Name: איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למדו לזהות תאי מלנומה מסתובבים בדם באמצעות ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית ללא תווית. השיטה מאפשרת איתור מוקדם של מטסטזות ושיפור תוצאות טיפול בחולי סרטן עור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מכירים את תמיכתם של במחלקה להנדסה ביולוגית ס כריסטופר בונד מדעי החיים מרכז באוניברסיטת מיזורי. אנו מכירים תמיכה מענק ממיזורי מדעי החיים מחקר ראשי 09-1034 ו NIH R21CA139186-0. כמו כן, אנו מודים מדעי החיים תוכנית מחקר לתואר ראשון הזדמנות באוניברסיטת מיזורי, אוניברסיטת מיזורי Core ציטולוגיה מולקולרית של אוניברסיטת מיזורי המכללה האקדמית להנדסה לתמיכה כספית.

1. דגימת דם הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר כ 10 מ&quot;ל של דם מלא של חולה סרטן שלב IV לשתי vacutainers 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך עשר דקות ב 3000 סיבובים לדקה (סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימת דם יפרידו לשלוש שכבות שונות: השכבה התחתונה כוללת את אריתרוציטים, השכבה האמצעית, המכונה גם מעיל באפי, מכיל לויקוציטים ותאי מלנומה, ואת השכבה העליונה מכיל פלסמה וטסיות. הסר כמו פלזמה כמה שיותר מבלי להפריע את המעיל באפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 250 μL של Histopaque 1077 בשני צינורות 1 מ&quot;ל Wintrobe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 9 &quot;פיפטה פסטר, לחלץ את הפלזמה הנותרים, את המעיל כולו באפי, ואפילו את השכבה העליונה של אריתרוציטים, מוודא לאסוף &lt;500 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון על גבי שכבת Histopaque ו צנטריפוגות צינורות Wintrobe ב 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל במשך 10 דקות ב 3000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדם שובנפרדים, אבל הפעם אריתרוציטים יהיו מופרדים Histopaque, המאפשר חילוץ קל של המעיל באפי. השתמש 9 &quot;פיפטה פסטר להשיג את המעיל כולו באפי ולמקם אותו צינור 2 Eppendorf מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את המעיל באפי ב 1.5 מ&quot;ל של PBS עם 2% v / v Tween 20. </li></ol> 2. לשכת תזרים בניה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל גליל אקריליק, 20 מ&quot;מ קוטר חיצוני, קוטר פנימי 17 מ&quot;מ, 8 מ&quot;מ גבוה. מקדחה three חורים בקוטר 5 מ&quot;מ דרך הצד של הגליל ב 90 מעלות זה מזה. גזור שלוש חתיכות של צינורות פולימר (1.6 מ&quot;מ קוטר פנימי, קוטר חיצוני 5 מ&quot;מ), ומניחים אותם לתוך חורים שנקדחו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתיחה Parafilm ברחבי התחתון של הטבעת אקריליק לעשות חותמת מים חזק. Parafilm טפסים קערה רדודה עם הטבעת אקריליק יקיים את הפתרון acrylamide שיהוו תא הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות חוט בקוטר 1.6 מ&quot;מ באמצעות חתיכות של צינורות כי הם מולאחד את השני, לוודא את החוט לבד גלוי דרך מרכז הטבעת. מלא את החלק השלישי של צינורות עם חוט 1.6 מ&quot;מ בקוטר בעמדה 1 שפופרת מ&quot;מ במרחק חוט תנאי. חוטים אלה מונעים acrylamide מלהיכנס צינורות. לאחר acrylamide מבצרת, את החוטים יחולצו, עוזב נתיב זרימת גלילי ומקום עמדת סיב אופטי מתמקד על נתיב הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של acrylamide מוכן [20 גרם acrylamide (Sigma Aldrich), 0.7 bisacrylamide גרם (Sigma Aldrich), 100 מ&quot;ל של מים מזוקקים] אל כוס קטנה. מדוד את 0.02 גרם של persulfate אמוניום (Sigma) ולהוסיף אותו בספל. מערבבים עם בר ומערבבים במשך 3 דקות. הוסף 20 tetramethylethylenediamene μL (פישר סיינטיפיק) עד כוס. במהירות יוצקים את התערובת לתוך הטבעת אקריליק, מילוי למעלה. לאחר מספר שניות, הפתרון יהיה ג&#39;ל, עושה עובש תא הזרימה. משוך בזהירות את החוטים החוצה, מוודא שלא להפריע את הג&#39;ל acrylamide. זרימת צ&#39;אםבער עכשיו הוא מוכן לשימוש. </li></ol> 3. Flowmetry photoacoustic הגדרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקוסטית כמה פלואוריד polyvinylidene פיזואלקטריים אקוסטי מתמר (Panametrics) לחדר זרימה באמצעות ג&#39;ל אולטרסאונד ישירות מעל נתיב הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות כידון ניל-Concelman (BNC) כבל, לחבר את מתמר לקלט של פס רחב RITEC המקלט-640A (lowpass מסנן: החוצה, highpass מסנן: 1 MHz, imput עכבה: 50 אום, הגברה: 35 dB). חבר את הפלט של המסנן