Name: רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: למדו טכניקת אימונוסטיינינג לזיהוי סיבי עצב תחושתיים הפריפריים בעכברים. השיטה מאפשרת חקר ביטוי חלבונים ודפוסי עצבוב בעור ובעצמות גפיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר יורי מ Usachev על עזרתו סטנדרטיזציה הראשונית של מיקרוסקופיה confocal / הדמיה של עכבר plantar immunostaining ביופסיה; וד&quot;ר דונה ל המונד לעזרה המשיך אותה ביקורת בונה בעבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של NINDS / NIH (NS069898), ואת פיתוח רעיון הענקת פרס מהמחלקה תוכנית הביטחון מחקרים סרטן הערמונית (DoD-PCRP-101096) כדי DPM

<ol><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixative+Composition+Alters+Distributions+of+Immunoreactivity+for+Glutaminase+and+Two+Markers+of+Nociceptive+Neurons%2C+Nav+1.8+and+TRPV1%2C+in+the+Rat+Dorsal+Root+Ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).</li>
<li>Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+decalcifying+agents+on+EGF+and+EGFR+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining.</a> Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7, 155-159 (1986).</li>
<li>Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+sprouting+and+changes+in+nociceptive+sensory+innervation+in+the+glabrous+skin+of+the+rat+hind+paw+following+partial+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury.</a> The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).</li>
<li>Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepidermal+nerve+fiber+loss+corresponds+to+the+development+of+Taxol-induced+hyperalgesia+and+can+be+prevented+by+treatment+with+minocycline%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline.</a> Pain. 152, 308-313 (2011).</li>
<li>Bloom, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer-Induced+Bone+Remodeling%2C+Skeletal+Pain%2C+and+Sprouting+of+Sensory+Nerve+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers.</a> The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).</li>
<li>Constantin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Tumor+Necrosis+Factor+%CE%B1+%28TNF%CE%B1%29+Requires+TNF+Receptor+Type+2+to+Generate+Heat+Hyperalgesia+in+a+Mouse+Cancer+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model.</a> J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).</li>
<li>Jankowski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+Cutaneous+Nociceptors+after+Nerve+Transection+and+Regeneration%3A+Possible+Role+of+Target-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).</li>
<li>Jimenez-Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+Sprouting+of+Adult+Nociceptors+in+Chronic+Prostate+Cancer-Induced+Bone+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain.</a> J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).</li>
<li>Persson, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium-calcium+exchanger+and+multiple+sodium+channel+isoforms+in+intra-epidermal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals.</a> Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).</li>
<li>Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+Enterotoxin+B+Causes+Proliferation+of+Sensory+C-Fibers+and+Subsequent+Enhancement+of+Neurogenic+Inflammation+in+Rat+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin.</a> Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).</li>
<li>Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+loss+of+peptidergic+intraepidermal+nerve+fibers+in+an+STZ-induced+mouse+model+of+insensate+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy.</a> Pain. 140, 35-47 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן יש לנו את השיטות מפורט להכנת העור העכבר רקמת העצם חלקים עבור immunostaining וזיהוי של סיבי עצב היקפי חושית. הסעיפים המופק plantar ביופסיות אגרוף להכיל העור glabrous ושעיר, כלומר פרוטוקול ניתן להשתמש על כל סוג העור. טכניקות אלה יכולים גם להיות מועסק להכתים סוגי תאים אחרים ברקמות אלה (לויקוציטים למשל, כלי הדם endothelia, שריר חלק, בין השאר). שיטות אלה מספקים פשרה מעולה בין שימור ultrastructural אופטימלי (אשר מושגת על ידי קיבוע glutaraldehyde, אבל לעתים קרובות התוצאות שיבוש epito...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר שם </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> האריס 3mm Micro-Punch </td><td> חומר </td><td> טד פלה </td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td> זלוף משאבה </td><td> חומר </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> מגיב </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> Picric חומצה </td><td> מגיב </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> אוקטובר מתחם והטבעה </td><td> מגיב </td><td> רקמות-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cyto-Freeze קריוגני תרסיס ספריי </td><td>חומר </td><td> בקרת החברה </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> עיזים סרום </td><td> מגיב </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> דגירה מגש מכסה עבור Immunostaining (גדול) </td><td> חומר </td><td> RPI קורפ </td><td> 248,270 (מגש) 248270-A (מכסה) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge עט מחסום הידרופובי </td><td> חומר </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> מברשות שיער של קאמל (# 1 עובי) </td><td> חומר </td><td> טד פלה </td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Long זהב הרכבה בינונית </td><td> מגיב </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

