Name: מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: למד מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית כמותית של הטחול לניתוח ניידות טפילי מלריה ודינמיקת זרימת דם. השיטה מאפשרת מעקב אחר טפילים GFP בדגם מכרסמים ומספקת תובנות לגבי אינטראקציות טפיל-מערכת חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה במיוחד ס Graewe וו &#39;Heussler לאימונים הראשוני קלט רציף במיקרוסקופ intravital של טפילי מלריה, כדי ג&#39;יי ברנס על תרומת ה-GFP טפילים מהונדס, א&#39; בוש (יחידת Confocal, CCiT-UB, IDIBAPS) סיוע בניתוח תמונה וכימות ועל פ Astola לקבלת סיוע טכני. אנו מודים tous ר Caralt I. עבור הפקת וידאו. MF הוא מקבל מלגת בוגר בכלליות של קטלוניה. הפ הוא פרופסור מחקר ICREA. עבודה במעבדה של הפ ממומנת על ידי תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) מענק לפי הסכם N ° 242095, על ידי קרן פרטית CELLEX (קטלוניה, ספרד), ועל ידי משרד ספרדית למדע וחדשנות ( SAF2009-07760).

<ol><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li>
<li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+enters+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li>
<li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+dermis+of+the+mammalian%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li>
<li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li>
<li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li>
<li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb%2Fc+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li>
<li>Linden, M. vander, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li>
<li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowdler%2C+AJ+%22The+complete+spleen%22">The complete spleen</a>. , Totowa. Humana Press. (2002).</li>
<li>Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+comparing+T+lymphocyte+trafficking+to+the+spleen+and+the+mesenteric+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).</li>
<li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li>
<li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria%3A+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li>
<li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יישום של מיקרוסקופיה intravital של הטחול במודל זה מלריה מכרסם פתחה את האפשרות לחקור את המעבר הדינאמי של טפילים באמצעות איבר זה שעד עתה נחשב &quot;קופסה שחורה&quot; בשל שיקולים טכניים. כאן, מאמץ גדול הושם להתאים שיטה כמותית המאפשרת ניתוח השוואתי של קווי טפיל שונה ברמות יחיד האוכלוסייה. לעומת רקמות ותאים אחרים שהיו צילמו לפני כן מלריה 3,5, הדמיה מעבר pRBCs דרך הטחול צריך לקחת בחשבון את שלושת ממדיות ואת מידור של האיבר, נוכחות תפוצה שונים עם מהירות איטית השטף 13,...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> TCS-Leica SP5 confocal מיקרוסקופ </td><td> Leica Microsystems, היידלברג, גרמניה </td><td> TCS-SP5 סידורי. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> קטמין (Ketolar 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> פייזר </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Midazolam 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​3 </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70,000 מגוואט dextran, מצומדות לטקסס האדום </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Isothiocyanate והעמסת, אני האיזומר (FITC) </td><td> סיגמא </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> סיגמא </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa כתם </td><td> סיגמא </td><td> GS1 </td><td> הפתרון הוא עבודה על 10% מים מזוקקים </td></tr><tr><td> Super Glue-3 Loctite </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופית intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

הופעתו של מיקרוסקופיה intravital במודלים ניסיוניים מלריה מכרסם אפשרה התקדמות גדולה לידיעת 1,2 אינטראקציות טפיל-המארח. לפיכך, הדמיה vivo של טפילי מלריה במהלך טרום האריתרוציטים בשלבים חשפו את הכניסה הפעילה של טפילים לתוך בלוטות הלימפה לעור 3, התפתחות מלאה של הטפיל בעור 4, ויצירת merosome hepatocyte הנגזרות להבטיח הגירה שחרורו של merozoites לתוך זרם הדם 5. יתר על כן, התפתחות של טפילים בודדים אריתרוציטים תועד לאחרונה באמצעות הדמיה 4D תיגר התצוגה הנוכחית שלנו על יצוא חלבון מלריה 6. לפיכך, הדמיה intravital השתנה באופן קיצוני דעתנו על אירועי מפתח בפיתוח Plasmodium. למרבה הצער, מחקרים המעבר הדינאמי של טפילי מלריה דרך הטחול, איבר הלימפה העיקריים מותאם להפליא כדי לנקות אדום נגוע בתאים lood חסרים בשל אילוצים טכניים. שימוש במודל Murine של המלריה Plasmodium yoelii ב Balb / c עכברים, יישמנו הדמיה intravital של הטחול ודיווח על שיפוץ ההפרש של אותה דבקות parasitized של כדוריות דם אדומות (pRBCs) לתאי מחסום המוצא fibroblastic עיסת אדום במהלך זיהום עם לא קטלני טפיל קו P.yoelii 17x בניגוד זיהומים עם קו 17XL P.yoelii טפיל קטלני 7. כדי להגיע למסקנות האלה, מתודולוגיה ספציפית באמצעות תוכנת ImageJ בחינם פותחה כדי לאפשר אפיון של התנועה תלת מימדי מהיר של יחיד pRBCs. התוצאות שהושגו עם פרוטוקול זה מאפשר לקבוע, מהירות כיווניות ומגורים זמן של טפילים הטחול, כל הפרמטרים פונה דבקות in vivo. בנוסף, אנו מדווחים על מתודולוגיה כימות זרימת הדם באמצעות מיקרוסקופ intravital ושימוש אונטערשיידferent צביעה סוכני לקבל תובנות לתוך המבנה microcirculatory מורכבת של הטחול. משפט ואתיקה כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו במתקני חיה של אוניברסיטת ברצלונה בהתאם להנחיות ופרוטוקולים אושרה על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת ברצלונה CEEA-UB (פרוטוקול לא DMAH: 5429). נקבה Balb / c עכברים של 6-8 שבועות של גיל התקבלו צ&#39;ארלס ריבר מעבדות.