כדי האוסילוסקופ (Tektronix TDS 2024B). כדי לעורר את אוסצילוסקופ, photodiode (Thorlabs) מוגדר ליד מתמר והוא פקוק לתוך אוסצילוסקופ באמצעות כבל BNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T-מחבר (חלקים קטנים) מחובר לזרוע אחת של החדר לזרום. שתי משאבות מזרק (Braintree Scientific) מחוברים בענפים אחרים של המחבר. אחת מזרק מכיל אוויר, ואילו השני יכיל את ההשעיה תא שהוכנו חלק 1. הגדר את שיעורי הזרימה100 μL / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את צינור קטן של החדר לזרום עד כיס קטן של צורות באוויר, להוסיף 1 מ&quot;מ קוטר הליבה סיב אופטי עם צמצם 0.37 מספרית בחריץ זה. ממלאים את הכיס עם מים כדי להפחית את אותות ממשק להגדיל את כמות אור לייזר להחיל נתיב הזרימה. בשל הצמצם המספרי של סיבים אופטיים מרחק קצר לנתיב הזרימה, הלייזר רק מקרינים one שבלול המדגם בכל זמן נתון, על מנת להבטיח כי מדגם ישירות מול לייזר הוא מדגם זהה יצירת אותות photoacoustic. אנרגיית הלייזר צריך להיות כ 28 mJ / 2 ס&quot;מ עם גודל נקודה של 7 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שתי משאבות מזרק ב. כאשר שני נוזלים immiscible מגיעים לצומת T-הם תחולק שבלולים הומוגנית וזרימה בעבר מתמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרינים את המדגם זבת שבריר שנייה פעמו לייזר כדי ליצור גלים photoacoustic בתאי מלנומה. כאשר המלנין הוא broadbאופטיות בולם, כל אורך גל לייזר גלוי ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אות מופיעה על אוסצילוסקופ כאשר הקליע הוא מעל מתמר, שבלול מכיל מלנומה, ויש להיות במעקב באמצעות המערכת עד נשירה לתוך בקבוקון אוסף. </li></ol> 4. Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הכדורים שנתפסו צנטריפוגה Cytospin 4 (Thermo Scientific) על מנת לתקן אותם שקופיות זכוכית. המקום שקופיות זכוכית לתוך Cytofunnels (Shandon Cytofunnel EZ יחיד עם סינון בראון כרטיס Thermo Scientific) ולטעון אותם לתוך צנטריפוגה Cytospin 4. שימי 100 μL של 1% אלבומין בסרום שור (Sigma) ב-PBS לתוך משפך, ואז כל צנטריפוגה בסל&quot;ד 600 במשך 3 דקות כדי לסייע לתאי שנתפסו להיצמד שקופיות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, מוסיפים את דגימות תאים על Cytofunnels ואז צנטריפוגות בסל&quot;ד 600 במשך 3 דקות. לאחר מכן לרסס את השקופיות עם מקבע אתנול מבוסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות PBS במשך 10 דקות פעמיים. </li><li&gt; כדי לחסום מחייב ספציפי, דגירה כל שקופית בתערובת של μL 10 סרום של עיזים (Sigma) ו 90 μL של PBS שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, למזוג את השקופיות ו דגירה עם פתרון נוגדן ראשוני שעה 1 בתא humidified בטמפרטורת החדר. כל שקופית צריכה להכיל 1% מארט-1 נוגדן וגדל ארנב, 1% CD-45 נוגדן וגדל העכבר, סרום עיזים 10%, 89% ו - PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף את שקופיות PBS במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות מודגרת מכן בתמיסה הנוגדן משנית, אשר מחויב fluorophore את הנוגדנים. התערובת מכילה עז 0.05% אנטי ארנבת הנוגדן, 0.05% אנטי עכבר נוגדן עז, עז בסרום 0.1%, ו-PBS 99%. השקופיות מודגרת בחושך במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, למזוג השקופיות להתרחץ PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים עבור גרעין, דגירה התאים עם 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של DAPI (Invitrogen) עבור1 דקה. ואז למזוג את השקופיות ולשטוף ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslip על מדגם התא באמצעות 20 μL של שרף מבוסס מדיה הרכבה לכל שקופית. החותם coverslip עם לק ברור לשמר את השקופית. עכשיו השקופיות מוכנים להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. גל photoacoustic מתאי הדם הלבנים בתאי מלנומה מוצגים כאן. כדוריות הדם הלבנות, ללא פיגמנטציה הטבועה, לא לייצר גלים photoacoustic וגלוי כמו קו ישר של רעש אלקטרוני (משמאל). בתאי מלנומה פיגמנט מייצרת גל photoacoustic חזקים (מימין). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="איור 2"/> באיור 2. מכתים לאחר immunocytochemical, בתאי מלנומה בתרבית להראות אותות DAPI ב BLue בעוד MART1 מסומן בירוק. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="איור 3"/> באיור 3. שכיסה תמונות DAPI ו MART1, כמו באיור 2, עם CD45 אינדיקטור לויקוציטים, נתון זה מראה בתאי מלנומה בקרב מספר כדוריות הדם הלבנות.

