גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

תאים ממקור לבבי מועמדים על פלטות תרביות תאים לצורך סימולציה של איסכמיה. מודל איסכמיה של רפירפוזיה מושג באמצעות שהייה של 150 דקות במצע נטול גלוקוז, כאשר רמת החמצן היא נמוכה מ-0.5%. תקופה איסכמית זו מובילה להתכווצות ולהיווצרות של שלפוחיות ברוב התאים. לאחר מכן, מחזירים מצע רגיל ורמות חמצן רגילות כדי לדמות רפירפוזיה.

תאי גזע מזנכימליים מתווספים ומגודלים יחד עם התאים הפגועים. לאחר 24 שעות של שבילי גידול משותף, התאים נצבעים בסידן וב-Ethereum homodimer כדי להבחין בין תאים חיים למתים. מיקרוסקופ קונפוקלי מראה בבירור שתי אוכלוסיות תאים ואת האינטראקציות ביניהן. ניתוח באמצעות ציטומטריה זרימה חושף שלושה צברי תאים פגועים, אותם ניתן להציג על גרף ולנתחם סטטיסטית. פרוטוקולים להשתתלת תאי גזע מוצאים את דרכם למסגרת הקלינית, והמיקוד במחקרים האחרונים הוא בשיפור התוצאות, הפיכת הפרוטוקולים לעמידים יותר ומציאת מקורות חדשים לתאים להשתתלה.

בחינת היעילות של טיפולים תאיים אינה משימה פשוטה, ונדרשים כלים חדשים כדי לחקור את המנגנונים המעורבים בתהליך הטיפול. תכננו פרוטוקול ניסויי במטרה לאפשר תצפית על קשרים תאיים ואפילו על מנגנונים תת-תאיים במהלך איסכמיה, פגיעת פרפוזיה ולאחר השתלת תאי גזע. קריטריוני התכנון שלנו התבססו על מערכת in vitro מלאה, שבה נוכחים אך ורק תאי המאכסן ותאי התורם.

כך הוא מבודד מהרקמה הסובבת. מדידה רציפה של חיוניות התאים לפני, במהלך ולאחר הפגיעה למשך עד 24 שעות. וזיהוי ברור של שתי אוכלוסיות התאים, כך שניתן יהיה לעקוב אחר גורל התאים המושתלים.

על מנת להשיג מטרה זו, הקמנו פרוטוקול של מחסור בחמצן ובגלוקוז, המכונה בקיצור OGD, ולאחריו תקופת רי-חמצון (reoxygenation). בחרנו בתאי C2 בגיל תשעה, שהם תאי קו של myocardial myoblasts מוכרים. לאחר ה-OGD, התאים הפגועים נתמכו באמצעות השתלה של תאי גזע מזנכיים המופקים ממחולל הגרם, על ידי הוספתם לתרבית.

הגדרות אלו אפשרו לנו לחקור את הקשרים הבין-תאיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ולכמת את שיעורי ההישרדות של תאים פגועים באמצעות פלואמטריה (flow cytometry). בואו נתחיל ונראה כיצד עושים זאת. הסירו את מצע התרבית מתאי H9C2.

שטפו את התאים פעמיים עם PBS ועכלו עם 0.05% trypsin EDTA בצלחות פטרי במשך חמש דקות. באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות, עברו עיכוב של ה-trypsin באמצעות מצע גידול DMEM. סובבו את התאים במהירות של 1200 RPM למשך שמונה דקות.

לאחר הסרת הנוזל העליון, השעו את התאים ב-1 מ"ל של מצע תרבית DMEM. ספרו את התאים באמצעות ציטומטר תוך שימוש בצביעת trypan blue. זרקו 30,000 תאי H9C2 לכל באר בצלחת 12 בארות. הכניסו את הצלחת למדגרה בטמפרטורה של 37°C עם CO2 למשך 24 שעות. הסירו את המצע באמצעות שאיבה ושטפו את התאים פעמיים ב-PBS.

הוסיפו 3 mm של מצע נטול גלוקוז. הניחו את הצלחת בתוך מערכת אינקובציית התאים. הפעילו זרימת גז חנקן כדי לנקות את החמצן ממערכת האינקובציה.

