דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת שינויים בקולטני ניקוטין Tag פלואורסצנטיים במוח עכבר עם יישום ניקוטין כרוני. זה מושג על ידי השתלה ראשונה של עכברי אלפא ארבע YFP עם מיני משאבות אוסמוטיות מלאות במי מלח או ניקוטין. לאחר הטיפול, המיסה הפנימית של קארדי תוקנה והמוח נחתך בהקפאה.

לאחר מכן, המוחות החליקים של הכיסוי מצולמים באמצעות מיקרוסקופיה ספקטרלית ומוקדית. השלב האחרון של ההליך הוא ספקטרלי ליניארי על ערבוב וניתוח של רמות ביטוי אלפא ארבע YFP. בסופו של דבר, התוצאות מראות את היכולת של מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית ולינארית על ערבוב לכמת במדויק את הוויסות של תת-יחידות קולטן כולין ניקוטין אלפא ארבע YFP ברזולוציה תת-מיקרונית בנוירונים במוח העכבר שנחשפו לניקוטין כרוני.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון נוגדנים או גוף רדיוליגנד, הוא שה-Y FPS מקודד גנטית כדי להיות מחובר לקולטן, ובכך מאפשר הדמיה ישירה ומדויקת יותר של קולטן התג. זה מקל על הדמיה תת-תאית ברזולוציה גבוהה של לוקליזציה של קולטנים בנוירונים של מערכת העצבים המרכזית ומונעים. כל בעיה פוטנציאלית של ספציפיות בדיקה, צביעה לא אחידה או גישה לאנטיגנים בשכבות עמוקות של הרקמה.

שידגים את ההליך יהיה אנתוני rda, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי לאחר הסרת המוח שתוקן על ידי זלוף אינטרסיקל, חתך את המוח הקטן עם סכין גילוח. הניחו טיפה קטנה של תרכובת הרכבה בתחתית התבנית מתחת למוח והניחו את המוח בתבנית הטבעה מפלסטיק עם הצד הרוסטרלי כלפי מעלה. לאחר מכן מניחים את התבנית בקרח היבש.

לאחר שהמוח קפוא בכיוון הנכון, מלאו את שאר התבנית בתרכובת הרכבה. לאחר מכן, השתמש בקריוסטט כדי לאסוף חלקי מוח בעובי 30 מיקרון. העבר את החלקים לשקופיות מצופות באמצעות שתי מברשות צבע עדינות.

זכור להגן על חלקי המוח מפני אור על ידי כיסוי תמיד במכסה מגש שקופיות. אחסן את חלקי המוח בקופסאות שקופיות המכילות אבן סידן גופרתי נטולת מים אחת. קופסת השקופיות צריכה להיות בשקית אטומה של Ziploc כדי למנוע לחות ושריפת מקפיא לאחר מכן כאשר היא מאוחסנת במינוס 20 מעלות צלזיוס.

ודא שלשקופיות יש חשיפה מינימלית לכל מקור אור כדי למזער את הלבנת הצילום לפני ההדמיה. על ידי שמירתם מכוסים במכסה מגש השקופיות, ניתן לחתוך את קצה הפיפטה כדי לסייע בהפחתת היווצרות הבועות בעת החלקת הכיסוי. השתמש במדיום הרכבה שאינו מעכב פלואורסצנטיות של חלבון פלואורסצנטי, כגון MO Wild 4 88.

ודא שהמו מתאזן לטמפרטורת החדר לפני החלקת הכיסוי. על מנת למנוע החלקה של בועות אוויר, אזור המוח מחליק אחד בכל פעם. אל תשתמש בליטוש ציפורניים כאשר הכיסוי מחליק מכיוון שהוא מרווה.

פלואורסצנטי YFP. אסוף תמונות של אזורי מוח באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי, המאפשרת כימות מדויק מאוד של פלואורסצנטיות YFP אפילו ברקמה עם רמות משמעותיות של אוטופלואורסצנטיות. כדי לבצע פירוק ספקטרלי ליניארי על תמונה לדוגמה שצולמה במיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי, יש לרכוש תחילה ספקטרום ייחוס הן עבור YFP והן עבור אוטופלואורסצנציה של רקמות.

