חלבון ניטור ספיחה עם מצב מוצק nanopores
2 בדצמבר 2011
השיטה של שימוש מצב מוצק nanopores לפקח על הלא ספציפית ספיחה של חלבונים על פני השטח אורגניים מתואר. השיטה משתמשת בעיקרון דופק-התנגדות, ומאפשר ספיחה להיות נחקר בזמן אמת והן ברמת מולקולה בודדת. בגלל תהליך ספיחה של חלבון יחיד רחוק שיווי משקל, אנו מציעים את העסקתם של מערכים מקבילים של nanopores סינתטי, מה שמאפשר לקביעת כמותית של קצב מסדר ראשון נראית לעין תגובה קבועה של חלבון ספיחה, כמו גם את לאנגמיור ספיחה מתמדת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ננו-נקבוביות בממברנות מלאכותיות לשימוש במחקרי ספיגת חלבון. זה מושג על ידי קידוח ננו-נקבוביות בקרום ניטריד באמצעות גבעול. ואז הננו-נקבוביות נטענות לתוך תא והיא רטובה בתמיסה יונית.
כך שהנוזל הזה יוצר גשר מצד אחד של הננו-נקבוביות לצד השני כדי להפוך את הננו-נקבוביות מוכנות לניסויים. מתח מופעל על פניו וניתן לראות זרם של יונים עובר דרכו. השלב האחרון הוא הוספת חלבון לתא הננופור.
בסופו של דבר, התבוננות בחסימות ארוכות טווח בזרם היוני על פני הננו-נקבוביות חושפת את ספיגת החלבונים לצידי הננו-נקבוביות. היי, אני דייב ויקי. אני סטודנטית לתואר שני במחלקה לפיזיקה באוניברסיטת סירקיוז.
אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ספיגת חלבונים על משטחים אנאורגניים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון חלבון, אינטראקציות חומצות גרעין, מולקולה בודדת לספקטרוסקופיה וחקר מולקולות בחללים סגורים. התחל בהעלאת הגבעול למתח תאוצה.
הטעינה הבאה, רשת חלון סיליקון ניטריד SPI לתוך מחזיק הדגימה TEM. נקה את הרשת עם פלזמת חמצן למשך 30 שניות כדי לנקות פסולת. לפני טעינת הדגימה, טען את מחזיק המדגם ב-TEM ואפשר לוואקום לשאוב למטה.
באמצעות מצב TEM בשדה בהיר, מצא את חלון הניטריד, ריבוע בהיר ברוגרמה הגולמית. ודא שה-TEM מיושר כהלכה. לאחר מכן יישר וממקד את הדגימה.
כעת הכנס את המערכת למצב STEM והשתמש בגלאי חם כדי לצלם את הדגימה ולבדוק את היישור שלה. הגדר את המונוכרומטור אם קיים לערך נמוך, מה שמאפשר זרם גבוה יותר של אלקטרונים זמינים לקידוח. בחר את גודל הנקודה המתאים לקידוח הננופור על סמך קוטר בדיקת האלקטרונים.
כשהגבעול מיושר. השתמש ב-BROGRAM כדי להתמקד בצורה מושלמת בקרום הניטריד בהגדלה הנדרשת. אם יש תנועה כלשהי של הדגימה, רוקן את קרן האלקטרונים והמתן עד שהדגימה תתייצב.
פעולה זו עשויה להימשך עד שעה. לאחר הייצוב, הנח את בדיקת האלקטרונים על הדגימה והתחל לקדוח את הננו-נקבוביות. קידוח ננו-נקבוביות עם TM דורש בגידה של המטופל.
זהו תהליך שבו ניטריד מתפזר בהדרגה תחת בדיקת קרן אלקטרונים. חשוב לשמור את בדיקת האלקטרונים ישירות מעל אתר הקידוח ולאשר שהננו-נקבוביות נקדחות לחלוטין. לפני הוצאת הדגימה מה-TEM, בדוק מעת לעת את הדגימה על ידי סריקה עם גלאי החם.
אם הדגימה נסחפת מעט, התאם את מיקום בדיקת האלקטרונים כך שיהיה מעל הננו-נקבוביות. עם גרם ההחזר על ההשקעה בפוקוס, סרט הניטריד המנצנץ ייעלם. כאשר הננו-נקבוביות נוצרות כשהגרם הרוקי לא ממוקד, שולי הציפורניים המפוצצים נראים לעין.
