איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

מטרת הניסוי הבא היא לזהות נוכחות של סרטן לפני היווצרותם של גידולים משניים. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת וסלקציה של דגימות דם מחולי מלנומה בשלב ארבע. כשלב שני, הדם מוחדר לתא זרימה פוטו-אקוסטי, המאפשר זיהוי ובידוד של תאי מלנומה.

בשלב הבא, התאים שנלכדו נסרקים באמצעות דימוי כדי לאשר את נוכחות המלנומה שזוהתה. התוצאות מדגימות את יכולתו של המערכת לזהות ולבודד תאי מלנומה באופן מדויק ומהיר, בהתבסס על צורות גל פוטואקוסטיות וטכניקות דימוי של תאים. היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות לזיהוי תאי מלנומה במחזור הדם, כגון R-T-P-C-R, מיון תאים מגנטי ביומטי ואמצעים אחרים, הוא ששיטתנו אינה דורשת סימון (label free), והיא מאפשרת לכידה של תאי מלנומה במחזור הדם ללא שינוי של פני השטח שלהם או קיבוע שלהם למצע.

להכנת דגימה לזיהוי סרטן גרורתי, התחל במשיכה של כ-10 milliliters של דם מלא ממטופל עם סרטן בשלב ארבע. סבב שני מבחני vacutainer בנפח חמישה milliliters למשך 10 דקות בצנטריפוגה. במהירות של 3000 RPM, דגימת הדם תופרד לשלוש שכבות שונות. השכבה התחתונה מורכבת מהאריתרוציטים.

השכבה האמצעית, הנקראת גם שכבת ה-buffy coat, מכילה לוקוציטים ותאי מלנומה, והשכבה העליונה מכילה פלזמה וטסיות דם. הסר כמה שיותר פלזמה מבלי להפריע לשכבת ה-Buffy coat. הוסף 250 µL של his opaque 10 77 לשפופרות troop של 2 mL.

באמצעות פיפטת פסטל באורך תשעה אינץ', יש לשאוב את שארית הפלזמה, את כל שכבת ה-Buffy coat ואת השכבה העליונה של האריתרוציטים. יש לוודא כי נאספים פחות מ-500 µL. העבירו את התמיסה למבחנות ה-wind Trobe שהוכנו מראש.

הדם יופרד שוב, אך הפעם האריתרוציטים יופרדו על ידי ה-hispa, מה שיאפשר הפקה קלה של שכבת ה-Buffy coat. השתמשו בפיפטת Pesa באורך תשעה אינץ' כדי לבודד את כל שכבת ה-Buffy coat והעבירו אותה לשפופרת eend orph של 2 milliliters. לאחר מכן, השעו אותה ב-1.5 milliliter של PBS עם 2% volume per volume בין 20.

לבניית תא זרימה, התחילו עם גליל אקרילי באורך eight millimeter עם קוטר חיצוני של 20 millimeter וקוטר פנימי של 17 millimeter. לאחר מכן, קדחו שלושה חורים בקוטר five millimeter בדופן הגליל בזוויות של 90 degree זה מזה. לאחר מכן, חתכו שלוש חתיכות של צינור פולימר והכניסו אותן לחורים שנקדחו.

מתחו פארה-פילם (para film) על בסיס טבעת האקרילי כדי ליצור איטום אטום למים. הפארה-פילם יצור יחד עם טבעת האקרילי קערה רדודה שתחזיק את תמיסת האקרילאמיד שתשמש כתא זרימה. השהו חוט בקוטר 1.6 millimeter דרך קטעי הצינור הנמצאים זה מול זה, תוך וידאו שרק החוט נראה דרך מרכז הטבעת אל תוך קטע הצינור השלישי.

החדירו תיל בקוטר 1.6 millimeter ומקמו את המבחנה במרחק של one millimeter מהתיל התלוי. תילים אלו מונעים מחומר ה-acrylamide לחדור לתוך המבחנה. הכינו five milliliters של acrylamide.

לאחר מכן, שפכו במהירות את התערובת לתוך טבעת האקריליק, עד למילוי מלא של הנפח. לאחר מספר שניות, התמיסה תהפוך לג'ל. כדי ליצור תבנית לתא זרימה, משכו בזהירות את החוטים החוצה תוך הקפדה שלא להפריע לג'ל האקרילאמיד, כך שיישאר נתיב זרימה גלילי ומקום למיקום סיב אופטי הממוקד על נתיב הזרימה.

תא הזרימה מוכן כעת לשימוש אקוסטי באמצעות ג'ל אולטרסאונד. חברו מתמר אקוסטי פ piezoelectric מפוליבינילידן פלואוריד (polyvinylidene fluoride) לתא הזרימה, ישירות מעל נתיב הזרימה. באמצעות מחבר ביונט (bayonet) או כבל BNC, חברו את המתמר לכניסה של מקלט רחב-פס.