אנחנו מראים את השיטה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הטחול בעזרת ה-GFP טפילי מלריה מהונדס ואת כימות של ניידות טפיל ואת זרימת הדם בתוך איבר זה.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

הופעתה של המיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital microscopy) במודלים ניסיוניים של מלריה במכרסמים אפשרה התקדמות משמעותית בהבנת האינטראקציות בין הטפיל למארח 1,2. ...

בנוהל זה, אנו מציגים גישה של מיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital) כמותית להערכת הדינמיקה של מעבר טפילים דרך הטחול. במודל של מלריה במכרסמים, עכברים שנדבקו בטפילים טרנסגניים המבטאים GFP מוכנים למיקרוסקופיה תוך-חיה של הטחול; קניולציה של וריד הטחול תאפשר הזרקה של צבעים תוך-חיים. במהלך הניסוי, מצולמים תאים פלואורסצנטיים הנעים באזורים שונים של הטחול.אנו מספקים את המתודולוגיה לתיאור ניידות טפילים במדור האיטי התלת-ממדי של המחית האדומה ומחשבים את זרימת הדם בכלי הדם. פרמטרים אלה שימשו להשוואת הדינמיקה של הטחול בשני זני PULE. שלום לכולם.שמי הוא Nando El Portillo ואחת משאלות המחקר המרכזיות במעבדה שלי היא הניסיון להבין את תפקידו של הטחול במלריה. Splenomegaly היא אחד מסימני ההיכר של מחלה זו, אך בשל בעיות טכניות ואתיות, ניסיון לבצע מחקרים על איבר זה הוא קשה מאוד. כדי לעשות זאת, הפעלנו טכנולוגיות המאפשרות לנו לראות את המעבר הדינמי של טפיל זה ולכמת תופעה זו.זהו הדבר שלורנה ו-MI יסבירו בפרוטוקולים אלו. מחקר זה נערך בחלקו בשיתוף פעולה עם הקבוצות של ד"ר Ler מאוניברסיטת המבורג בגרמניה וד"ר מריה Kbo כאן בבית החולים Clinic, וקיבל מימון כללי מהקרן fion Cellex ומשרד ה-CIA בספרד. הזיהום מתחיל עם תורם M שהודבק בטפילים GFP, קטלניים או לא קטלניים, בריכוז של 10% טפילים. כדי לבדוק את נוכחות הטפילים, קחו טיפה קטנה של דם מווריד הזנב של העכבר והפריסו אותה על גבי מיקרוסקופ.בצעו צביעה כולומטרית עם תמיסת GIMs על שקופית. הפתרון יאפשר ויזואליזציה של תאי דם אדומים נגועים לאחר ייבוש; קבעו את מריחת הדם באמצעות Methanol למשך שתי דקות, מרחו את תמיסת ה-GIMs והדגירו למשך 20 דקות. שטפו את השקופית במי ברז זורמים ויבשו. ספרו את אחוז ה-pbcs מתוך סך כל ה-RBCs באמצעות מיקרוסקופ אור עם עדשה שמנית של 100x עם שמן.הדביקו עכברים בטפילים קטלניים או לא קטלניים שהושגו מדם הזנב של עכברי תורם המדולל ב-PBS. התאימו את המינון להזרקת חצי מיליון טפילים לכל עכבר, כדי להגיע לעומס טפילים פריפריאלי של 1% ביום השלישי לאחר ההדבקה, והזריקו באופן תוך-peritoneal (Intraperitoneal). לחלופין, ניתן להשתמש ב-RBCs המסומנים ב-FITC כביקורת.אספו מיליליטר אחד של דם עורקי מעכבר ושטפו את המשקע על ידי סבוב במרכז centrifuge ב-PBS המכיל EDTA, השבילו בפתרון FITC והדגירו למשך שעתיים בחושך תוך써 ערבול עדין. לאחר זמן זה, הסירו את העילוי על ידי סבוב במרכז centrifuge ושטפו באופן יסודי. הגזירה לעכבר בקרה כדי להגיע לממוצע של 1% בסירקולציה פריפריאלית והמשיכו לניסויים in vivo.