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li>
<li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li>
<li>Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry. Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. Annual International Conference of the IEEE, 2009, , IEEE. 106-109 (1985).</li>
<li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li>
<li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li>
<li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li>
<li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li>
<li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li>
<li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li>
</ol>

ג&#39;ון א Viator הוא מייסד ונשיא Viator Technologies Inc, חברה שהוקמה למסחור טכנולוגיות photoacoustic לשיפור בריאות האדם.

זיהוי CTCs עדיין שדה מחקר אינטנסיבי עם יישומים קליניים מעט מאוד עקב בעיה קשה של בידוד תאים סרטניים נדירים. טכניקות רבות אחרות, נבחנות לאיתור CTC, כולל RT-PCR, ללכוד תאים microfluidic, ללכוד immunomagnetic, ושיטות אחרות 8-12. עם זאת, זיהוי photoacoustic של מראה CMCs ההבטחה כפי שהוא התווית חופשית מספק אמצעי מהיר ומדויק כדי ללכוד קטן, קליטת חלקיקי האור. הפרוטוקול המתואר לבודד את כדוריות הדם הלבנות היא היעילה ביותר, אך מספר נמוך של כדוריות דם אדומות קיים במדגם. תאים אלה אודם לזהם גם לספוג אור הלייזר, אבל ברמה משמעותי. כדי להבטיח את כדוריות הדם האדומות לא להפריע המערכת שלנו זיהוי מלנומה, חמש דגימות החולה בריא הוצגו באמצעות המערכת ואף אחד נתן את האות, המציין כי כדוריות דם אדומות נמצאים בריכוזים נמוכים מספיק כדילהתעלם. בסדרה של מחקרים ריכוז נערכו באמצעות תאים בתרבית מלנומה ומערכת זרימת photoacoustic הוכיחה רגיש למטה לתא 1 / μL (נתונים שלא פורסמו). מחקרים אלה ללכת ובקרוב כוללים ניסויים באמצעות דגימות החולה בסרטן. טכניקה זו photoacoustic גם נבדקים לשימוש ללא פיגמנט CTCs, כגון סרטן השד וסרטן הערמונית על ידי הצמדת chromophores אקסוגניים. ביצענו עבודה ראשונית באמצעות חלקיקי זהב על סרטן cells13. בדיקות אלו הראו כי חלקיקים יכולים לספק קליטה אופטית צורך ליצור גלים photoacoustic. האתגר הטכני שנותר הוא לצרף חלקיקים כאלה תאים סרטניים באופן סלקטיבי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות flowmetry photoacoustic