רקמות הכנה immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר innervating עצמות סקין לימב

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

איתור ועיבוד ראשוני של חומר כימי, פיזי גירויים חושיים תרמי ההיקפיים על ידי סיבי עצב תחושתי היא המפתח תפיסה חושית בבעלי חיים ובבני אדם. אלה סיבי העצבים התחושתיים ההיקפיים להביע שפע של קולטנים ערוץ חלבונים יון אשר לזהות ליזום גירויים חושיים ספציפיים. שיטות זמינים כדי לאפיין את התכונות החשמליות של סיבי עצב היקפי חושי innervating את העור, אשר יכול גם להיות מנוצל כדי לזהות את הביטוי הפונקציונלי של חלבונים ספציפיים ערוץ יון בסיבים אלה. עם זאת, שיטות אלקטרו דומים אינם זמינים (והם גם קשה לפתח) לצורך זיהוי של הביטוי הפונקציונלי של קולטנים וחלבונים ערוץ יון בשנת היקפי סיבי עצב תחושתי innervating אברי בטן אחרים, כולל הרקמות המאתגרים ביותר, כגון עצם. יתר על כן, שיטות אלקטרו כזה לא יכול להיות מנוצל על מנת לקבוע את הביטוי של החלבון לא להתרגשים של הפריפריה סיבי עצב תחושתי. לכן, immunostaining של דגימות רקמה היקפי / הקרביים עבור חמישיות העצבים התחושתיים מספק את הדרך הטובה ביותר ניתן לקבוע את הביטוי של חלבונים ספציפיים של עניין אלה סיבי העצב. עד כה, רוב המחקרים ביטוי החלבון עצב סנסורי להיות מנוצל immunostaining ההליכים בגרעיני חושי, שבו מידע מוגבל הביטוי של חלבונים מסוימים בגוף התא של סוגים מסוימים או תת נוירונים חושיים. כאן אנו מדווחים שיטות מפורט / פרוטוקולים להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים עבור immunostaining של סיבי עצב היקפי חושית. אנחנו במיוחד שיטות פרט להכנת העור או ביופסיה plantar אגרוף העצם (עצם הירך) סעיפים מעכברים עבור immunostaining של סיבי עצב היקפי חושית. שיטות אלה לא רק מפתח להגדרה האיכותי של ביטוי החלבון עצב סנסורי הפריפריה, אלא גם לספק שיטה assay כמותיקביעת שינויים בביטוי רמות החלבון או תת סוגים מסוימים של סיבים חושית, כמו גם לקביעת שינויים מורפולוגיים ו / או אנטומי במספר וצפיפות הסיבים החושית במהלך מצבים פתולוגיים שונים. יתר על כן, שיטות אלה אינם מוגבלים רק כתמים של סיבי עצב תחושתי, אבל יכול לשמש גם עבור צביעת כל סוגי סיבי עצב בעור, עצמות ורקמות הקרביים אחרים.

