תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד את קינטיקת האינטראקציה בין רצפטור לליגנד כאשר שני המולקולות מעוגנות על פני השטח של התאים המתרחבבות. זאת מושג תחילה על ידי פונקציונליזציה של תאי הדם האדומים, המשמשים כחיישני הדבקה, באמצעות ליגנדים, והכנת תאים הנושאים רצפטורים. כשלב שני, מורכב תא מיקרו-פיפט ומבוצעים מבחני הדבקה כדי לתעד את אירועי ההדבקה.

בשלב הבא, שורטט עקום של הסבירות להיצמדות אל מול זמן המגע של התאים, והוא הותאם למודל. על מנת להעריך את פרמטרי הקינטיקה, התקבלו תוצאות המראות זיקה קישורית אפקטיבית דו-ממדית וקצב ניתוק (off rate) שהוערכו מתוך הנתונים. אם כן, מאיפה מגיע הרעיון לבדיקה זו?

חוקרים בוחנים אינטראקציות בין רספטור לליגנד. ברוב המקרים מודדים כוחות קריעה, ואנו עושים את אותו הדבר, אך יום אחד חשבנו האם נוכל פשוט למדוד תוצאה בינארית: אפס עבור חוסר הידבקות ואחד עבור הידבקות, ולהסיק מהמדידות של אפס ואחד הללו את המדידה עבור קינטיקה, כדי להציג את בדיקת התדירות במיקרו-פיפט. ד"ר Veronica Zana Zina, מדענית מחקר במעבדתי, תדגים עבורכם את הניסוי.

תאי דם אדומים שבודדו מדם שלם עוברים ביוטיניציה עבור בדיקת תדירות ההיצמדות. כדי להתחיל בהליך זה, סובב בצנטריפוגה את המבחנה המכילה את תאי הדם האדומים המבודדים, העבר מנתים של 10 µL של משקע תאי הדם האדומים לכל אחת ממספר מבחנות והוסף לכל מבחנה את כמות ה-PBS המתאימה כדי להכין ריכוזים שונים של ביוטיניציה של תאי דם אדומים. לאחר מכן, הוסף 10 µL של באפר בורה (borate buffer) בריכוז 0.1 M לכל מבחנה.

לאחר מכן, הוסיפו כמות מחושבת של תמיסת ביוטין לכל מבחנה וערבבו מיד באמצעות וורטקס. למשך מספר שניות, הניחו כל מבחנת תאי דם אדומים בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter והדגירו על רוטטור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, הוסיפו באפר EAS 45 לכל מבחנה וסבבו בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-2000 rotations per minute. חזרו על השטיפה עם באפר EAS 45 פעמיים, לסך הכל שלוש שטיפות.

לבסוף, הוסיפו 100 µL של בופר EAS 45 לכל מבחנה ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C כדי להפעיל את הליגנדים על פני השטח של תאי הדם האדומים. לאחר שהופעילו בשלב הקודם, מדגגרים את תאי הדם האדומים עם ריכוז רווי של strep TTR למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, ושוטפים שלוש פעמים עם בופר EAS 45 למשך שתי דקות במהירות של 2000 rpm. לאחר מכן, מדגגרים את תאי הדם האדומים ישירות עם הליגנד הביוטינylated, או מדגגרים את תאי הדם האדומים עם הנוגדן הלוכד הביוטינylated המתאים, ולאחר מכן מדגגרים עם הליגנדים. הפרוטוקול המוצג בסרטון זה משתמש בנוגדן הלוכד הביוטינylated.

מיקרופיפטים מיוצרים באמצעות צינורות קפילריים מזכוכית בורוסיליקט בעלת נקודת התכה גבוהה. ראשית, השתמש במכשיר משיכה למיקרופיפטים (micro pipette puller) כדי למשוך את הצינורות הקפילריים. לאחר מכן, השתמש במיקרו-מניפולטור עם מיקרו-פורג' (micro forge) כדי לחתוך את קצה המיקרופיפט עד להשגת גודל הפתח הרצוי.

הקוטר הנדרש נע בדרך כלל בין מיקרון אחד לחמישה מיקרונים, תלוי בגודל התאים שייעשה בהם שימוש במחקר. כדי להכין את תא התאים, השתמש בשתי פיסות של זכוכית כיסוי למיקרוסקופ שנגזרו לגודל הרצוי, נקה את האבק מלוחיות הכיסוי באמצעות סורק אוויר, הוסף את מצע תא התאים ואטום את התא באמצעות שמן מינרלי משני הצדדים כדי למנוע התאדות של המצע. הדבר ישנה את האוסמולריות במהלך הניסוי.