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

בתאי הגידול במחזור (CTCs) הם תאים אלה, כי יש להפריד בין גידול מאקרוסקופיים להתפשט דרך מערכות הדם והלימפה גידולים משניים זרע 1,2,3. CTCs סימנים של מחלה גרורתית וזיהוי שלהם דגימות דם ניתן לאבחן סרטן ולעקוב אחר תגובת החולה לטיפול. מאז CTCs הם נדירים, המהווים כ תא אחד הגידול בקרב מיליארדי תאים דם נורמלי אצל חולי סרטן מתקדמים, זיהוי שלהם ספירה היא משימה קשה. אנחנו מנצלים את נוכחותם של פיגמנט בתאי מלנומה ביותר ליצור photoacoustic, לייזר או גלי המושרה קולי cytometer זרימה אישית עבור זיהוי של תאים מלנומה מחזורי (CMCs) 4,5. תהליך זה כרוך הפרדת דגימת דם שלם באמצעות צנטריפוגה וקבלת שכבה כדוריות הדם הלבנות. אם נוכח הדם כולו, CMCs יפרידו עם כדוריות הדם הלבנות בשל צפיפות דומה. תאים אלה הם resuspended בפוספט בופר סליין (PBS) והציג לתוך flowmeter. במקום זרימה רציפה של ההשעיה תא דם, אנו המושרה שני מדי הזרימה שלב כדי ללכוד תאים אלה למחקר נוסף. ב תזרים two שלב שני נוזלים immiscible במערכת microfluidic להיפגש בצומת לסירוגין ויוצרים שבלולים של 6,7 נוזלי. PBS מושעה בתאי הדם הלבנים טופס האוויר שבלולים microliter כי הם מוקרן ברצף עם אור לייזר. תוספת של פעילי שטח לשלב נוזלי מאפשר היווצרות כדור אחיד המשתמש יכול ליצור שבלולים בגדלים שונים על ידי שינוי שיעורי הזרימה של שני שלבים. חלזונות אוויר וחלזונות של PBS עם כדוריות הדם הלבנות מכילות בולמי אור ולכן, אינם מייצרים גלי photoacoustic. עם זאת, שבלולים של תאי הדם הלבנים מכילים אפילו CMCs יחיד לקלוט אור לייזר לייצר גלים בתדירות גבוהה אקוסטי. שבלולים אלה שיוצרים גלים photoacoustic הם מוחרם, אסף עבור מכתים cytochemical עבור verification של CMCs.

פיתחנו cytometer הזרימה באמצעות אולטרסאונד לייזר המושרה לזהות במחזור בתאי מלנומה אינדיקטור מוקדם של מחלה גרורתית.

איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הם תאים שהיפרדו מגידול מאקרוסקופי והפיצו את עצמם באמצעות מערכות הדם והלימפה כדי להקים...

