Name: גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למדו לגדל נוירונים סימפטטיים מתורבתים מגנגליון צווארי עליון בעכברים ולהשפיע על צמיחת הדנדריטים באמצעות BMP-7 או Matrigel. שיטה זו מאפשרת חקר מורפוגנזה עצבונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מן המכון הלאומי לבריאות (מענקים R21 ו R01 NS45037 ES014901).

<ol><li>Purpura, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurpura%2C+DP+%22The+Neurosciences%3A+A+Study+Program%22">The Neurosciences: A Study Program</a>. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).</li>
<li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+changes+in+mammalian+sympathetic+neurons+following+interruption+of+their+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons.</a> J. Physiol. 252, 429-463 (1975).</li>
<li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurves%2C+D+%22A+Trophic+Theory+of+Neural+Connections%22">A Trophic Theory of Neural Connections</a>. , Harvard University Press. (1988).</li>
<li>Miller, J. P., Jacobs, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+neuronal+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Relationships between neuronal structure and function.</a> J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).</li>
<li>Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+specificity+and+long-term+information+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse specificity and long-term information storage.</a> Neuron. 18, 339-342 (1997).</li>
<li>Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+year+of+the+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The year of the dendrite.</a> Science. 275, 178-179 (1997).</li>
<li>Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+consequences+of+abnormal+cortical+development%3A+insights+into+developmental+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities.</a> Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).</li>
<li>Connors, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+mechanisms+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Neurology%22%5BJournal%5D)">Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders.</a> Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).</li>
<li>Pardo, C. A., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology+%28Zurich%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of autism.</a> Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).</li>
<li>Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurodevelopmental+disorders%3A+meeting+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse.</a> Science. 302, 826-830 (2003).</li>
<li>de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+and+dendritic+analysis+of+fascia+dentata+granule+cells+in+human+aging+and+senile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia.</a> Brain Res. 402, 217-229 (1987).</li>
<li>Flood, D. G., Coleman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+plasticity+in+normal+aging+and+decreased+plasticity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease.</a> Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).</li>
<li>Jagadha, V., Becker, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology%3A+an+overview+of+Golgi+studies+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man.</a> Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+I.+Conditions+under+which+neurons+form+axons+but+not+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites.</a> Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).</li>
<li>Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+promote+dendritic+development+in+rat+sympathetic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro.</a> Glia. 1, 380-392 (1988).</li>
<li>Lein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+extracellular+matrix+and+osteogenic+protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).</li>
<li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15, 597-605 (1995).</li>
<li>Lein, P. J., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+a+basement+membrane+extract+have+different+effects+on+axonal+and+dendritic+outgrowth+from+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro.</a> 136, 330-345 (1989).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).</li>
<li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-5+%28BMP-5%29+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li>
<li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+%28BMPs%29+and+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

היתרונות של מודל זה הם: (א) תרבויות מורכבות של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים אוהדים חסרי סוגי תאים אחרים 17,23 (ב) גורם הגדילה הדרישות של נוירונים הם אוהדים מבוססת היטב, אשר מאפשר את השימוש בינוני מוגדר, וכן מגוון של כלי התקשורת מוגדרים, מצעים לעבוד היטב לגידול ושמירה על נוירונים אוהדים 23 (ג) הנוירונים בתרביות אלה מגיבים באופן אחיד לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של DPP ו 60A subfamilies 17,18,20,21, ו (ד) Matrigel או BMP-In...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> זכוכית coverslips </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 עגול מ&quot;מ coverslip # 1 עובי, זכוכית הגרמני </td></tr><tr><td> בנט עצה pipets </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-D-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P0899-100 מ&quot;ג </td><td> המניות פתרון 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מים מזוקקים </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> בסדר מלקחיים Dumont לא. 4 ו 5 </td><td> מדע כלים עדינים (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 מד מחטים </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> ליבוביץ של L-15 בינוני </td><td> Invitrogen </tד&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> וורטינגטון </td><td> 4176 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> רוש </td><td> 04942078001 </td><td> 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> האנק של פתרון מאוזן מלח (-Ca, מ&quot;ג) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM נמוכה לגלוקוז </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> אינסולין / transferrin / סלניום </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100x </td></tr><tr><td> שומן חומצה חינם BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> הרלן Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> חם בינוני F-12 מזין (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><tד&gt; </td></tr><tr><td> ציטוסין arabinoside </td><td> סיגמא </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> למנוע הופעה חוזרת של ההקפאה, ההפשרה מחזורי </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D מערכות Curis, Inc </td><td> 345-BP BMP7-07H </td><td> BMPs 4, 5 ו - 6 עובדים באותה מידה כמו גם BMP-7 ו לפעמים יותר קל להשיג באופן מסחרי </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> דיג </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר נגד עכבר MAP2 נוגדן </td><td> שטרנברג Monoclonals בע&quot;מ </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 546 עז נגד העכבר </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> הרכבה התקשורת </td><td> להאריך את בדיקות Antifade ערכת מולקולרית </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