מערכת המיקרו-פיפט ששימשה בבדיקה זו מורכבת משלוש תתי-מערכות: תת-מערכת דימוי לצפייה, הקלטה וניתוח של תנועות התא שנשאב לתוך המיקרו-פיפט, תת-מערכת למיקרו-מניפולציה המאפשרת בחירה של תאים מתוך תא התאים, ותת-מערכת לחץ לשאיבת התאים לתוך המיקרו-פיפטים. הרכיב המרכזי של תת-מערכת הדימוי הוא מיקרוסקופ הפוך עם עדשה להטבלה בשמן של 100 פעמים. תמונות מהעדשה מזוהות על ידי מצלמת CCD ונשלחות למקלט וידאו.

טיימר וידאו מחובר למערכת לצורך מעקב אחר הזמן. לאחר מילוי המיקרו-פיפט במים דה-יוניים, מקם אותו במחזיק שלו על גבי הנעה מכנית המותקנת על המיקרוסקופ. ניתן למקם את המיקרו-פיפט בדיוק גבוה באמצעות מיקרו-מניפולטור הידראולי בעל שלושה צירים.

אחד מתומכי המיקרופיפט מותקן על מתרג פ piezoelectric מתוכנת במחשב. הדבר מאפשר להזיז את הפיפט בדיוק רב ובמחזור של בדיקת היצמדות. תת-מערכת ויסות הלחץ משמשת לשליטה על היניקה.

במהלך הניסוי, קו הידראולי מחבר את מחזיק המיקרופיפטה לממאגר נוזלים. מיקומן המכני עדין מאפשר מניפולציה מדויקת של גובה הממאגר. לאחר הרכבת התא, מכוונות המיקרופיפטות, מזריקים את התאים אל התא כדי להתחיל את הבדיקה, שואבים את התאים המתרגלים באמצעות הפיפטות המתאימות, ומשתמשים במתרגם החשמלי PSO כדי להניע את תאי הדם האדומים פנימה והחוצה ממגע עם הנויטרופיל, תוך בקרה על שטח המגע וזמן המגע.

אירוע הידבקות נצפה כאשר תא דם אדום מתארך בעת הפרדת התאים; אירוע של אי-הידבקות תואם להיעדר התארכות של תא הדם האדום. רשמו את אירועי ההידבקות שנצפו על ידי הוספת המספר 1 עבור הידבקות או 0 עבור אי-הידבקות, בעמודה בגיליון אקסל (Excel).

הקליטו את עקומת תדירות ההיצמדות אל מול זמן המגע תוך שימוש בלפחות שלושה זוגות תאים שונים עבור כל זמן מגע. כדי לקבל ממוצע ו-SEM כביקורת, הקליטו את עקומת הקשירה הבלתי ספציפית באמצעות תאי דם אדומים מצופים בליגנדים רלוונטיים ו/או חסימה של הליגנדים או הרצפטורים באמצעות חסימה פונקציונלית ספציפית שלהם. באמצעות נוגדנים מונוקלונליים, ניתן לחשב את תדירות ההיצמדות הספציפית בכל נקודת זמן של המגע על ידי הסרת תדירות ההיצמדות הבלתי ספציפית.

הנתונים של תדירות ההיצמדות הספציפית לעומת זמן המגע מותאמים למודל הסתברותי המתאר אינטראקציית שלב בודד מסדר שני קדימה ומסדר ראשון לאחור בין סוג אחד של רצפטורים לסוג אחד של ליגנדים. במשוואה זו, KA הוא הזיקה הדו-ממדית (2D affinity). KA הוא קצב הניתוק הדו-ממדי (2D off rate).

MR ו-ML הם צפיפויות הרצפטור והליגנד בהתאמה, ו-AC הוא שטח המגע. להתאמת העקומה יש שני פרמטרים, ac, k, a, ו-K off, שכן AC ו-KA מאוגדים יחד ונקראים באופן קולקטיבי זיקה דו-ממדית אפקטיבית; המכפלה שלהם עם קצב הניתוק היא קצב הקישור הדו-ממדי האפקטיבי AC K on השווה ל-AC KA כפול K off. מוצג כאן דוגמה לקביעה של אינטגרין אלפא L בטא שתיים.