זיהוי Immunocytochemical של הפריפריה תת סיב עצב תחושתי (גילוי של ביטוי החלבון בו) הם המפתח להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תחושה היקפית. כאן אנו מתארים שיטות להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים, כגון עצמות עור הגפיים, immunostaining מסוים של סיבי עצב היקפי חושית.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

גילוי ועיבוד ראשוני של גירויים חושיים פיזיים, כימיים ותרמיים על ידי סיבי עצב תחושתיים פריפריאליים הם המפתח לתפיסה חושית ב...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג תובבנות לגבי הארגון האנטומי, כמו גם פרופילי ביטוי ומיקום של חלבונים ספציפיים בסיבי עצב פריפריאליים המעצבבים רקמות כגון עור ועצם. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ביצוע פרפוזיה של בעל החיים השלם עם חומר מקבע, ולאחריה דיסקציה או הסרה של הרקמה הרלוונטית. לאחר מכן, הרקמות המבודדות עוברות קיבוע משני (postfix) והעצמות עוברות דקלציפיקציה. באמצעות קריוסטט, מופקים חתכים דקים של רקמת עור ועצם המורכבים על עלויות.השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית עם סמן בודד או מספר סמנים של חתכי רקמה אלו, באמצעות נוגדנים נגד חלבונים המובעים באופן ספציפי וממוקמים בסיבי עצב פריפריים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את דפוס ההפצה של סוגים ספציפיים של סיבי עצב פריפריים, וכן את דפוס הביטוי ו/או המיקום של חלבונים ספציפיים בסיבי עצב פריפריים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תוך שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי (epi fluorescence) או במיקרוסקופ קונפוקלי. גישה זו יכולה לשמש למתן מענה לשאלות מפתח על מערכת העצבים הפריפרית, כגון מהם דפוסי העצבוב (innervation) ברקמות כמו עור ועצם?ניתן להרחיב גישה זו לאיברים פנימיים ומרקמות אחרות. היא יכולה גם לספק מידע על שינויים בביטוי של חלבונים בתוך תתי-אוכלוסיות אלו של סיבי עצבים תחושתיים, ועל השינויים שעשויים להתרחש בביטוי של חלבונים אלו במהלך תהליכים פתולוגיים או התפתחותיים. הניחו בעל חיים שעבר פרפוזיה ב-4%PFA על משטח חיתוך או על משטח יציב אחר כדי לאסוף דגימות רקמה מהרגל האחורית.החזיקו את הרגל כאשר הפנימיות (הסוליה) פונה למעלה, ולחצו בחוזקה עם מכשיר ביופסיה נקב (punch biopsy) בגודל שלושה מילימטרים הממוקם במרכז הרגל. סובבו את מכשיר הביופסיה קדימה ואחורה בטווח של 180 מעלות כדי להבטיח שהמכשיר חתך את כל עובי הרגל. הוציאו בעדינות את מכשיר הביופסיה מהרגל והשליכו את הרקמה לתוך מבחנה סטרילית של שני מיליליטר המכילה מיליליטר אחד של 4%PFA, או תמיסת 5%PA, כדי לאסוף דגימות של עצם הגפיים, ובמקרה זה מהפמור.בצעו חתך לטרלי לאורך גבו של בעל החיים בגובה האגן, שניתן להמשיך כלפי מטה לאורך שתי הגפיים האחוריות. חתכו אל תוך האגן והשרירים שסביבו כדי להפריד את ה-femur מהאגן, תוך השארת הראש הפרוקסימלי של ה-femur שלם. לאחר מכן, חתכו אל תוך ה-tibia או ה-fibula כדי להשאיר את הראש הדיסטלי שלם, והסירו את השרירים וה-periosteum שסביב גוף העצם.