Name: גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: למדו להקים מודל איסכמיה/ריפרפוזיה במבחנה להערכת השפעת טיפול בתאי גזע על תאי לב פגועים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי חיות התאים ואינטראקציות בין-תאיות לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי OTKA (קרן הונגרית למחקר מדעי) D45933, T049621, ט (הונגריה מדע וטכנולוגיה קרן) A4/04, Arg-17/2006 ו SIN, Bolyai, מלגות Öveges ו TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 ו - 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. ברצוננו להודות Gesztes ויליאם למתן את הקריינות.

1. הכנת H9c2 תאים cardiomyoblast H9c2 cardiomyoblasts עכברוש התקבלו ATCC (Wesel, גרמניה) התרחבה גלוקוז גבוהה (4.5 גר &#39;/ ל&#39;) DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברית, 4 מ&quot;מ L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. H9c2 התא קו myoblast נגזר לב עוברי חולדה, הוא משמש מודל במבחנה עבור השריר הן השלד לב 8,9. הכן 12 צלחת היטב H9c2 תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מצלחת פטרי H9c2 של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמיים עם 5 מ&quot;ל PBS ולעכל עם 2-3 מ&quot;ל 0.05% טריפסין / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב טריפסין בינוני עם 10 תרבות DMEM מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מטה את התאים ב 1200 סל&quot;ד במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant, תאים resuspend בינוני 1 DMEM תרבות מ&quot;ל ותאי לספור עם hemocytometer באמצעות מכתים Trypan כחול.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30,000 זרעים H9c2 תאים 2 מ&quot;ל לכל DMEM גם בצלחת 12 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך 37 ° C-CO 2 באינקובטור למשך 24 שעות. </li></ol> 2. איסכמיה reperfusion סימולציה / איסכמיה / reperfusion היה מדומה במבחנה על ידי ביצוע גלוקוז חמצן קיפוח (OGD) H9c2 על תרביות תאים. הליך זה בוצע על הבמה של המיקרוסקופ confocal Zeiss עם מערכת תא הדגירה Pecon (Erbach, גרמניה) המאפשר תצפית של תאים במהלך OGD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני על ידי שאיפה מהצלחת 12 היטב H9c2 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם תאים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל גלוקוז בינוני חינם לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת לתוך מערכת הדגירה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל גז חנקן לטהר את החמצן מחוץ למערכת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן עד לרמה של 0.5% חמצן מגיע ואז להפעיל את הטיימר. חמצן 0.5% כלומר כ 3 מ&quot;מ כספית מתח חלקי. תאים בכפוף 150 דקות של איסכמיה מדומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של איסכמיה מדומה, להסיר את המדיום גלוקוז חופשי מן התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 מ&quot;ל בינוני תרבות נורמלי הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 12 היטב במשך 30 דקות ב 37 ° C-CO 2 באינקובטור, זוהי &quot;תקופת reperfusion&quot;. </li></ol> 3. הכנת mesenchymal הצלה בתאי גזע מוח עצם ממקור אנושי נלקח T75 צלוחיות ו מדולל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בינוני תרבות המכיל 10% עוברית עגל בסרום (FCS), 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, 4 מ&quot;מ L-גלוטמין ו 1 g / l גלוקוז. צלוחיות הודגרו ב 37 ° C באווירה humidified מלא של 5% CO 2 למשך 3 ימים. לאחר תקופת דגירה BMSCs דבקו פני השטח של צלוחיות ואת המרכיבים הנותרים של מח העצם בוטלו על ידי שטיפה עם PBS. BMSCs בשימוש היו בין 1 ל 5 קטעים הניסויים. IDENtity של תאים אושרה על ידי נוכחות של שושלת ספציפית משטח סמנים תא עם cytometry הזרימה. Hematopoietic linage הסמנים הספציפיים פני השטח (CD34, CD45) ו סמנים משטח mesenchymal (CD73, CD90, CD105 ו CD166) נחקרו. במהלך איסכמיה מדומה, להכין הצלה בתאי גזע mesenchymal להשתלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את צבע פלואורסצנטי Vybrant האם ביחס 1:200 במדיום תרבות DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני מתאי הצלה להוסיף 300 DMEM μl עם Vybrant עשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי במשך 30 דקות ב 37 ° C-CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מצלחת פטרי של בתאי גזע mesenchymal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמיים עם 5 מ&quot;ל PBS ולעכל עם 2-3 מ&quot;ל 0.05% טריפסין / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב טריפסין בינוני עם 10 תרבות DMEM מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מטה את התאים ב 1200 סל&quot;ד במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant, תאים resuspend בינוני 1 DMEM תרבות מ&quot;ל ותאי לספור עם hemocytometer באמצעות מכתים Trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 30 דקות בסוף reperfusion להוסיף 20,000 בתאי גזע mesenchymal לכל היטב את H9c2 myoblasts postischemic לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שיתוף התרבות של תאים לתוך 37 ° C-CO 2 