מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

בהליך זה, אנו מראים גישת מיקרוסקופיה תוך-חיונית כמותית להערכת הדינמיקה של מעבר הטפיל דרך הטחול. במודל מלריה של מכרסמים, עכברים הנגועים בטפילים טרנסגניים GFP מוכנים למיקרוסקופיה תוך-חיונית של קנולציה של וריד הטחול תאפשר הזרקת צבעים תוך-חיוניים. במהלך הניסוי, תאים פלואורסצנטיים נעים באזורים שונים של הטחול.

אנו מספקים את המיתולוגיה כדי לתאר את ניידות הטפילים בתא האיטי התלת מימדי של העיסה האדומה ולחשב את זרימת הדם בכלי הדם. פרמטרים אלה שימשו להשוואת דינמיקת הטחול של שני זני PULE. שלום לכולם.

שמי Nando El Portillo, ואחת משאלות המחקר העיקריות במעבדה שלי היא לנסות להבין את תפקיד הטחול במלריה. טחול ה-S הוא אחד מציוני הדרך של מחלה זו, אך בגלל בעיות טכניות ואתיות קשה מאוד לנסות לטפל במחקרים על איבר זה. כדי לעשות זאת, אפשרנו טכנולוגיות שמאפשרות לנו לראות את המעבר הדינמי של הטפיל הזה ולכמת את התופעה הזו.

זה מה שלורנה ו-MI יסבירו בפרוטוקולים אלה. מחקר זה נערך בחלקו בשיתוף פעולה עם הקבוצות של ד"ר לר מאוניברסיטת המבורג בגרמניה וד"ר מריה קבו כאן בבית החולים קליניקה וקיבל את המימון הכללי של פיון סלקס שנמצא וה-CIA המיניסטריאלי זיהום באספניול מתחיל מתורם M נגוע בטפילי GFP קטלניים או לא קטלניים ב-10% טפיל. כדי לבדוק טפיל, קח טיפת דם קטנה מווריד זנב העכבר והאריך אותה במיקרוסקופ.

החלק מכתים מטריים עם GIMs. תמיסה תאפשר הדמיה של כדוריות דם אדומות נגועות לאחר ייבושם, לתקן את מריחת הדם במתנול למשך שתי דקות, למרוח GIMs תמיסה ולדגור למשך 20 דקות. שטפו את השקופית במי הברז הנוכחיים וייבשו ספרו את אחוז ה-PBC על סך ה-RBCs באמצעות מיקרוסקופ אור עם פי מאה שמן. המטרה.

להדביק עכברים בטפילים קטלניים או לא קטלניים המתקבלים מדם הזנב של עכברים תורמים מדוללים ב-PBS. התאימו את המינון להזרקת חצי מיליון טפילים לעכבר על מנת להגיע לטפיל היקפי של 1% ביום השלישי לאחר ההדבקה והזריקו Intraperitoneal. לחלופין, ניתן להשתמש ב-RBCs עם תווית FITC בבקרה.

בעלי חיים אוספים מיליליטר אחד של דם עורקי מעכבר ושוטפים את הכדור על ידי צנטריפוגה ב-PBS המכיל EDTA respan בתמיסת FITC ודוגרים במשך שעתיים בחושך בתסיסה עדינה. לאחר זמן זה, הסר את הסופרנטנט על ידי צנטריפוגה ושטוף בהרחבה. יש להזריק לעכבר ביקורת כדי להגיע לממוצע של 1% במחזור הדם ההיקפי ולהמשיך לניסויים in vivo.

שלום, אני מיג'ה. כדי לדמיין את הטחול in vivo, עלינו לבצע סינרגיה קטנה של החיה כדי לחשוף את הטחול בטכניקה זו. למדתי זאת מסטפני GR במעבדה של העובדת הייזלר, לה אני רוצה להודות ועכשיו אראה לכם כיצד להמשיך.

הדמיה של מיוזה נגועה מבוצעת ביום השלישי לאחר ההדבקה כאשר הפראט הוא 1% בשני הזנים. שמור על העכבר מורדם ובטמפרטורה מווסתת לאורך כל ההליך. הגן על העיניים מפני ההידרציה וודא שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי פינג של כרית כף הרגל לפני שתמשיך על מנת להקל על מתן תוך ורידי של חומרים.

במהלך הניסוי, קנולציה של וריד זנב העכבר כדי לבנות את הצינורית. הכנס מחט קטנה בקצה אחד של הצינור והמוליך שלה בקצה השני. טען את הצינורית בבועות פיזיולוגיות להסרת מלח, ובדוק שהתמיסה זורמת כהלכה דרך הצינורית.

הווריד הרוחבי של הזנב יהיה נקי. שפר את הנראות שלו על ידי ביצוע כיווץ רך בבסיס הזנב. הכניסו את קצה הצינורית לווריד.