הניחו את ה-femur לתוך מבחנה של שני מיליליטר המכילה מיליליטר אחד של תמיסת 4%PFA או 5%PA, ולאחר מכן אפשרו לשתי הדגימות לעבור קיבוע משני (postfix) תוך ערבוב עדין על Rocker למשך 16 עד 18 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע המשני, בצעו דקלציפיקציה (decalcify) לשתי הדגימות על ידי העברתן למבחנות סטריליות של שני מיליליטר המכילות 1.5 מיליליטר של תמיסת דקלציפיקציה. אפשרו לדגימת ה-plantar punch להתערבל בעדינות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות, ול-femur למשך שישה עד שבעה ימים.יש להחליף את התמיסה מדי 24 שעות ולעקוב אחר רקמת העצם כדי לבדוק אובדן נוקשות באמצעות פינצטה לאחר הפדקלציפציה. העבירו את דגימות הרקמה לשפחור סטרילי של 2 mL עם 1.5 mL של תמיסת Cryoprotectant והניחו את השפחור בחזרה על מכשיר הניעור (rocker) לערבוב עדין למשך 16 עד 18 שעות בטמפרטורה של 4 °C. כדי להכין את הרקמה לחיתוך, הניחו כמות של תרכובת OCT (optimal cutting temperature compound) בנפח השכבה על בלוק להרכבת רקמה של קריוסטט והמתינו להקפאה בתא הקריוסטט בטמפרטורה של 20- °C.ניתן לרסס את ה-OCT עם אירוסול קריוגני כדי להאיץ את תהליך ההקפאה במידת הצורך. עבור דגימות רקמה שנלקחו באמצעות punch plantar, מקמו את דגימת הרקמה על מצע ה-OCT. עבור רקמת עצם, מקמו את הדגימות כך שניתן יהיה להוציא חיתוכים רוחביים אחידים.מקמו את הדגימה כך שיתקבלו חתכים לאורכו של העצם. כסו את שתי הדגימות בשכבה דקה נוספת של OCT. לאחר מכן, רססו בעדינות תרסיס קריוגני עד שהרקמה קפואה.הניחו את הדגימה על ראש החיתוך בתא הקריוסטט ואפשרו לבלוק דגימת הרקמה להגיע לשיווי משקל עם טמפרטורת החיתוך למשך שעה אחת לפחות, כדי למנוע קבלת חתכים שבירים. לאחר שהרקמה הגיעה לטמפרטורה האופטימלית, התחילו בחיתוך הדגימה כדי להפיק חתכים בעובי 40 micron עבור רקמה של plantar punch. אספו את חתכי הקריו לפלטות תרביות רקמה בעלות 12 בארות המכילות 0.1 molar PB עם 10 millimolar sodium azide.וודאו שהחתכים נשארים טבולים ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 °C עד למועד ביצוע הצביעה האימונוהיסטוכימית של רקמת העצם. אספו את חיתוכי הקריו ישירות על שקופיות מצופות ג'לטין, ולאחר מכן הניחו להם להתייבש באוויר במשך שעה אחת לפני האחסון בטמפרטורה של 20- °C. חיתוכי עצם על שקופיות המאוחסנים באופן זה יכולים לשמש למטרות צביעה אימונוהיסטוכימית בתוך שניים עד שלושה חודשים.בעזרת להב תער, חתכו ששה עד שבעה מילימטרים מקצה של טיפ למקרו-פיפט של 1 ml. הכשילו את החלק הפנימי של הטיפ על ידי שאיבה של 1% fetal bovine serum ב-0.1 molar PB מספר פעמים, כדי למנוע מהחתכים של הרקמה להידבק לדפנות הטיפ. העבירו שמונה עד 10 חתכי plantar punch לכל באר בלוח תרביות רקמה בעל 24 בארות. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים ב-500 µL של 0.1 molar PB לכל באר, למשך חמש דקות, תוך ערבוב נמרץ על רוקר בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, דגרו את החתכים בתמיסת חסימה תוך ערבוב עדין למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן המשיכו לדגורות עם הנוגדן הראשוני והנוגדן המשני. לאחר שטיפה סופית ב-pb, השתמשו במיקרו-פיפטה מקוצצת שעברה טיפול ב-FBS כדי להעביר את החתכים לסמפיסליות. סדרו את החתכים באמצעות מכחול וספגו לחות עודפת תוך הימנעות מחשיפה לאור.