באינקובטור למשך 24 שעות. </li></ol> 4. ניתוח עם מיקרוסקופיה confocal לאחר הפציעה איסכמיה / reperfusion מדומה, תאים מודגרת במדיום תרבות נורמליים למשך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות לשטוף תאים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים פתרון 500 גר / מת μl לצבוע במשך 30 דקות (5 nM calcein ו 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS) (5x10 4 תאים / מ&quot;ל). </li></ol> ההערכה של תמונות confocal עבור תאים חיים ומתים נבחר על ידי המורפולוגיה הקרינה ניתן לבצע עם התוכנה ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, ארה&quot;ב). במקרה של גO-תרבויות, MSCs ניתן להבחין בין תאים H9c2 בשל Vybrant תיוג שלהם תא האם. היחס של תאים מתים ניתן להעריך ב 4 שדות עצמאית של תצוגה (אובייקטיבי 10x) עבור כל תרבות בצורה עיוורת 10. H9c2 cardiomyoblasts תרבותי coverslips על 42 מ&quot;מ זכוכית יכול גם להיחקר עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו במהלך ואחרי פציעה איסכמיה / reperfusion באמצעות מערכת תא הדגירה של המיקרוסקופ confocal. תא אל תא אינטראקציות כגון איחוי תאים היווצרות של צינורות אינטר ניתן ללמוד לאורך זמן. 5. ניתוח עם זרימת cytometry לאחר הפציעה איסכמיה / reperfusion מדומה, תאים מודגרת במדיום תרבות נורמליים למשך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, קציר התקשורת והתרבות. חשוב מאוד לאסוף את המדיום תרבות גם בגלל כמה תאים מתים יכול להיות מנותקת מן השטח צלחת תרבות incuba במהלך 24 שעותtion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם תאים PBS ולעכל עם 0.05% טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדכא עם טריפסין בינוני תרבות DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מטה את התאים המדיום תרבות שנקטפו ב 1200 סל&quot;ד (בערך 150-200 גרם) במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים בתמיסה 500 גר / מת μL לצבוע במשך 30 דקות (5 nM calcein ו 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS) (5x10 4 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לזרום צינורות cytometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה Pro CellQuest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את זרימת cytometer למדידה, בקרה להכין דגימות של תאים חיים ומתים. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H9c2 פלייט תאים בצפיפות של 3x10 4 ב 12 גם צלחות כפי שמתואר בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לחיות עם trypsinisation שולטת תא בודד כמתואר נקודה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שולטת תאים מתים על ידי טיפול עם 10 מיקרומטר H 2 O 2 במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר trypsinisation, resuspenד חי ושולט התא מת פתרון 500 גר / מת μl צבען (5 nM calcein-AM ו - 400 nm Ethidium-homodimer-2 ב-PBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות המכשיר צריך להיות מותאם כך התאים החיים הם חיוביים calcein ו ethidium homodimer שלילי, בעוד תאים מתים הם שליליים calcein ו ethidium homodimer חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האחוז של אוכלוסיות אלה ניתן לבטא ברים על הגרף וניתוח סטטיסטי יכול להתבצע על ערכים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את קבוצות הניסוי השונות. </li></ol> 6. נציג תוצאות: התוצאות שלנו הראו כי הוסיף בתאי גזע mesenchymal יכול לשפר את ההישרדות של תאים לב postischemic. תמונות מיקרוסקופיה confocal חשף ישיר התא אל התא אינטראקציות, כגון חיבור קרום חלקי או צינורות אינטר, אשר ככל הנראה תפקיד חשוב בהגנה על נצפו 10. צינורות אלה משתרעים על פני מרחקים של התא ד מספרiameters, בקטרים ​​שלהם היו בין 200 ל 500 ננומטר (חצים לבנים). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. היווצרות Nanotube בין תאים. היווצרות Nanotube (חץ לבן) נצפתה בין cardiomyoblasts Vybrant Dio שכותרתו ועשה Vybrant תאים שכותרתו mesenchymal גזע. Cytometry ניתוח תזרים הראה את אוכלוסיות לשרוד cardiomyoblasts נמקי ותאי גזע mesenchymal. מעניין, אנחנו גם ציין שלישי, &quot;פצוע&quot; cardiomyoblast תא האוכלוסייה שהכיל calcein אך הכיל גם את החיווי של תאים מתים, ethidium homodimer (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="איור 2" /> באיור 2. נציג הדוט העלילה של אוכלוסיות תאים שונות לאחר איסכמיה מדומה. ההערכה של מספר ניסויים shoד &#39;כי תוספת של תא גזע mesenchymal כדי cardiomyoblast H9c2 postischemic גדל באופן משמעותי את אחוז התאים החיים לעומת myoblasts לב בתרבית לבד לאחר איסכמיה (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="איור 3" /> באיור 3. . השפעת הטיפול בתאי גזע על cardiomyoblasts postischemic אחוז תאים חיים צומצם משמעותית לאחר איסכמיה מדומה לעומת שליטה (שליטה מול IR דגם: 90.36 ± 2.60 לעומת 10.52 ± 0.48, *** p&gt; 0.001), שגברה לאחר תוספת של בתאי גזע mesenchymal (IR מודל מול IR + BMSC: 10.52 ± 0.48 לעומת 25.21 ± 2.13, *** p&gt; 0.001). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי של הנתונים בוצע באמצעות חד סטרי ניתוח שונות עם פוסט השוואה של מספר טיוקי הוק הבדיקה.