מטרת הניסוי הבא היא לזהות נוכחות של סרטן לפני היווצרותם של גידולים משניים. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת וסלקציה של דגימות דם מחולי מלנומה בשלב ארבע. כשלב שני, הדם מוחדר לתא זרימה פוטו-אקוסטי, המאפשר זיהוי ובידוד של תאי מלנומה.בשלב הבא, התאים שנלכדו נסרקים באמצעות דימוי כדי לאשר את נוכחות המלנומה שזוהתה. התוצאות מדגימות את יכולתו של המערכת לזהות ולבודד תאי מלנומה באופן מדויק ומהיר, בהתבסס על צורות גל פוטואקוסטיות וטכניקות דימוי של תאים. היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות לזיהוי תאי מלנומה במחזור הדם, כגון R-T-P-C-R, מיון תאים מגנטי ביומטי ואמצעים אחרים, הוא ששיטתנו אינה דורשת סימון (label free), והיא מאפשרת לכידה של תאי מלנומה במחזור הדם ללא שינוי של פני השטח שלהם או קיבוע שלהם למצע.להכנת דגימה לזיהוי סרטן גרורתי, התחל במשיכה של כ-10 milliliters של דם מלא ממטופל עם סרטן בשלב ארבע. סבב שני מבחני vacutainer בנפח חמישה milliliters למשך 10 דקות בצנטריפוגה. במהירות של 3000 RPM, דגימת הדם תופרד לשלוש שכבות שונות. השכבה התחתונה מורכבת מהאריתרוציטים.השכבה האמצעית, הנקראת גם שכבת ה-buffy coat, מכילה לוקוציטים ותאי מלנומה, והשכבה העליונה מכילה פלזמה וטסיות דם. הסר כמה שיותר פלזמה מבלי להפריע לשכבת ה-Buffy coat. הוסף 250 µL של his opaque 10 77 לשפופרות troop של 2 mL.באמצעות פיפטת פסטל באורך תשעה אינץ', יש לשאוב את שארית הפלזמה, את כל שכבת ה-Buffy coat ואת השכבה העליונה של האריתרוציטים. יש לוודא כי נאספים פחות מ-500 µL. העבירו את התמיסה למבחנות ה-wind Trobe שהוכנו מראש.הדם יופרד שוב, אך הפעם האריתרוציטים יופרדו על ידי ה-hispa, מה שיאפשר הפקה קלה של שכבת ה-Buffy coat. השתמשו בפיפטת Pesa באורך תשעה אינץ' כדי לבודד את כל שכבת ה-Buffy coat והעבירו אותה לשפופרת eend orph של 2 milliliters. לאחר מכן, השעו אותה ב-1.5 milliliter של PBS עם 2% volume per volume בין 20.לבניית תא זרימה, התחילו עם גליל אקרילי באורך eight millimeter עם קוטר חיצוני של 20 millimeter וקוטר פנימי של 17 millimeter. לאחר מכן, קדחו שלושה חורים בקוטר five millimeter בדופן הגליל בזוויות של 90 degree זה מזה. לאחר מכן, חתכו שלוש חתיכות של צינור פולימר והכניסו אותן לחורים שנקדחו.מתחו פארה-פילם (para film) על בסיס טבעת האקרילי כדי ליצור איטום אטום למים. הפארה-פילם יצור יחד עם טבעת האקרילי קערה רדודה שתחזיק את תמיסת האקרילאמיד שתשמש כתא זרימה. השהו חוט בקוטר 1.6 millimeter דרך קטעי הצינור הנמצאים זה מול זה, תוך וידאו שרק החוט נראה דרך מרכז הטבעת אל תוך קטע הצינור השלישי.החדירו תיל בקוטר 1.6 millimeter ומקמו את המבחנה במרחק של one millimeter מהתיל התלוי. תילים אלו מונעים מחומר ה-acrylamide לחדור לתוך המבחנה. הכינו five milliliters של acrylamide.לאחר מכן, שפכו במהירות את התערובת לתוך טבעת האקריליק, עד למילוי מלא של הנפח. לאחר מספר שניות, התמיסה תהפוך לג'ל. כדי ליצור תבנית לתא זרימה, משכו בזהירות את החוטים החוצה תוך הקפדה שלא להפריע לג'ל האקרילאמיד, כך שיישאר נתיב זרימה גלילי ומקום למיקום סיב אופטי הממוקד על נתיב הזרימה.תא הזרימה מוכן כעת לשימוש אקוסטי באמצעות ג'ל אולטרסאונד. חברו מתמר אקוסטי פ piezoelectric מפוליבינילידן פלואוריד (polyvinylidene fluoride) לתא הזרימה, ישירות מעל נתיב הזרימה. באמצעות מחבר ביונט (bayonet) או כבל BNC, חברו את המתמר לכניסה של מקלט רחב-פס.