הצורה של הדנדריטים ארבור קובע את הקלט הסינפטי הכולל תא עצב יכול לקבל 1-3, ומשפיע סוגי והפצה של תשומות אלה 4-6. דפוסי שינה של צמיחה הפלסטיות דנדריטים והן קשורות עם תפקוד לקוי neurobehavioral במודלים ניסיוניים 7, והם חשבו לתרום סימפטומים קליניים שנצפה בשתי 8-10 הפרעות התפתחותיות ומחלות ניווניות 11-13. תצפיות אלו מדגישים את החשיבות התפקודית של ויסות בדיוק מורפולוגיה הדנדריטים, וסבורים כי מנגנוני זיהוי השולטים הצמיחה הדנדריטים לא רק לקדם את ההבנה של כמה עצבי קישוריות מוסדר במהלך התפתחות תקינה, אבל עשויה גם לספק תובנות על אסטרטגיות טיפולית חדשנית למחלות נוירולוגיות שונות. מחקרים שיבדקו את המנגנונים של צמיחת הדנדריטים יהיה להקל במידה רבה על ידי זמינות Ofa מערכת מודל המאפשר נוירונים כדי לפעול באופן ניסיוני ממצב שבו הם לא להאריך דנדריטים אחד שבו הם לפרט ארבור הדנדריטים דומה לזה של עמיתיהם שלהם vivo. תרבויות העיקריות של נוירונים אוהדים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של מכרסמים סביב הלידה לספק מודל כזה. כאשר בתרבית מוגדר בינוני בהעדר מתאי גליה בסרום ו ganglionic, הנוירונים אוהדים להאריך את תהליך יחיד אשר axonal, ואת זה המדינה חד קוטבי נמשכת שבועות עד חודשים בתרבות 14,15. עם זאת, תוספת של המוךפו&quot;גנטי שהולך או עצם חלבונים 7 (BMP-7) 16,17 או 18 Matrigel עד בינוני התרבות מפעילה נוירונים אלה כדי להרחיב את התהליכים רבים העונים על קריטריונים מורפולוגיים, ביוכימיים ופונקציונלי של דנדריטים. נוירונים אוהדים הסתייגותם מן SCG של מכרסמים סביב הלידה ו שגודלו בתנאים מוגדרים הם אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים 19שמגיבים בצורה אחידה לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של decapentaplegic (DPP) ו 60A subfamilies 17,18,20,21. חשוב לציין, Matrigel-BMP ו-Induced דנדריט היווצרות מתרחשת בהיעדר שינויים הישרדות התא או צמיחה axonal 17,18. כאן, נתאר כיצד להגדיר את תרבויות הסתייגותם של נוירונים אוהדים הנגזרות SCG של חולדות סביב הלידה, כך שהם מגיבים על פעילות דנדריט, קידום סלקטיבי של Matrigel או BMPs.

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול המוךפו&quot;גנטי שהולך העצם חלבונים 7 (BMP-7) או Matrigel סלקטיבי לגרום לצמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים העיקריים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של חולדות הלידה.

צורת העץ הדנדריטי קובעת את סך הקלט הסינפטי שנוירון יכול לקבל 1-3, ומשפיעה על סוגיהם ופיזורם של קלטים אלו...