<ol><li>Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Therapy+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).</li>
<li>Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+bone+regeneration-Bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).</li>
<li>Gaipa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-based+CD133%2B+cells+isolation+maintains+progenitor+angiogenic+properties+and+enhances+standardization+in+cardiovascular+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).</li>
<li>Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+in+human+stem+cell+therapeutic+research%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medicine%22%5BJournal%5D)">New perspectives in human stem cell therapeutic research.</a> BMC medicine. 7, 29-29 (2009).</li>
<li>Mazhari, R., Hare, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+mesenchymal+stem+cells+in+cardiac+repair%3A+potential+influences+on+the+cardiac+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, Suppl 1. S21-S21 (2007).</li>
<li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).</li>
<li>Sardao, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+of+H9c2+myoblasts+exposed+to+tert-butylhydroperoxide--characterization+of+morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death.</a> BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).</li>
<li>Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+biochemical%2C+and+electrophysiological+characterization+of+a+clonal+cell+%28H9c2%29+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart.</a> Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).</li>
<li>Cselenyak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+rescue+cardiomyoblasts+from+cell+death+in+an+in+vitro+ischemia+model+via+direct+cell-to-cell+connections%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections.</a> BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).</li>
<li>Sauvant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+in+vitro+model+system+for+investigation+of+reperfusion+damage+after+renal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).</li>
<li>Namas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Induced+Overexpression+of+BNIP3+is+Not+Dependent+on+Hypoxia-Inducible+Factor+1alpha+in+Mouse+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes.</a> Shock. 36, 196-196 (2011).</li>
<li>Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2FReoxygenation+Up-Regulated+the+Expression+of+Death+Receptor+5+and+Enhanced+Apoptosis+in+Human+Hepatocyte+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line.</a> Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).</li>
<li>Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+neuronal+cell+death+in+acute+and+delayed+in+vitro+ischemia+%28oxygen-glucose+deprivation%29+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).</li>
<li>Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+a+revolution+in+therapeutics--recent+advances+in+stem+cell+biology+and+their+therapeutic+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).</li>
<li>Angoulvant, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+conditioned+media+attenuates+in+vitro+and+ex+vivo+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury.</a> J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).</li>
<li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia%2FReperfusion+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li>
<li>Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-receptor-mediated+protection+of+cerebral+endothelial+cell+viability+and+mitochondrial+function+after+ischemic+insult+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול הפגינו הוא בגישה חוץ גופית לנושא הרבה יותר מורכב של טיפול בתאי גזע של אוטם שריר הלב, עם כל היתרונות והחסרונות של מודל כזה. ברור שזה לא יכול לשקף את מורכבות (למשל, מערכת החיסון) האירועים המתרחשים במהלך ואחרי האוטם בשריר הלב, אך ניתן למקד את ההשפעות הישירות של תאים התווסף ב התאים postischemic. ההשפעות של איסכמיה מדומה על H9c2 cardiomyoblasts מאוד תלוי בזמן OGD, מספר על המעבר של התאים בשימוש על ריכוז O 2. צריך להתאים את הפרמטרים באופן מדויק למצוא את התנאים האופטימ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> calcein-AM </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> ethidium homodimer-2 </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> האם Vybrant </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם הציוד </td><td> חברה </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> הדגירה Pecon תא מערכת מיקרוסקופים Zeiss </td><td> Pecon GmbH </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> 2. טבלה ציוד.