חברו את מוצא המסנן לאוסצילוסקופ כדי להפעיל את הטריגר של האוסצילוסקופ. הציבו פוטודיודה בקרבת המתמר וחברו אותה לאוסצילוסקופ באמצעות כבל B NNC. משכו את הצינורית הקטנה של תא הזרימה עד שייווצר כיס אוויר קטן, וחברו אותה למתמר.לאחר מכן, הכניסו את הסיב האופטי ומלאו את התא במים כדי להפחית אותי ממשק ולהגדיל את כמות אור הלייזר המופנית לנתיב הזרימה. בשל הממספר האופטי (numerical aperture) של הסיב האופטי והמרחק הקצר לנתיב הזרימה, הלייזר יקרין בכל רגע נתון על פלח דגימה אחד בלבד, מה שמבטיח שהדגימה הנמצאת ישירות מול הלייזר היא אותה דגימה המייצרת את האותות הפוטו-אקוסטיים.בשלב הבא, חברו מחבר T לאחד הזרועות של תא הזרימה ושתי משאבות מזרק לענפים האחרים של המחבר. מזרק אחד מכיל אוויר והשני יכיל את תרחיף התאים שהוכן קודם לכן. לאחר מכן, הפעילו את שתי משאבות המזרק.כאשר שני הנוזלים המותרים מגיעים לצומת ה-T, הם יחולקו לנטיפות (slugs) הומוגניות ויזרמו על פני המתמר. הקריני את הדגימה הזורמת באמצעות לייזר בפולסים של ננו-שנייה כדי ליצור גלי פוטואקוסטים בתאי המלנומה. מכיוון שמלנין הוא בולע אופטי רחב-פס, ניתן להשתמש בכל אורך גל של לייזר בטווח הנראה.אות המופיע באוסצילוסקופ כאשר חלקה נמצאת מעל המתמר מעיד על כך שהחלקה מכילה מלנומה. עקבו אחריה דרך המערכת לפני הפלתה למבחנת איסוף. כדי להכין דגימות לצביעה אימונו-ציטוכימית, הניחו למסחות זכוכית בתוך משפכים לציטוספין והכניסו אותן למכשיר ה-cyto spin לצורך צנטריפוגה, כדי לסייע לתאים שנלכדו להיצמד למסחות הזכוכית.העבירו 100 µL של 1%BSA ב-PBS לכל משפך. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 600 RPM למשך שלוש דקות. לאחר הסבוב, הוסיפו את דגימות התאים עבור משפכי ה-CyTOF, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה במהירות של 600 RPM למשך שלוש דקות.רססו את ה슬יידים עם מקבע מבוסס אתנול. לאחר מכן, שטפו את הסליידים ב-PBS למשך 10 דקות פעמיים כדי לחסום קישור לא ספציפי. הדגירו כל סלייד עם תערובת של 10 µL של סרום עיזים ו-90 µL של PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, שפכו את התמיסה מהשקופיות והוסיפו תמיסת נוגדן ראשוני. כל שקופית צריכה להכיל 1%rabbit mark, 1%mouse CD 45 אחד ו-10%goat serum ב-PBS; הדגירו למשך שעה אחת בתא לח בניטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-PBS למשך 10 דקות, שלוש פעמים.לאחר מכן, דגרו את השקופיות בנוגדנים שניים פלואורסצנטיים מתאימים בחושך למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ושפכו את התמיסה מהשקופיות. לאחר מכן, שטפו אותן ב-PBS למשך חמש דקות, שלוש פעמים. כדי לצבוע את הגרעינים, דגרו את התאים עם 0.1 µg/mL של DPI למשך דקה אחת. לאחר מכן, שפכו את התמיסה מהשקופיות ושטפו ב-PBS.לבסוף, באמצעות תוך קיבוע מבוסס שרף, קבעו כיסוי זכוכית מעל דגימת התאים, אטמו את כיסוי הזכוכית באמצעות לק שקוף ובצעו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. צורות הגל הפוטו-אקוסטי של תאי דם לבנים ותאי מלנומה מוצגות כאן משמאל. תאי הדם הלבנים, שאין להם פיגמנטציה מולדת, אינם מייצרים גלים פוטו-אקוסטיים ומופיעים כקו שטוח של רעש אלקטרוני מימין.עם זאת, תאי מלנומה פיגמנטיים מייצרים גל פוטו-אקוסטי חזק. לאחר צביעה אימונו-ציטוכימית, תאי מלנומה בתרבית מראים אותות כתמיים בכחול; תא מסומן אחד מודגש בירוק בתמונות חפיפה עבור DPI, ותא אחד מסומן עם CD 45 כאינדיקטור ללויקוציטים. איור זה מציג תאי מלנומה בקרב מספר תאי דם לבנים לאחר פיתוחם.הטכניקה שלנו תסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הגילוי המוקדם של סרטן לחקור את תופעת הגריורה, במטרה לשפר את זיהוי הסרטן ובסופו של דבר לרפא את התפשטותו הקטלנית.