הופעת הדם תעיד על כך שהמחט ממוקמת היטב. אם לא, חזור על הקנולציה במעלה הזרם של הווריד, ואז תקן את הצינורית לזנב באמצעות דבק וסרט. חשוף את החלק התחתון של הטחול דרך חתך קטן בעור ובשרירים בצד הגבי השמאלי של החיה.

הניחו טחול במקום בו נצפית פחות תנועת נשימה ומרחו PBS על המשטח החשוף כדי לשמור עליו נקי משיער העכבר ולחות. אטום את הטחול עם שינה מכסה כדי לאפשר הדמיה. שלום, שמי לורנה.

הפרוטוקול המוצג יאפשר לנו לדמיין את התנועה של טפילי PULI דרך הטחול. זה התאפשר הודות לטפילים טרנסגניים GFP. תרומה נאה על ידי ג'יימס ברנס מאוניברסיטת דרקסל.

תנועת הדמיה של טפילים פלואורסצנטיים תאפשר לנו לדעת אם יש הבדל בהתנהגות בין זנים קטלניים ולא קטלניים. ניסויי מיקרוסקופיה של וידאל בוצעו במיקרוסקופ מולטיפוטון של לייקה, המצויד במערכת דגירה עם בקרת טמפרטורה ומטרה של 63 x גליצרול. הניחו את החיה על במת המיקרוסקופ עם טחול שינה מכוסה הפונה כלפי מטה אל המטרה. בתחילה.

הדמיה של הטחול בהגדלות נמוכות יותר תספק מבט כללי על מבנה המיקרו סירקולטורי של האיבר. מקדו את הטחול באמצעות רקמות אוטופלואורסצנטיות טפילי GFP נצפים עוברים באזורים השונים של הטחול. שלום, שמי מריה אלבו ממרכזים מדעיים וטכנולוגיים מאוניברסיטת ברצלונה, ואנו נבצע הדמיה תוך חיונית של הטחול.

על מנת לחקור את זרימת הדם והניידות של כדוריות דם אדומות נגועות, נשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בסריקת תהודה המאפשרת הדמיה במהירות גבוהה ושימושית מאוד כדי למנוע את תנועת האיבר. זהו מיקרוסקופ ספקטרלי המאפשר לבחור את טווח הראייה. על מנת לצלם מהר מאוד, נבצע רכישה בו זמנית של שני הפלואורסצאין, התיוג וההשתקפות.

בחר אזורים שונים לתמונה בעזרת RBC, השתקפות, ניגודיות וצבעי וידאל כדי להעיד על מיקרו-כלי דם בטחול. כעת נסביר כיצד למדוד את ניידות הטפילים בזרימת הדם בכלי הדם באמצעות מיקרוסקופ וידאל ותוכנת תמונה J כדי לעקוב אחר תנועת הטפילים ברשת התלת-ממדית של העיסה האדומה. קבל תמונות דרך חמישה עומקי Z באמצעות מצב סריקה במהירות גבוהה.

המירו אוספי תמונות לסרטים צבעוניים מקודדי Z כדי להקל על מעקב אחר תאים פלואורסצנטיים בודדים. מידע מפורט מסופק בטקסט לעקוב אחר חלקיקים שונים לאורך זמן בעומק בכל סרטון באמצעות קואורדינטות X, Y, Z ו-T, ניתן לחשב ולייצג פרמטרים של ניידות כגון כיווניות, מהירות ממוצעת וזמן שהייה כמפות התפלגות כדי לאפשר ניתוח השוואתי בין אוכלוסיות זנים. ניתן לדמות את זרימת כלי הדם בטחול על ידי הזרקה מערכתית של מספר מולקולות פלואורסצנטיות המתוארות בטבלה התומכת כמו דקסטרין.

ובאמצעות ניגודיות השתקפות אריתרוציטים אנדוגניים סורקים את זרימת הדם בקו המרכז על ידי הגדרת כלי דם אופקית בכיוון סריקת לייזר ושימוש בממוצע קו משופר. בתמונות אלה, הפסים הנובעים מתנועת תאים ישמשו לחישוב זרימת הדם, לצילום תמונות של כלי דם בקטרים שונים ולאורך מחזור הלב כדי לפצות על תנודות. הטחול נחשב זה מכבר לקופסה שחורה בחקר המלריה וכאן פיתחנו גישת מיקרוסקופיה תוך-חיונית כמותית כדי לקבל תובנה לגבי הדינמיקה של זיהום הטפיל וזרימת הדם באיבר זה, מה שמאפשר לנו לענות על שאלות ביולוגיות חשובות כגון היצמדות in vivo של כדוריות דם אדומות נגועות לטחול.

תודה לכם.