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

השתלת תא גזע פרוטוקולים מוצאים את דרכם לתוך הפרקטיקה הקלינית 1,2,3. קבלת תוצאות טובות יותר, מה שהופך את הפרוטוקולים חזקים יותר, ולמצוא מקורות חדשים עבור תאים להשתלה הם מוקד של מחקר שנעשה לאחרונה 4,5. בחינת היעילות של טיפולים בתא אינה משימה קלה, כלים חדשים נדרשים כדי לחקור את המנגנונים המעורבים בתהליך הטיפול 6. תכננו פרוטוקול הניסוי של איסכמיה / reperfusion כדי לאפשר תצפית של חיבורי הסלולר מנגנוני subcellular גם במהלך הפציעה איסכמיה / reperfusion ואחרי השתלת תא גזע כדי להעריך את היעילות של טיפול בתא. H9c2 תאים cardiomyoblast הונחו על תרבות צלחות התא 7,8. איסכמיה היה מדומה עם 150 דקות בתווך גלוקוז חופשי עם רמת חמצן מתחת 0.5%. ואז, מדיה נורמלי רמות החמצן היו מחדש כדי לדמות reperfusion. לאחר שלילת חמצן גלוקוז,התאים שנפגעו טופלו השתלה של מח עצמות אדם נגזר תווית בתאי גזע mesenchymal ידי הוספתם התרבות. בתאי גזע mesenchymal עדיפים בניסויים קליניים משום שהם נגישים בקלות עם ניתוח פולשני מינימלי, ניתן להרחבה בקלות עצמיים. לאחר 24 שעות של עיבוד משותף, התאים היו מוכתמות calcein ו-ethidium homodimer להבדיל בין תאים חיים ומתים. התקנה זו מאפשרת לנו לחקור את הקשרים אינטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal ו לכמת את שיעור ההישרדות של תאים postischemic ידי cytometry הזרימה. מיקרוסקופיה Confocal הראה את יחסי הגומלין של שתי אוכלוסיות תאים כגון איחוי תאים היווצרות של צינורות אינטר. Cytometry ניתוח תזרים חשף 3 אשכולות של תאים פגומים אשר ניתן להתוות על הגרף ונותחו סטטיסטית. אוכלוסיות אלה יכולים להיחקר בנפרד ניתן להסיק על נתונים אלה על האפקטיביות של סימולציהtherapeutical גישה.

אנו מדגימים כיצד להקים<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה / reperfusion מודל כיצד להעריך את ההשפעה של טיפול בתאי גזע לתאי לב על postischemic.

פרוטוקולים להשתלת תאי גזע מוצאים את דרכם לפרקטיקה הקלינית1,2,3. כדי להשיג תוצאות טובות יותר, להפוך את הפרוטוקולים לעמידים יותר, ו...