דמיין את הננו-נקבוביות עם החימום כבוי וצור פרופיל עוצמה של התמונה. ניתן להעריך את קוטר הננו-נקבוביות לפי האזור הכהה ביותר של הפרופיל. ניתן להשתמש בבדיקת האלקטרונים כדי להגדיל את הננו-נקבוביות במידת הצורך.
כאשר יש לו את הקוטר הנדרש. עבור למצב TEM עם המונוכרומטור בהגדרה הסטנדרטית. השתמש ב-brightfield TEM כדי לאשר את גודל הנקבוביות.
התחל בהכנת דגה די מלח. הכניסו את התמיסה לוואקום ובסוניקט אמבטיה למשך 20 דקות בעדינות, הניחו את שבב הננופור השברירי המכיל סיליקון ניטריד לתוך מקור פיירקס של 10 מיליליטר. ואז במכסה אדים, הניחו את הכוס על צלחת חמה.
נקו בזהירות רבה את שבב הננופור בתמיסת פיראנה. ראשית, הוסף למיכל שלושה מיליליטר חומצה גופרתית באמצעות פיפטה מזכוכית. שנית, הוסיפו בזהירות מיליליטר מי חמצן גבוהים לחומצה הגופרתית.
אנא נקוט בכל אמצעי הזהירות. הניחו לשבב הננו-נקבוביות להשרות במשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת פיפטה מזכוכית, הסר את תמיסת הפיראנה מהכוס והשליך אותה כראוי.
לאחר מכן, מלאו את הכוס במים דה-יונים של דגה. בעזרת פיפטת זכוכית נקייה, רוקנו את הכוס ממים וחזרו על כביסה זו לפחות חמש פעמים. בעזרת פינצטה נקייה, הסר את שבב הננו-נקבוביות וייבש אותו על ידי יניקה קלה.
לאחר הייבוש, אטום מיד את שבב הננו-נקבוביות לתוך החדר. ניתן לאבטח את השבב בתא על ידי טבעות O או איטום סיליקון. מלאו את החדר בתמיסת אשלגן כלורי.
חבר את האלקטרודות הכסופות והכסף כלוריד לתא. ניתן לייצר אלקטרודות על ידי השריית חוט כסף באקונומיקה למשך הלילה. החל פוטנציאל טרנסממברני על פני האלקטרודות ופקח על תגובת הזרם באמצעות מגבר מהדק תיקון.
במצב מהדק מתח, בנה עקומת מתח זרם מהמדידות. העקומה צריכה להיות ליניארית מאוד. בעת שימוש באשלגן כלורי מולארי אחד, המוליכות של הננו-נקבוביות צריכה להתאים לקוטר שלה.
אם הננו-נקבוביות אינן מציגות עקומת IV ליניארית, המוליכות נמוכה מדי או שהזרם הפתוח של הננו-נקבוביות אינו יציב. זה מצביע על כך שהננו-נקבוביות אינן מחוברות כראוי ויש לחזור על שטיפת פיהא. חשוב לוודא שהנוזל נמצא בתוך הננו-נקבוביות.
אם שלב זה לא נעשה כראוי, זרם היונים דרך הננו-נקבוביות יציג רעש גדול מאוד וחלוקת החלבונים לננו-נקבוביות תפחת באופן דרסטי. התחל בהוספת דגימה מטוהרת של החלבון המעניין לאמבטיה המקורקעת של החדר. המתן עד שהדגימה תתפזר היטב.
החל הטיית מתח פוטנציאלית טרנסממברנית עם קוטביות הפוכה לזו של המטען הכולל של החלבון הנחקר. פוטנציאל מיושם של 200 מילי-וולט צריך להיות גדול מספיק כדי לצפות. רוב אירועי אנליטי החלבון יופיעו כסטיות זרם חולפות מקו הבסיס.
אם לא נצפה אות, הגדל את ריכוז החלבון בתא. מתחים גבוהים יותר משפרים את יחס האות לרעש והניטריד. ננו-נקבוביות יכולות לעמוד במספר וולט.
ספיגת חלבון תופיע כשינויים ארוכי טווח בזרם הבסיס של הננו-נקבוביות. תוצאות אופייניות עבור ננו-נקבוביות במצב מוצק יהיו כדלקמן. זרם הנקבוביות הפתוחות צריך להיות יציב ביותר.
מאפייני ה-IV של הננו-נקבוביות צריכים להיות ליניאריים מאוד. באשלגן כלורי מולארי אחד, 10 אשלגן פוספט מולארי pH 7.4, השיפוע של התאמה ליניארית לעקומת IV יספק את המוליכות היחידה של הננו-נקבוביות. למוליכות יש קשר ישיר לקוטר הננו-נקבוביות והיא צריכה להתאים למשוואה.