צפיפות אתרים על נויטרופילים. נויטרופילים דגרו תחילה עם 1 µg/mL של E selectin IG, ולאחר מכן עם ריכוזי רוויה של anti-human CD 11 המשורש ל-PE, נוגדן מונוקלונלי, או IgG 1 של עכבר רלוונטי כביקורת. לאחר דגירה של 30 דקות, הדגימות נשטפו ונמדדו בציטומטר זרימה עם כמות סטנדרטית.

חרוזי כיול PE בהירים. פאנל A מציג היסטוגרמות פלואורסצנציה של חרוזי כיול יחד עם אלו של תאים שעובדו או שלא עובדו עם E selectin IG. צביעה ספציפית של נוגדן מונוקלונלי CD 11 A מוצגת בעקומות רציפות, וצביעה של נוגדן בקרת איזוטייפ תואם רלוונטית מוצגת בעקומות מקווקוות.

פאנל B מציג את תהליך כימות הצפיפות. חושב Log 10 עבור עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של כל אחד מארבעת החרוזים. ערך שיא הכיול מפאנל A ועבור מולקולות PE לכל חרוז הספציפיות לסדרה.

בוצעה רגרסיה ליניארית של log 10 של מולקולות PE לכל חריזה אל מול log 10 של פלואורסצנציה עבור תאים פולשים שנבחרו מחדש. ערך ה-Log 10 fi הוא 3.99, המסומן בעיגול כחול מלא, ו-2.23, המסומן בעיגול כחול פתוח, עבור הנוגדן המונוקלונלי הספציפי והנוגדן לשליטה, בהתאמה. כאשר נפתרה המשוואה הליניארית עבור X, חושב המספר הכולל של alpha L beta two או נויטרופילים כ-9,587.

צפיפות פני השטח חושבה ל-43 אתרים למיקרון רבוע, תוך שימוש ב-8.4 מיקרון כקוטר הנויטרופיל. הגרף הבא מראה את תדירות ההיצמדות המצטברת fi עבור קישור ספציפי בשנייה אחת וב-10 שניות. זמני מגע שנמדדו ממחזורי בדיקת היצמדות חוזרים בין תאי דם אדומים מצופים ב-ICAM one לנויטרופילים אנושיים המבטאים אינטגרין alpha L beta two.

בניגוד לכך, מוצג כאן תדר ההיצמדות הניגף fi עבור קישור לא ספציפי בזמני מגע של שנייה אחת ועשר שניות, שנמדדו ממחזורי בדיקת היצמדות חוזרים בין תאי דם אדומים מצופים ב-IgG אנושי לבין נויטרופילים אנושיים המבטאים אינטגרין alpha L beta two. גרף זה מדגים את קינטיקת הקישור של I A one לאינטגרין alpha L beta two של הנויטרופילים; הסתברויות ההיצמדות שנמדדו עבור שלושה זוגות תאים בכל זמן מגע חושבו כממוצע ושורטטו אל מול זמן המגע כדי לשלוט על קישור לא ספציפי. נעשה שימוש בשני תנאים שונים.

תאי דם אדומים מצופים בנוגדן לכידה anti-TFC שincubated עם human IgG במקום ICAM-1 Ig, ושני נויטרופילים הנקשרים לתאי דם אדומים שאינם מצופים בנוגדן הלכידה. קישור לא ספציפי שתועד כעקומת בקרה של human IgG שימש להשגת עקומת הסתברות להיצמדות ספציפית. נעשה שימוש במשוואה שהוצגה בעבר לתיקון קישור לא ספציפי.

עקומת הסבירות המתוקנת להיצמדות ספציפית הותאמה למודל ההתאמה. עקומת הסבירות להיצמדות ספציפית הניבה את זיקת הקשירה האפקטיבית. CKA שווה ל-1.4 × 10⁻⁴ µm⁴ ו-koff שווה ל-0.3 s⁻¹.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן מדידת קינטיקת האינטראקציה בין קולטן לליגנד כאשר שני המולקולות מעוגנים על פני השטח של תאי האינטראקציה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי בבדיקות הראשוניות, טווח צפיפות הליגנדים צריך להיות כזה שההדבקה תהיה בטווח הבינוני, וכן לזכור כי עבודה עם דם וחלק מהריאגנטים לטיפול ספציפי, למשל, sodium azide ו-DMSO, עלולה להיות מסוכנת ביותר. לפיכך, נדרשים אמצעי זהירות כגון קריאה מדוקדקת של ה-MSDS של הריאגנטים וחבישת כפפות במהלך ביצוע הפרוצדורה.