תאים ממקור לבבי מועמדים על פלטות תרביות תאים לצורך סימולציה של איסכמיה. מודל איסכמיה של רפירפוזיה מושג באמצעות שהייה של 150 דקות במצע נטול גלוקוז, כאשר רמת החמצן היא נמוכה מ-0.5%. תקופה איסכמית זו מובילה להתכווצות ולהיווצרות של שלפוחיות ברוב התאים. לאחר מכן, מחזירים מצע רגיל ורמות חמצן רגילות כדי לדמות רפירפוזיה.תאי גזע מזנכימליים מתווספים ומגודלים יחד עם התאים הפגועים. לאחר 24 שעות של שבילי גידול משותף, התאים נצבעים בסידן וב-Ethereum homodimer כדי להבחין בין תאים חיים למתים. מיקרוסקופ קונפוקלי מראה בבירור שתי אוכלוסיות תאים ואת האינטראקציות ביניהן. ניתוח באמצעות ציטומטריה זרימה חושף שלושה צברי תאים פגועים, אותם ניתן להציג על גרף ולנתחם סטטיסטית. פרוטוקולים להשתתלת תאי גזע מוצאים את דרכם למסגרת הקלינית, והמיקוד במחקרים האחרונים הוא בשיפור התוצאות, הפיכת הפרוטוקולים לעמידים יותר ומציאת מקורות חדשים לתאים להשתתלה.בחינת היעילות של טיפולים תאיים אינה משימה פשוטה, ונדרשים כלים חדשים כדי לחקור את המנגנונים המעורבים בתהליך הטיפול. תכננו פרוטוקול ניסויי במטרה לאפשר תצפית על קשרים תאיים ואפילו על מנגנונים תת-תאיים במהלך איסכמיה, פגיעת פרפוזיה ולאחר השתלת תאי גזע. קריטריוני התכנון שלנו התבססו על מערכת in vitro מלאה, שבה נוכחים אך ורק תאי המאכסן ותאי התורם.כך הוא מבודד מהרקמה הסובבת. מדידה רציפה של חיוניות התאים לפני, במהלך ולאחר הפגיעה למשך עד 24 שעות. וזיהוי ברור של שתי אוכלוסיות התאים, כך שניתן יהיה לעקוב אחר גורל התאים המושתלים.על מנת להשיג מטרה זו, הקמנו פרוטוקול של מחסור בחמצן ובגלוקוז, המכונה בקיצור OGD, ולאחריו תקופת רי-חמצון (reoxygenation). בחרנו בתאי C2 בגיל תשעה, שהם תאי קו של myocardial myoblasts מוכרים. לאחר ה-OGD, התאים הפגועים נתמכו באמצעות השתלה של תאי גזע מזנכיים המופקים ממחולל הגרם, על ידי הוספתם לתרבית.הגדרות אלו אפשרו לנו לחקור את הקשרים הבין-תאיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ולכמת את שיעורי ההישרדות של תאים פגועים באמצעות פלואמטריה (flow cytometry). בואו נתחיל ונראה כיצד עושים זאת. הסירו את מצע התרבית מתאי H9C2.שטפו את התאים פעמיים עם PBS ועכלו עם 0.05% trypsin EDTA בצלחות פטרי במשך חמש דקות. באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות, עברו עיכוב של ה-trypsin באמצעות מצע גידול DMEM. סובבו את התאים במהירות של 1200 RPM למשך שמונה דקות.לאחר הסרת הנוזל העליון, השעו את התאים ב-1 מ"ל של מצע תרבית DMEM. ספרו את התאים באמצעות ציטומטר תוך שימוש בצביעת trypan blue. זרקו 30,000 תאי H9C2 לכל באר בצלחת 12 בארות. הכניסו את הצלחת למדגרה בטמפרטורה של 37°C עם CO2 למשך 24 שעות. הסירו את המצע באמצעות שאיבה ושטפו את התאים פעמיים ב-PBS.הוסיפו 3 mm של מצע נטול גלוקוז. הניחו את הצלחת בתוך מערכת אינקובציית התאים. הפעילו זרימת גז חנקן כדי לנקות את החמצן ממערכת האינקובציה.המתן עד שרמת החמצן תגיע ל-0.5%. לאחר מכן הפעל את הטיימר; 0.5% חמצן פירושו לחץ חלקי של כ-שלושה מילימטרים של כספית. הכפף את התאים ל-150 דקות של איסכמיה סימולטיבית. במהלך האיסכמיה, התאים נפרדים מהמשטח וממברנתם מתחילה להתנפח (blabbing). מצאנו שכל אוכלוסייה דורשת פרקי זמן מעט שונים, עד להגעה ל-60% עד 80% של תמונות תאים.