ראשית, השג ספקטרום ייחוס גבוה של אות לרעש פלואורסצנטי על ידי הדמיית קו תאים מסיס YFP באמצעות קו לייזר 4 88 ננומטר. לאחר מכן, באמצעות אותו קו לייזר, השג ספקטרום ייחוס אוטופלואורסצנטי באזור המוח הרצוי מקטע מוח של עכבר מסוג פראי. לאחר קבלת תמונה קונפוקלית ספקטרלית מאזור במוח מעכבר אלפא ארבע YFP, העבר את התמונה לאותות YFP ו-auto fluorescence על ידי יישום אלגוריתם ביטול ערבוב ספקטרלי ליניארי המשתמש בספקטרום הייחוס של YFP ושל עכבר מסוג פרא מאותו אזור במוח.

פתח את תמונת האלפא ארבע YFP הלא מעורבת בתוכנת ניתוח תמונות כגון Image J, ולאחר מכן חשב את עוצמת הפיקסלים הממוצעת עבור אזור העניין. חזור על אותו ספקטרל ליניארי וערבוב וניתוח לתמונה ספקטרלית ומוקדית מאותו אזור במוח של עכבר מסוג פרא כדי לקבל ערך שיורי ברקע. כעת ניתן להשיג את עוצמת האלפא ארבע YFP המתוקנת על ידי הפחתת הערך השיורי הממוצע של הרקע הממוצע על פני שלושה עד חמישה עכברים מסוג בר מערך האלפא הלא מתוקן ארבע YFP המוצג כאן הוא הקרנת צבע אמיתית של ערימת למבדה של הקולרי המדיאלי מעכבר אלפא ארבע YFP שצולמו עם מיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי של Nikon C one si להלן מוצגות עלילות ספקטרום מאזור של עניין, הכולל אלפא ארבע YFP המכיל נוירונים בירוק עם שיא YFP מובהק ב-5 27 ננומטר, ואזור עניין מחוץ ל-ULA המדיאלי באדום, חסר הפרדת שיא YFP של אותות YFP ואוטופלואורסצנציה אפשרי באמצעות פירוק ספקטרלי ליניארי באמצעות ספקטרום הייחוס של המוח YFP ו-Wildtype Autofluorescence המניב תמונה לא מעורבת של אלפא ארבע YFP ותמונה לא מעורבת אוטופלואורסצנטית המוצגת להלן הם החופפים באופן משמעותי ספקטרום ייחוס YFP ו-Autofluorescence המשמש לפירוק בירוק וצהוב בהתאמה באמצעות ויסות מוגבר של מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית של קולטני אלפא ארבע ניקוטין אצטילכולין בהיפוקמפוס של עכברי אלפא ארבע YFP שנחשפו לניקוטין כרוני ניתן לראות כאן במונטאז' אריחים של פלואורסצנטי אלפא ארבע YFP מההיפוקמפוס.

שני אזורי הבחירה הם המיקומים המשוערים על הגפה התחתונה של נתיב הפרנט שבהם בוצעו ניתוחים עבור כל עכבר. הקרינה של אלפא ארבע YFP הייתה גבוהה משמעותית בנתיב הפרנט של עכברים שנחשפו לניקוטין כרוני ולא למי מלח כרוניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה ברורה כיצד לדמות שינויים בקולטני ניקוטין אלפא ארבעה YFP במוח עכבר עם מתן ניקוטין כרוני על ידי ידיעה כיצד לתקן קטע קריו אחד, מוח העכבר ושתי תמונות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית ותמונות ספקטרליות ומעורבות ליניאריות מקטע המוח.

ניתן ליישם ולהרחיב מושגים בסיסיים אלה גם לחקר הביטוי של תעלות יונים וקולטנים אחרים.