דגרו את השקופיות בטמפרטורת החדר כדי לייבש את החתכים על פני השטח למשך 5 עד 30 דקות. לאחר הייבוש, טפטפו מספר טיפות של מדיום סגירה (mounting medium) ובצורה איטית הניחו כיסית זכוכית מעל החתכים.השאירו את השקופיות בחושך למשך חמש דקות ולאחר מכן אטמו את קצוות זכוכית הכיסויה בעזרת לק שקוף. לפני הצילום, לאחר הפשרת השקופיות בטמפרטורת החדר, השתמשו בטוש למחסום הידרופובי כדי להקיף את האזור בשקופית המכיל את חיתוכי העצם, ולאחר מכן ייבשו באוויר למשך 10 עד 15 דקות. בעזרת פיפטה, הכניסו 250 µL של 0.1 M PB אל תוך האזור ושטפו את חיתוכי העצם למשך חמש דקות.שפכו את ה-PB על ידי הטיית השקופיה וחזרו על הפעולה פעמיים נוספות. לאחר מכן, מרחו 250 µL של תמיסת חסימה (blocking solution) והדגירו את החתכים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C. לאחר החסימה, המשיכו לדגירה עם הנוגדן הראשוני והנוגדן המשני, תוך הקפדה להשאיר את השקופיות בתא לח (humidified chamber) במהלך דגירות הלילה.לבסוף, שטפו עם 500 µL של PB בריכוז 0.05 M למשך 15 דקות. בטמפרטורת החדר, טבלו את השקופיות לזמן קצר במים מזוקקים ודה-יוניים לשטיפה, ולאחר מכן הניחו לחתכי העצם להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 30 דקות, תוך הימנעות מחשיפה ממושכת לאור. מרחו מדיום קיבוע והניחו כיסוי זכוכית על החתכים לאחר שהשקופיות עמדו בחושך למשך חמש דקות.אטמו את קצוות כיסית הזכוכית באמצעות לכה לציפורניים תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפיגלובית. ניתן לראות כאן סיבים רבים חיוביים ל-CGRP ו-NF 200 כאזורים אדומים המפוזרים לאורך קרומי הבסיס במעבר שבין האפידרמיס לדרמיס באזור כף הרגל, אשר נצבעו ב-anti collagen four בירוק; סיבים חיוביים ל-CGRP ו-NF 200 באזור כף הרגל נראים גם במיקרוסקופיה קונפוקלית, שוב באדום, כפי שמוסומן על ידי ראשי החצים. בעוד שהסמן הפנ-נוירונלי beta three tubulin מבוטא באופן נרחב באזור כף הרגל.צביעת TRPV1 מוגבלת בעיקר לסיבים בעלי קוטר קטן שהם גם חיוביים ל-CGRP; ניתן לזהות סיבים חיוביים הן ל-CGRP והן ל-NF200 ברקמת עצם של גפה, כפי שמוצג כאן, המפוזרים ברחבי המטריקס של העצם באזור הראש הספוגי של פמור בעכבר, בצבע אדום, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi-fluorescent) וקונפוקלית. TRPV1 נוכח גם ברקמת עצם של גפה, המוצגת כאן באדום באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, והוא נמצא במיקום משותף (co-localizes) עם anti-CGRP בירוק.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק תובנות על המאפיינים האנטומיים של העצב sensory הפריפרי בעשויות כגון עור ועצם, וכן על ביטוין ומיקומן של חלבונים שונים בתוך סיבי העצבים הסנסוריים הללו. התהליך כולו, מהניתוח ועד לאניליזה המיקרוסקופית, אמור להימשך כארבעה ימים עבור עור ו-11 ימים עבור רקמת עצם.

