדי להבטיח שהדגימות מעורבבות היטב.

החליפו את טיפי הפיפטה והעבירו 20 µL לארבעת הבארים הבאים, וכן הלאה. השאירו את הבארים האחרונים ללא וירוס לצורך בקרה שלילית. הוסיפו 100 µL של מהולל הוירוס לתאי ה-SEP ולמצע בדגירה.

37 °C ו-5% carbon dioxide. יש לעקוב אחר פלואורסצנציית GFP ואפקטים ציטופתיים במשך שבועיים. האפקטים הציטופתיים כוללים הפיכה של התאים לעגולים ופחות שקופים מתאים רגילים עם שלוחות שנמתחות, ומסתיימים בהופעת תאים רב-גרעיניים ובמוות תאי.

חשב את תרגיז הנגיף באמצעות שיטת Reid Munch לניטור מהיר של שכפול הנגיף. ניתן לבחון תאים נגועים באמצעות פלוו-ציטומטריה לאחר עיכול בטריפסין. נצפו כ-10⁵ תאים נגועים.

שטפו פעם אחת עם PBS והשביחו שוב ב-500 microliters של PBS. הוסיפו 500 microliters של תמיסת Para formaldehyde בריכוז 4% (ריכוז סופי של 2%) והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. השקיעו את התאים ב-3000 or PMM למשך חמש דקות.

שטפו עם PBS פעמיים למשך חמש דקות ובצעו ניתוח במנתח fact scan. ספרו 10,000 אירועים. השיבוב המולקולרי המבטא GFP של הווירוס המוצג כאן יכול להועיל לניתוח אינטראקציות בין הווירוס למארח ופתוגניות של הנוירו-ווירוס שלי, הן in vivo והן in vitro.

על אף שלא הוכח כי הנוירו-וירוס (neurovirus) שלי יכול להשפיע על תאים אנושיים, חשוב להקפיד על כל אמצעי הזהירות של רמת הבטיחות הביולוגית (biosafety level); ניתן להשיג הן את התאים והן את הפלסמיד מהמעבדה שלנו. בהצלחה בניסויים שלכם.