זו הסיבה שאנו מציעים להתחיל עם שתי דגירות R. ואם זה לא מספיק, יש להגדיל את משך ה-OGD. במקרה שלנו, תאי age nine C two זקוקים בדרך כלל ל-150 עד 70 דקות של OGD בסיום האיסכמיה המדומה.הסיר את המצע נטול הגלוקוז מהתאים והעבר באמצעות פיפטה מצע תרבית רגיל לבארים. הנח את פלטת 12 הבארים למשך 30 דקות באינקובטור עם פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 °C. זוהי תקופת הפרפוזיה מחדש.במהלך איסכמיה מדמה, הכין תאי הצלה להשתלה. לדלל את התזונה הפלואורסצנטית, vibrant DID, ביחס של 1:200 במצע תרבית DMEM. שאב את המצע מתאי ההצלה והוסף 300 µL של DMEM עם vibrant לתוך צלחות פטרי, להשכבה למשך 30 דקות באינקובטור CO₂ בטמפרטורה של 37 °C.לאחר 30 דקות בסיום הרפרפוזיה, הוסיפו אלף תאי גזע מזנכיים לכל באר אל המיובלסטים הקרדיאליים H9C2 לאחר איסכמיה. השלבים הראשוניים זהים לזריעה של H9C2: שטיפה פעמיים עם PBS, טריפסין וספירה. העבירו את תרבית השיתוף של התאים לאינקובטור עם CO₂ בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.לאחר 24 שעות, קצרו את מצע הגידול ואת התאים הדבקים מהבארים באמצעות שאיבה. חשוב מאוד לאסוף גם את מצע הגידול, מכיוון שייתכן שחלק מהתאים המתים ניתקו מפני השטח של כלי התרבית במהלך הדגירה של 24 השעות.שהו את התאים ב-500 µL של תמיסת live, dead, die, 5 nM CaCl₂ ו-400 nM Ethereum homodimer ב-PBS בריכוז של 5×10⁴ תאים למילליליטר. במקרה של תרביות משולבות (co-cultures), ניתן להבחין בין תאי גזע מזנכימליים לתאי H9C2 באמצעות סימון פלואורסצנטי ספציפי. באופן זה ניתן לזהות איחוי תאים ואתרי מגע בין תאים.ניתן להעריך את יחס התאים המתים בארבעה שדות ראייה בלתי תלויים, תוך שימוש בעדשה עם הגדלה של 10 פעמים עבור כל תרבית ובאופן סמיך, דבר המעניק תוצאה ניתנת לשחזור של ספירת התאים. העבירו את התאים לנבובות עבור ציטומטריית זרימה. הפעילו את תוכנת ה-Quest Pro כדי להגדיר את הציטומטר הזורם למדידה.הכינו דגימות ביקורת של תאים חיים ומתים. תאים חיים גודלים באותה צפיפות בתנאים רגילים ונצבעים בסימון לסידן. תאים מתים מוכנים על ידי טיפול של שעה אחת ב-10 micromole hydrogen peroxide, נצבעים ב-Ethereum homodimer, ונאספים באותו אופן. יש לכוון את הגדרות המכשיר כך שהתאים החיים יהיו חיוביים לסידן ושליליים ל-Ethereum homodimer.בעוד שהתאים המתים הם שליליים לסידן וחיוביים ל-Ethereum homodimer, ניתן להציג את האחוזים של אוכלוסיות אלו כעמודות בגרף ולבצע ניתוח סטטיסטי על ערכים אלו. מצאנו כי הוספת תאי גזע בריאים מגבירה את יחס התאים השורדים באוכלוסייה. באופן מעניין, הבחנו גם שניתן להפריד באמצעות gating את התאים שניצלו לאחר הפגיעה מאלה שהיו מתים, אך גם מאלה שנותרו בחיים.אנו מאמינים כי אוכלוסייה זו מצדיקה חקירה נוספת. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לבצע ניסויי איסכמיה מדומים עם השתקת תאי גזע in vitro בצורה סטנדרטית. וזהו.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם. במידה ויש לכם שאלות טכניות, אל תהססו לפנות אלינו. נשמח לסייע.