המתן עד שרמת החמצן תגיע ל-0.5%. לאחר מכן הפעל את הטיימר; 0.5% חמצן פירושו לחץ חלקי של כ-שלושה מילימטרים של כספית. הכפף את התאים ל-150 דקות של איסכמיה סימולטיבית. במהלך האיסכמיה, התאים נפרדים מהמשטח וממברנתם מתחילה להתנפח (blabbing). מצאנו שכל אוכלוסייה דורשת פרקי זמן מעט שונים, עד להגעה ל-60% עד 80% של תמונות תאים.

זו הסיבה שאנו מציעים להתחיל עם שתי דגירות R. ואם זה לא מספיק, יש להגדיל את משך ה-OGD. במקרה שלנו, תאי age nine C two זקוקים בדרך כלל ל-150 עד 70 דקות של OGD בסיום האיסכמיה המדומה.

הסיר את המצע נטול הגלוקוז מהתאים והעבר באמצעות פיפטה מצע תרבית רגיל לבארים. הנח את פלטת 12 הבארים למשך 30 דקות באינקובטור עם פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 °C. זוהי תקופת הפרפוזיה מחדש.

במהלך איסכמיה מדמה, הכין תאי הצלה להשתלה. לדלל את התזונה הפלואורסצנטית, vibrant DID, ביחס של 1:200 במצע תרבית DMEM. שאב את המצע מתאי ההצלה והוסף 300 µL של DMEM עם vibrant לתוך צלחות פטרי, להשכבה למשך 30 דקות באינקובטור CO₂ בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר 30 דקות בסיום הרפרפוזיה, הוסיפו אלף תאי גזע מזנכיים לכל באר אל המיובלסטים הקרדיאליים H9C2 לאחר איסכמיה. השלבים הראשוניים זהים לזריעה של H9C2: שטיפה פעמיים עם PBS, טריפסין וספירה. העבירו את תרבית השיתוף של התאים לאינקובטור עם CO₂ בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.

לאחר 24 שעות, קצרו את מצע הגידול ואת התאים הדבקים מהבארים באמצעות שאיבה. חשוב מאוד לאסוף גם את מצע הגידול, מכיוון שייתכן שחלק מהתאים המתים ניתקו מפני השטח של כלי התרבית במהלך הדגירה של 24 השעות.

שהו את התאים ב-500 µL של תמיסת live, dead, die, 5 nM CaCl₂ ו-400 nM Ethereum homodimer ב-PBS בריכוז של 5×10⁴ תאים למילליליטר. במקרה של תרביות משולבות (co-cultures), ניתן להבחין בין תאי גזע מזנכימליים לתאי H9C2 באמצעות סימון פלואורסצנטי ספציפי. באופן זה ניתן לזהות איחוי תאים ואתרי מגע בין תאים.

ניתן להעריך את יחס התאים המתים בארבעה שדות ראייה בלתי תלויים, תוך שימוש בעדשה עם הגדלה של 10 פעמים עבור כל תרבית ובאופן סמיך, דבר המעניק תוצאה ניתנת לשחזור של ספירת התאים. העבירו את התאים לנבובות עבור ציטומטריית זרימה. הפעילו את תוכנת ה-Quest Pro כדי להגדיר את הציטומטר הזורם למדידה.

הכינו דגימות ביקורת של תאים חיים ומתים. תאים חיים גודלים באותה צפיפות בתנאים רגילים ונצבעים בסימון לסידן. תאים מתים מוכנים על ידי טיפול של שעה אחת ב-10 micromole hydrogen peroxide, נצבעים ב-Ethereum homodimer, ונאספים באותו אופן. יש לכוון את הגדרות המכשיר כך שהתאים החיים יהיו חיוביים לסידן ושליליים ל-Ethereum homodimer.

בעוד שהתאים המתים הם שליליים לסידן וחיוביים ל-Ethereum homodimer, ניתן להציג את האחוזים של אוכלוסיות אלו כעמודות בגרף ולבצע ניתוח סטטיסטי על ערכים אלו. מצאנו כי הוספת תאי גזע בריאים מגבירה את יחס התאים השורדים באוכלוסייה. באופן מעניין, הבחנו גם שניתן להפריד באמצעות gating את התאים שניצלו לאחר הפגיעה מאלה שהיו מתים, אך גם מאלה שנותרו בחיים.

אנו מאמינים כי אוכלוסייה זו מצדיקה חקירה נוספת. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לבצע ניסויי איסכמיה מדומים עם השתקת תאי גזע in vitro בצורה סטנדרטית. וזהו.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם. במידה ויש לכם שאלות טכניות, אל תהססו לפנות אלינו. נשמח לסייע.