tissue-preparation-immunostaining-mouse-sensory-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית של סיבים כולינרגיים בגרעין הבסיסי של אזור מיינרט של מקטעי מוח של עכבר. הקטעים נחסמים ומטופלים בראשוני כנגד כולין אצטילטרנספראז, ואחריו נוגדנים משניים ביוטיניליים. מתווספים קומפלקסים של אבידין-ביוטין-פרוקסידאז, הנקשרים לנוגדנים משניים, ואחריהם המצע הכרומוגני. לאחר מכן החלקים מיובשים ומורכבים לפני ההדמיה מתחת למיקרוסקופ.

צביעה אימונוהיסטוכימית של סיבי עצב בגרעין הבסיסי של מיינר במוח העכבר

מקור:  Boyer, N. P. et. al., הדמיה וניתוח של הובלת נוירופילמנטים בעצב השוק של עכבר שנכרת. J. Vis. exp.} (2020)}{{}}}סרטון זה מדגים את שיטת הפוטו-אקטיבציה הפלואורסצנטית לניתוח הובלת נוירופילמנטים באקסונים מיאליניים של עצבים היקפיים. על ידי מעקב אחר נוירופילמנטים ירוקים מתויגים בפלואורופור, הטכניקה מספקת תובנות לגבי הובלה אקסונלית במחלות ניווניות.

הדמיית פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית של הובלת נוירופילמנטים באקסונים של עכברים עם מיאלין 

הפרוטוקול להדמיה אורך דינמית ונגע לייזר סלקטיבית של קצות עצבים בעכברים מהונדסים כתב מוצג.

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

עצב סנסורי שרירים מעורב באיתות proprioceptor וגם לדווח על אירועים ממלכתיים ופציעה קשורה חילוף חומרים. אנו מתארים עכבר בוגר בהכנת שריר עצבים מבחנה ללימודים בafferents שרירים מופעל מתיחה.

במבחנה עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

כאן אנו מתארים הכנה חדשה להדמיית מסופים חושיים חיים של קצות מעקה המעצבבים את זקיקי השיער של עור אוזן העכבר במהלך צביעה והימנעות בצבעי סטיריל פירידיניום.

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

מאמר זה כולל פרוטוקולים מפורטים לתיוג גנטי של עור עכבר, ניתוק עצבים כירורגי, ביופסיית עור והדמיה של אפיתל מסומן על ידי צביעת β-גלקטוזידאז שלמה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי לבדוק את הדרישה לעצבים במודלים של עכברים בעלי עור רגיל ופתולוגי.

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

מחקר זה יוצר מודל ניסיוני של נוירופתיה טהור סיבים קטנים עם resiniferatoxin (RTX). מנה ייחודית של RTX (50 µg/kg) היא אופטימלית לפיתוח מודל נוירופתיה סיבים קטנים המחקה מאפייני המטופל יכול לעזור לחקור את המשמעות nociceptive המולקולרי שבבסיס כאב נוירופתי.

הקמת מודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים טהור עם אגוניסט Ultrapotent פוטנציאלי קולטן ארעי Vanilloid סוג 1

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמחיש ומבנים של העצבים ההיקפיים על ידי קבלת מכתימה את סעיפים 1-2 מיקרומטר עם טולדין...

טולדין כחול מכתים סעיפים שרף-מוטבע להערכת המורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית

אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

עובי חלקי הרקמות הגביל את המחקר המורפולוגי של העצבנות של העור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי רקמות ייחודית להדמיית סיבי עצב עוריים בחתכי רקמה עבים של 300 מיקרומטר תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית.

הדגמת עצבנות עור שעירה וגלברוסית בתבנית תלת-ממדית באמצעות גישות מרובות של כתמים פלואורסצנטיים וניקוי רקמות

כתב יד זה מציג פרוטוקול להסרה כירורגית של תאי עצב סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. הליך זה יאפשר מספר רב של מחקרים שמטרתם לחקור את התפקיד של עצבוב סימפתטי במטרות רקמות דיסטליות.

כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים

למדו טכניקת אימונוסטיינינג לזיהוי סיבי עצב תחושתיים הפריפריים בעכברים. השיטה מאפשרת חקר ביטוי חלבונים ודפוסי עצבוב בעור ובעצמות גפיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

גלה סרטונים נוספים