stem-cell-transplantation-an-vitro-simulated-ischemiareperfusion

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הליך כירורגי עבור משלוח של תא גזע עובריים שמקורם בתאי האנדותל כדי hindlimb איסכמי הוא הוכיח, עם מעקב פולשני על ידי הדמיה פליטת אור.

עובריים, נגזר גזע לתאי אנדותל לטיפול איסכמיה Hindlimb

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

דגם העכבר של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion הוקמה כדי לחקור הפתופיזיולוגיה של שבץ. אנו יש מאתרים ומפסיקים את עורק המוח התיכון נכון ולא נכון עורק תרדמני, להחזיר את זרימת הדם לאחר 10 או 40 דקות של איסכמיה.

שתיים, כלי סגר דגם העכבר של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion

כאן, אנו מתארים מודל טרום קליני בעלי חיים ללמוד את הפתופסולוגיה של פציעה איסכמיה-reperfusion בניתוח מיקרו-מיחזור. זה מודל העור חינם המודל מבוסס על כלי שטחית caudal האפיקיבה בחולדה עשויה גם לאפשר הערכה של טיפולים שונים תרכובות לנטרל את איסכמיה-reperfusion נזק הקשורות לפציעה.

מודל מפרה קליני לחקר איסכמיה-reperfusion פציעה במיקרו-כירורגיה משחזרת

ביקשנו לבסס מודל חזירים של אי ספיקת לב המושרה על ידי חסימת עורק היקפית שמאל וצעידה מהירה כדי לבדוק את ההשפעה והבטיחות של ניהול פנים-לב של תאי גזע עבור טיפולים מבוססי תאים.

הקמת מודל חזירים של אי ספיקת לב לאחר שריר הלב לטיפול בתאי גזע

תאי גזע נחקרים ללא הרף כטיפולים פוטנציאליים עבור אנשים עם נזק שריר הלב, עם זאת, הכדאיות והשמירה שלהם ירד בתוך רקמה פצועה יכול להשפיע על היעילות שלהם לטווח ארוך. בכתב יד זה אנו מתארים שיטה חלופית למשלוח תאי גזע במודל מורין של פגיעה בהתרככיה.

אספקה תוך-תוך-קרדיאלית מושהית של תאי גזע לאחר פציעת איסכמיה רפרציה במודל מורין

מרחק מרחבי הוא פרמטר מרכזי בהערכת פגיעה היפוקסיה/ראוקסיגניה במודל של תרבות משותפת של שכבות תאי אנדותל וקרדיומיוציטים נפרדות, מה שמרמז, לראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של תאי אנדותל בהגנה על קרדיומיוציטים.

פיתוח מודל של תרבות משותפת של תאים כדי לחקות איסכמיה לב/רפרטפוזיה במבחנה במבחנה

מאמר זה מתאר איסכמיה-reperfusion (I/R) דוגמנות בעובר אפרוח 3 ימים באמצעות מחט עמוד השדרה מותאם אישית וו כדי להבין טוב יותר את התפתחות I / R וטיפול. דגם זה פשוט, מהיר וזול.

דור של הוק איסכמיה-רפרפוזיה מודל באמצעות שלושה ימים מתפתח אפרוח עובר

העברת תאים מונחית אולטרסאונד סביב האתר של אוטם שריר הלב בעכברים היא דרך בטוחה, יעילה ונוחה להשתלת תאים.

השתלת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אולטרסאונד בעכברים עם אוטם שריר הלב

הפרוטוקול נועד לספק שיטות לאנצפלומיוסיננגיוזיס - השתלה של דש שריר טמפורליס וסקולרי על פני השטח של רקמת מוח איסכמית - לטיפול בשבץ איסכמי שאינו מויאמויה. יעילות הגישה בהגברת אנגיוגנזה מוערכת באמצעות מודל חסימה חולף של עורק מוחי אמצעי בעכברים.

מודל לטיפול באנצפלומיוסיננגיוזיס לאחר שבץ מוחי הנגרם על ידי חסימת עורקים מוחיים באמצע בעכברים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול חוץ גופני למידול נזקי היפוקסיה/חמצון מחדש בתאי אפיתל פרוקסימליים פרוקסימליים מטבוליים מאוד. מודל זה נועד לגרום לנזק שנגרם מלחץ מטבולי, שניתן למדוד באמצעות ביטוי סמני נזק לצינורות הפרוקסימליים והערכת תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי.

מידול פגיעות היפוקסיה/חמצון מחדש בתאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים

למדו להקים מודל איסכמיה/ריפרפוזיה במבחנה להערכת השפעת טיפול בתאי גזע על תאי לב פגועים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי חיות התאים ואינטראקציות בין-תאיות לאורך זמן.

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

גלה סרטונים נוספים