חברו את מוצא המסנן לאוסצילוסקופ כדי להפעיל את הטריגר של האוסצילוסקופ. הציבו פוטודיודה בקרבת המתמר וחברו אותה לאוסצילוסקופ באמצעות כבל B NNC. משכו את הצינורית הקטנה של תא הזרימה עד שייווצר כיס אוויר קטן, וחברו אותה למתמר.

לאחר מכן, הכניסו את הסיב האופטי ומלאו את התא במים כדי להפחית אותי ממשק ולהגדיל את כמות אור הלייזר המופנית לנתיב הזרימה. בשל הממספר האופטי (numerical aperture) של הסיב האופטי והמרחק הקצר לנתיב הזרימה, הלייזר יקרין בכל רגע נתון על פלח דגימה אחד בלבד, מה שמבטיח שהדגימה הנמצאת ישירות מול הלייזר היא אותה דגימה המייצרת את האותות הפוטו-אקוסטיים.

בשלב הבא, חברו מחבר T לאחד הזרועות של תא הזרימה ושתי משאבות מזרק לענפים האחרים של המחבר. מזרק אחד מכיל אוויר והשני יכיל את תרחיף התאים שהוכן קודם לכן. לאחר מכן, הפעילו את שתי משאבות המזרק.

כאשר שני הנוזלים המותרים מגיעים לצומת ה-T, הם יחולקו לנטיפות (slugs) הומוגניות ויזרמו על פני המתמר. הקריני את הדגימה הזורמת באמצעות לייזר בפולסים של ננו-שנייה כדי ליצור גלי פוטואקוסטים בתאי המלנומה. מכיוון שמלנין הוא בולע אופטי רחב-פס, ניתן להשתמש בכל אורך גל של לייזר בטווח הנראה.

אות המופיע באוסצילוסקופ כאשר חלקה נמצאת מעל המתמר מעיד על כך שהחלקה מכילה מלנומה. עקבו אחריה דרך המערכת לפני הפלתה למבחנת איסוף. כדי להכין דגימות לצביעה אימונו-ציטוכימית, הניחו למסחות זכוכית בתוך משפכים לציטוספין והכניסו אותן למכשיר ה-cyto spin לצורך צנטריפוגה, כדי לסייע לתאים שנלכדו להיצמד למסחות הזכוכית.

העבירו 100 µL של 1%BSA ב-PBS לכל משפך. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 600 RPM למשך שלוש דקות. לאחר הסבוב, הוסיפו את דגימות התאים עבור משפכי ה-CyTOF, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה במהירות של 600 RPM למשך שלוש דקות.

רססו את ה슬יידים עם מקבע מבוסס אתנול. לאחר מכן, שטפו את הסליידים ב-PBS למשך 10 דקות פעמיים כדי לחסום קישור לא ספציפי. הדגירו כל סלייד עם תערובת של 10 µL של סרום עיזים ו-90 µL של PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, שפכו את התמיסה מהשקופיות והוסיפו תמיסת נוגדן ראשוני. כל שקופית צריכה להכיל 1%rabbit mark, 1%mouse CD 45 אחד ו-10%goat serum ב-PBS; הדגירו למשך שעה אחת בתא לח בניטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-PBS למשך 10 דקות, שלוש פעמים.

לאחר מכן, דגרו את השקופיות בנוגדנים שניים פלואורסצנטיים מתאימים בחושך למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ושפכו את התמיסה מהשקופיות. לאחר מכן, שטפו אותן ב-PBS למשך חמש דקות, שלוש פעמים. כדי לצבוע את הגרעינים, דגרו את התאים עם 0.1 µg/mL של DPI למשך דקה אחת. לאחר מכן, שפכו את התמיסה מהשקופיות ושטפו ב-PBS.

לבסוף, באמצעות תוך קיבוע מבוסס שרף, קבעו כיסוי זכוכית מעל דגימת התאים, אטמו את כיסוי הזכוכית באמצעות לק שקוף ובצעו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. צורות הגל הפוטו-אקוסטי של תאי דם לבנים ותאי מלנומה מוצגות כאן משמאל. תאי הדם הלבנים, שאין להם פיגמנטציה מולדת, אינם מייצרים גלים פוטו-אקוסטיים ומופיעים כקו שטוח של רעש אלקטרוני מימין.

עם זאת, תאי מלנומה פיגמנטיים מייצרים גל פוטו-אקוסטי חזק. לאחר צביעה אימונו-ציטוכימית, תאי מלנומה בתרבית מראים אותות כתמיים בכחול; תא מסומן אחד מודגש בירוק בתמונות חפיפה עבור DPI, ותא אחד מסומן עם CD 45 כאינדיקטור ללויקוציטים. איור זה מציג תאי מלנומה בקרב מספר תאי דם לבנים לאחר פיתוחם.

הטכניקה שלנו תסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הגילוי המוקדם של סרטן לחקור את תופעת הגריורה, במטרה לשפר את זיהוי הסרטן ובסופו של דבר לרפא את התפשטותו הקטלנית.