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מתאר את הטכניקה של בידוד תאי גזע שליליים וחיוביים מסוג CD133 ממלנומה מקו תאי מלנומה ראשוני באמצעות מיון תאים המופעל על ידי מגנטית. CSCs למלנומה חיובית CD133 נחקרים עוד יותר כדי להבין את המנגנונים של גידולי מלנומה.

בידוד תאי גזע מלנומה: שיטה להשגת תאי מלנומה חיוביים ושליליים CD133 באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית

בסרטון זה אנו מציגים זיהוי ציטומטרי של זרימה פוטואקוסטית של תאי סרטן השחלות הנושאים ננו-חלקיקים בתא זרימה במבחנה. טכניקה לא פולשנית זו מזהה בהצלחה תאי גידול במחזור במערכת זרימה באמצעות חומר ניגוד.

ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית במבחנה: טכניקה פוטואקוסטית לא פולשנית לזיהוי תאי סרטן שחלות נושאי ננו-חלקיקים

מאמר זה מתאר את ההכנה של רקמה המתקבלת מלנומה טרי לתרבויות העיקריות של תאים, וכיצד להסיר זיהומים של אריתרוציטים ופיברובלסטים מתאי הגידול. לבסוף, אנו מתארים כיצד...

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

אנו מתארים שתי שיטות משלימות המשתמשות באינדיקטור מחזור התא של הפלואורסצנציה (FUCCI) וניתוח תמונה או ציטומטריית זרימה כדי לזהות ולבודד תאים באזורי העצירה הפנימיים של G1 ובאזורים החיצוניים המתפשטים של ספרואידים תלת מימדיים.

ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעריך חומר משטח תכונות אופטיות באמצעות אפקט photoacoustic בשילוב עם השתקפות פנימית מוחלטת. טכניקה זו photoacoustics חלוף מבוססות בשטח שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מערכת מטרולוגיה photoacoustic להעריך עוביים 'חומרים, בתפזורת ומדדי השבירה סרט דק, ולחקור התכונות האופטיות שלהם.

חלוף שדה בהתבסס Photoacoustics: הערכת נכס אופטית על משטחים

פרוטוקול זה מתאר את היישום של זמן א-סימטרי איתור למתוח מערכת מיקרוסקופית אופטית עבור הדמיה תא בודד זרימה microfluidic מהירים ויישומים שלה cytometry זרימת הדמיה.

Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

פרוטוקול מוצג כדי לזהות במחזור תאים סרטניים בשחלות ניצול מערכת מותאמת אישית של הזרמת פוטואקוסטית וממוקד חומצה פולית-הכתיר נחושת גופרתי.

סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה Cy, לנסות

מאמר זה מתאר זרימת עבודה של טכניקות המשמשות לבדיקת מתווכים מועמדים חדשים של גרורות מלנומה ומנגנוני הפעולה שלהם.

פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לתכנון פאנל נוגדנים אימונופלואורסצנטי מרובה להדמיה מבוססת ברקוד DNA של רקמות מלנומה FFPE של עכברים. אנו מתארים גם צינור ניתוח תמונה באמצעות כלי קוד פתוח ליצירת תובנות פרוטאומיקה מרחביות לגבי המיקרו-סביבה החיסונית של גידול מלנומה בעכברים.

הדמיית אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס מבוססת ברקוד DNA לניתוח דגימות FFPE ממלנומה עכברית מתוכנתת מחדש גנטית

למדו לזהות תאי מלנומה מסתובבים בדם באמצעות ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית ללא תווית. השיטה מאפשרת איתור מוקדם של מטסטזות ושיפור תוצאות טיפול בחולי סרטן עור.

איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

גלה סרטונים נוספים