ערך זה אמור להתאים ל-30%אם הערך קטן מדי, סביר להניח שהנקבוביות אינן מחוברות בתוספת חלבון. אירועים מהירים אמורים להתרחש ספיגת חלבון היא ירידה זרם ארוכת טווח. חלק מהחלבונים הם גמישים מאוד ועוברים טרנספורמציה מבנית בתוך פנים הנקבוביות.
במקרה זה, ירידת המתח ארוכת הטווח תלווה בתנודות מהירות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר ננו-נקבוביות במצב מוצק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, ובאמצעות ספיגת חלבון SA מוכנה. אל תשכח שעבודה עם תמיסת פיראנה עלולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כמו עבודה במכסה אדים עם כפפות, מעיל מעבדה וסינר כימי יש לנקוט תמיד בעת ביצוע הליך זה.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר שיטה לשימוש בננו-נקבוביות מצב מוצק לניטור ספיחת חלבונים על משטחים אנאורגניים. הטכניקה מאפשרת תצפית בזמן אמת ברמת מולקולה בודדת, תוך שימוש בעקרון הפולס ההתנגדותי.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ננוטכנולוגיה
- ביופיזיקה
- כימיה של חלבונים
רקע
- ננו-נקבוביות הן חורים זעירים שניתן להשתמש בהם לחקר אינטראקציות מולקולריות.
- הבנת ספיחת חלבונים היא קריטית ליישומים ביולוגיים שונים.
- עקרון הפולס ההתנגדותי מאפשר גילוי של מולקולות בודדות.
- ניטור בזמן אמת מספק תובנות לגבי תהליכים דינמיים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לחקר ספיחת חלבונים באמצעות ננו-נקבוביות מצב מוצק.
- להעריך כמותית את תהליך הספיחה ברמת מולקולה בודדת.
- לקבוע קבועי קצב תגובה הקשורים לספיחת חלבונים.
שיטות ששימשו
- יצירת ננו-נקבוביות בממברנות מלאכותיות.
- קידוח ננו-נקבוביות בממברנת ניטריד.
- טעינת ננו-נקבוביות לתא עם תמיסה יונית.
- יישום מתח לצפייה בזרם יוני והוספת חלבון לצורך ניסוי.
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של ספיחת חלבונים בזמן אמת.
- קביעה כמותית של קבועי הספיחה.
- תובנות לגבי הקינטיקה של אינטראקציות חלבונים עם משטחים.
- הוכחת האפקטיביות של מערכים מקבילים של ננו-נקבוביות.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי רב עוצמה לחקר ספיחת חלבונים.
- ניטור בזמן אמת ברמת מולקולה בודדת משפר את ההבנה של דינמיקת הספיחה.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול תחומים שונים בביופיזיקה ובננוטכנולוגיה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Solid-state nanopore assays enable direct, label-free monitoring of protein adsorption at the single-molecule level, addressing critical challenges in understanding protein-surface interactions for biopharma R&D. This capability is increasingly vital as device miniaturization amplifies the impact of protein adsorption on microfluidic and analytical platforms. Integrating nanopore-based analytics supports predictive confidence and mechanistic de-risking in early discovery and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein-surface interactions relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports mechanistic de-risking by revealing adsorption dynamics under diverse solution conditions.
- Facilitates functional validation of protein behavior on inorganic and functionalized surfaces.
Screening & Assay Development
- Provides a rapid, quantitative assay for protein binding to nitride and other thin films.
- Delivers reproducible, label-free readouts suitable for standardization across platforms.
- Prepares validated systems for downstream compound screening and analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables exploration of protein stability and adsorption in confined environments relevant to device development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by characterizing protein-material interactions.
- Offers predictive insights into protein behavior in microfluidic and diagnostic systems.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based assay fits within the early discovery to assay development continuum, providing foundational data for lead identification and preclinical device design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of protein-surface interactions.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of protein adsorption for assay readiness.
- Analytics: Provides single-molecule current measurements and adsorption event signatures for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical device development by modeling protein behavior in confined, device-relevant environments.
- Enterprise Reuse: Adaptable to a range of proteins, surfaces, and experimental conditions for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein-material studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible single-molecule assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage risk in device and assay development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein candidates and device platforms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanopore fabrication and single-molecule current analysis.
- Needs access to electron microscopy and patch clamp instrumentation.
- Demands rigorous cleaning and standardization protocols for reproducibility.
- Adaptable to various thin films and functionalized surfaces as supported by nanopore drilling.
- Safety precautions are critical when handling hazardous cleaning reagents.