מטרת פרוצדורה זו היא לגדל נוירונים סימפתטיים כדי שניתן יהיה להשפיע על צמיחת הדנדריטים שלהם. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד הגנגליונים הצוואריים העליונים מגורי חולדה פרינאטליים בתנאים סטריליים. השלב השני הוא פירוק הגנגליונים ליצירת תרחיף של תאים בודדים, אשר נזרעים על התשתיות שהוכנו.מדיום מוגדר. לאחר מכן, לאחר טיפול בתרביות בחומר אנטי-מיטוטי כדי לסלק את התאים שאינם נוירונליים, יש לטפל בתרביות ב-BMPs או ב-matrigel כדי להשרות צמיחה דנדריטית. לבסוף, נעשה שימוש בצביעה אימונו-היסטוכימית של MAP2 כדי להדגים את הדנדריטים המוארכים של הנוירונים הסימפתטיים בתרבית.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית ראשונית של נוירונים מההיפוקמפוס, הוא האפשרות להשפיע על המצב המורפולוגי של נוירוני DYS כך שפחות מ-5% מהנוירונים בתרבית יהיו בעלי דנדריטים, או שמעל 95% מהנוירוני בתרבית יציגו צמיחה ניוריטית חזקה. כדי להכין את התרביות הנלוות של ה-SCG מגורי חולדה טרום-לידתיים ביום העוברי 19 עד 21, גלחו תחילה את בטנה של חולדה ההרה לאחר ההמתה, נקו את העור ב-70% ethanol, ולאחר מכן הוציאו את קרני הרחם בתנאים סטריליים תוך הימנעות מפגיעה במעיים או באיברים פנימיים אחרים. הניחו את קרני הרחם בתוך צלחת פטרי סטרילית בנפח 150 millimeter. לאחר מכן, העבירו את צלחת הפטרי למגש עם קרח.להרדמת גורי העוברים לצורך קטילתם, חתכו את חוט השדרה לאורך קו האמצע מתחת לכתפם. פעולה זו קוטעת גם את הווריד החלול (vena cava), מה שיפחית את הדימום מעורק התריס (carotid artery). במהלך הניתוח של ה-SCG, הניחו את העוברים במצע leibovitz's L 15 סטרילי המועשר ב-penicillin וב-streptomycin. לאחר מכן, העבירו את העוברים לצלוחית פטרי בקוטר 150 מילימטר, המלאה עד מחציתה ב-sil guard, והניחו אותם על גבם.השתמשו במחטים סטריליות בקוטר 20 gauge כדי להקבע את בית החזה והראש, תוך כדי פריסה (hyperextension) עדינה של הצוואר כדי להקל על נתיחה של ה-SCG תחת המיקרוסקופ. בצעו חתך בקו האמצע לאורך הצוואר בגובה הבריח כדי לחשוף את בלוטות תחת הלסת (submandibular glands). הסירו את הבלוטות באמצעות פינצטה עדינה כדי לחשוף את שכבת השריר.לאחר מכן חתכו את שריר הסטרנוקליידומסטואיד (sternocleidomastoid) בקרבת הבריח, תוך הרמה עדינה של שריר האומוהיואיד (omohyoid) שליד קנה הנשימה. שריר זה דק מאוד, לכן הימנעו מחיתוך עמוק מדי, שעלול לקרוע את עורק התריס (carotid artery) ואת הגנגליון הסימפתטי הצווארי (SCG) שמתחתיו. ברגע ששכבות שרירים אלו יוסרו, עורק התריס ועצב הוגוס (vagus nerve) אמורים להיות גלויים בבירור.ה-SCG נמצא ממש מתחת להתפצלות של העורק הקרוטיס. נתקו את הרקמה משני צדדיו של העורק הקרוטיס באמצעות פינצטה עדינה כדי לחשוף את הגנגליון. לאחר מכן, השתמשו בשתי פינצטות עדינות כדי לתפוס את העורק הקרוטיס מעל ומטה לעדשות הרוסטרלית והקורדלית של ה-SCG, בהתאמה.כדי להסיר את חלקו של העורק הת carotid הנמצא מעל ה-SCG, וכן את ה-SCG עצמו, סביר להניח שגם ה-noose ganglion, הנמצא לצד ה-SCG בשלב התפתחותי זה, יוסר בשלב זה. העבירו את הרקמה המבודדת לכלי תרבית סטרילי בנפח 35 מילימטר המכיל מצע L 15 ואנטיביוטיקה. לאחר מכן, הסירו את ה-SCG מכל הגוריים לפני המעבר לשלבים הבאים.בשלב הבא, הפרידו בעדינות את ה-SCG מעורק התגריר (carotid artery) ומכל רקמה אחרת. הסירו אותם במהלך הניתוח. הסירו את הקפסולה מהגנגליונים.לאחר מכן, העבירו את הגנגליונים לצלוחית סטרילית אחרת בקוטר 35 מילימטר המכילה מצע L 15. כדי לפרק את ה-SCG, הסירו את מצע ה-L 15. החליפו אותו בתמיסת hanks balance salt solution ללא סידן ומגנזיום המכילה collagenase.לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 40 דקות. לאחר מכן, העבירו את ה-SCG לפראונל צנטריפוגה סטרילי בנפח של 15 milliliters. השלימו את הנפח ל-10 milliliters באמצעות L 15 מועשר ב-BSA בריכוז סופי של 1-2 mg/mL.סבבו בצנטריפוגה ב-200 $\times$g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, השליכו את העלייה (supinate) ושטפו פעם נוספת עם L 15 המועשר ב-BSA לאחר השטיפה השנייה. הסירו את מצע ה-L 15 והחזירו את הגנגליונים לשני מיליליטר (2 mL) של תרבית.עשו תריטレーション (Trituration) לתאים כ-3 עד 4 פעמים באמצעות פיפט עם קצה כפוף ומלוטש באש. ודאו שהפיפט מצופה ב-BSAL 15 לפני התריטレーション כדי למזער את הידבקות התאים לזכוכית. הניחו לגושים גדולים לשקוע במשך כדקה אחת, ולאחר מכן העבירו את תרחיף התאים למבחנה קונית של 15 מיליליטר.לאחר מכן, הוסף מצע גידול נוסף ל-SCG שנותר ובצע טריטורציה נוספת. לאחר שהגושים שקעו, העבר את תרחיף התאים מהטריטורציה השנייה לתרחיף שנאסף לאחר הטריטורציה הראשונה. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד שהגנגליונים יתפרקו ברובם.יש להשליך כל גושים שנותרו לאחר השלישייה הרביעית עבור התאים שהופרדו מליטר אחד של גורי חולדה; יש להביא את הנפח הכולל של המצע בסבסב התאים ל-8 עד 10 milliliters. על ידי הוספת מצע גידול נוסף, השהו בעדינות את התאים באמצעות פיפטה. לאחר מכן, אספו אליקוות קטנה לצורך קביעת צפיפות התאים.כוון את נפח תרחיף התאים כדי להשיג צפיפות תאים הגבוהה פי שניים מהצפיפות הרצויה בתרבית. לאחר מכן, חלק 250 µL מתרחיף התאים לכל באער. עבור מחקרי מורפומטריה של צמיחה דנדריטית, אנו בדרך כלל זורעים תאים בלוחות בעלי 24 באערים בצפיפות נמוכה, כ-5 × 10⁴ תאים לבאער.לאחר מכן, הנח את תרביתי ה-SCG על פלטת הייבוש מפורצלן בתוך צנצנת הייבוש (desiccator) המכילה מים סטריליים. הזרק כ-120 milliliters של פחמן דו-חמצני לתוך צנצנת הייבוש לפני איטומם. לאחר מכן, הנח את כל צנצנת הייבוש בתוך אינקובטור והגדר את הטמפרטורה ל-35.5 degrees Celsius.בפרוצדורה זו, יש להזין את התרבית על ידי החלפת מחצית מהתווך 24 שעות לאחר הזריעה, ולחזור על הפעולה שלוש פעמים בשבוע כדי להסיר תאים שאינם נוירונליים מהתרבית. בשלב זה, מוסיפים בדרך כלל למצע התרבית את הסוכן האנטי-מיטוטי RRC בריכוז של 1 עד 2 µM.לאחר מכן, הוסיפו לכל באר מצע גידול טרי עם RSC וגדלו למשך 48 שעות כדי להשרות צמיחה דנדריטית, לאחר שהתאים הלא-נוירונליים הוסרו ורמת ה-RSC ירדה באופן משמעותי. ביום החמישי, הוסיפו matrigel או BMP seven למצע הגידול. לאחר מכן, השקידו את התרבית in vitro כפי שמתואר קודם לכן; כאן מוצג נוירון שגודל בתנאי בקרה, כאשר ניכר מחסור בדנדריטים כפי שעולה מהיעדר תהליכים חיוביים לאימונו-צביעה של MAP two.בניגוד לכך, נוירון זה, שנחשף ל-BMP seven, בעל מספר דנדריטים הפסועים ומגיבים חיסונית ל-map two, כפי שמוצג כאן. נוירונים סימפתטיים בתרבית היו בגידול במשך 5-7 ימים לפני הטיפול ב-BMP seven, ולאחר מכן טופלו ב-BMP seven בריכוז של 30-50 ng/mL למשך יומיים. שימו לב לתחילת הצמיחה הדנדריטית.התרבית גודלה במשך שבעה עד 14 ימים בהינעדר bmp.Seven. הן ממשיכות להפגין צמיחה אקסונלית בלבד, בעוד שתרביות שטופלו ב-BMP.Seven. בריכוז של 30 עד 50 nanograms per milliliter למשך שבעה עד 14 ימים.מראים צמיחה דנדריטית חזקה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד SCG. הכינו תרבית מפוצלת של נוירונים סימפתטיים למחקרים של מורפוגנזה נוירונלית, ובצעו מניפולציה ניסויית על צמיחת דנדריטים.

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.

פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

מחקרים עדכניים רבים זיהו מוטציות חלבונים סינפטיים הקשורים פתולוגיות במוח. ראשי נוירונים בקליפת המוח בתרבית להציע גמישות רבה לבחון את ההשפעות של מחלות אלה הקשורים חלבונים על מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

סרטון זה מדגים שיטה במבחנה ליצירת נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). hPSCs מתמיינים לתאי קרסט עצביים (NCC) על תמיכה במטריצת קרום מרתף באמצעות מדיום התמיינות. לאחר מכן ה-NCCs מנותקים ונוצרים לספרואידים באמצעות מדיום התמיינות אחר. לבסוף, הספרואידים הופכים לנוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים באמצעות מדיום נוירון סימפתטי.

יצירת נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הסרטון מדגים את ההתרבות המשותפת של נוירוני גנגליון שורש גבי (DRG) עם תאי Schwann. תאי עצב DRG גדלים תחילה על קרום מתוח מראש לצמיחה מיושרת של אקסונים. לאחר מכן מוצגים תאי Schwann, אשר נצמדים לאקסונים, מבודדים אותם ומקדמים הישרדות ותפקוד של תאי עצב.

תרבית משותפת של תאי Schwann עם נוירוני DRG על קרום מתוח מראש

סרטון זה מדגים את השימוש בתאי גנגליון שורש גבי שעברו טרנספטציה כדי לחקור שחרור נוירוטרנסמיטר על ידי גירויים עם אגוניסט קולטן נוירופפטיד.

גירוי של נוירונים חושיים של גנגליון שורש הגב באמצעות אגוניסט לקולטן נוירופפטיד

בפרוטוקול הנוכחי מציג ניסיוני ההליכים כדי להמריץ מקרופאגים בתרבית כדי להיות ניחן היכולת לשחרר מולקולרי גורמים המקדמים neurite תוצר. טיפול של מחנה לתרבויות המשנה נוירון-מקרופאג המניע את המקרופאגים לייצר בינוני ממוזגים שמחזיק neurite חזק תוצר פעילות.

נוירון-מקרופאג תרבויות שותפה להפעלת מקרופאגים הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר Neurite

אנו מתארים את הבידוד, פיזור וציפוי של התאים הראשוניים של שיניים (DP) בתאי הראשי עם מסננים (TG) נוירונים תרבותי על גבי מסנני transwell יטב. התגובות הסלולר של תאים DP ניתן לנתח עם immunofluorescence או בניתוח RNA/חלבון. אימונואופלונציה של סמנים עצביים עם מיקרוסקופ קונפוקלית מאפשר ניתוח של תגובות neurite מוצלח.

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה יציבה, בידול יעיל מאוד עבור הדור של נוירונים האוהדים הסימפתטית של האדם בתאי גזע בעלי עוצמה גבוהה. מודל זה יעשה הנוירונים זמינים לשימוש במחקרים של הפרעות אוטונומיות מרובות.

יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות

מאמר זה מתאר את הבידוד וההתלות של נוירונים אוהדים של חולדה עוברית מגנגליה צוואר הרחם מעולה. הוא גם מספק פרוטוקולים מפורטים עבור כתמים חיסוניים והכנת תמציות עצביות לניתוח ספקטרומטרי מסה.

חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי

למדו לגדל נוירונים סימפטטיים מתורבתים מגנגליון צווארי עליון בעכברים ולהשפיע על צמיחת הדנדריטים באמצעות BMP-7 או Matrigel. שיטה זו מאפשרת חקר מורפוגנזה עצבונית.

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

גלה סרטונים נוספים