שלום, אני מיז'ה. כדי לדמות את הטחול in vivo, עלינו לבצע ניתוח קטן בבעל החיים כדי לחשוף את הטחול; כמובן שאת הטכניקה הזו למדתי מסטיפני GR במעבדה של ווקר הייסלר, שאתה אני מבקשת להודות לו, וכעת אראה לכם כיצד לפעול.דימוי של מיאוזיס מזוהם בוצע ביום השלישי לאחר ההדבקה, כאשר הפרט הוא 1% בשני הזנים. יש להשאיר את העכבר תחת הרדמה ובטמפרטורה מזורגלת לאורך כל הפרוצדורה. יש להגן על העיניים מפני התייבשות ולוודא שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי נקישה על כרית כף הרגל לפני ההמשך, כדי להקל על מתן חומרים בווריד.במהלך הניסוי, בצעו קניולציה של וריד הזנב בעכבר להקמת הקניולה. הכניסו מחט קטנה לקצה אחד של צינור ואת המיישם שלו לקצה השני. מלאו את הקניולה בתמיסת סליין פיזיולוגית תוך הוצאת בועות, ובדקו שהתמיסה זורמת כראוי דרך הקניולה.יש לבצע קנולציה נקייה של הווריד הצדי (lateral vein) בזנב. הגבירו את נראותו של הווריד על ידי ביצוע לחץ קל בבסיס הזנב. הכניסו את קצה הקנולה לתוך הווריד.הופעת דם תעיד על כך שהמחט ממוקמת היטב. אם לא, חזור על פעולת הקניולציה במעלה הווריד, ולאחר מכן קבע את הקניולה לזנב באמצעות דבק וסרט הדבקה. חשוף את החלק התחתון של הטחול באמצעות חתך קטן בעור ובשרירים בצד הגבי השמאלי של בעל החיים.הנח את הטחול במיקום שבו נצפתה תנועת נשימה מועטה, ומרח PBS על השטח החשוף כדי לשמור עליו נקי משערות העכבר ולהבטיח הידרציה. הנח כיסוי מגן על הטחול כדי לאפשר ויזואליזציה. שלום, שמי לורנה.הפרוטוקול המוצג יאפשר לנו להדמיות את תנועת טפילי PULI דרך הטחול. הדבר התאפשר הודות לטפילים טרנסגניים המבטאים GFP. תרומה נדיבה מאת James Burnes מאוניברסיטת Drexel.דימות של תנועת טפילים פלואורסצנטיים יאפשר לנו לדעת אם קיימים הבדלים בהתנהגות בין זנים קטלניים ללא-קטלניים. ניסויי המיקרוסקופיה הובילו לביצוע במיקרוסקופ מולטיפוטון של Leica, המצויד במערכת אינקובציה עם בקרת טמפרטורה ועדשה אובייקטיבית 63 x גליצרין. הניחו את בעל החיים על במה המיקרוסקופ עם כיסוי זכוכית כאשר הטחול פונה כלפי מטה אל העדשה.הדמיה של הטחול בהגדלות נמוכות תספק מבט כללי על מבנה המיקרו-סירקולציה של האיבר. מחדים את המיקוד בטחול תוך שימוש באוטופלואורסצנציה של הרקמה, כאשר טפילים המסומנים ב-GFP נצפים בעודם עוברים באזורים השונים של הטחול. שלום, שמי מריה אלבו מהמרכזים המדעיים והטכנולוגיים של אוניברסיטת ברצלונה, ואנו נבצע הדמיה תוך-חיה (intravital imaging) של הטחול.על מנת לחקור את זרימת הדם ואת הניידות של תאי דם אדומים נגועים, נשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בסריקה רזוננטית (resonant scan), המאפשרת הדמיה במהירות גבוהה המועילה מאוד למניעת השפעות תנועת האיבר. זהו מיקרוסקופ ספקטרלי המאפשר לבחור את טווח הראייה. כדי לבצע הדמיה מהירה מאוד, נבצע רכישה סימולטנית של שני סימוני הפלואורסצאין וההחזרה.בחרו אזורים שונים להדמיה בעזרת RBC, השתקפות, ניגודיות וצבעי Vidal כדי להוכיח את המיקרו-וסקולטורה של הטחול. כעת נסביר כיצד למדוד את ניידות הטפיל בזרימת הדם בכלי הדם באמצעות מיקרוסקופיית Vidal ותוכנת Image J למעקב אחר תנועת הטפיל ברשת התלת-ממדית של המחית האדומה. רכשו תמונות בחמישה עומקי Z באמצעות מצב סריקה במהירות גבוהה.המירה של ערימות תמונות לסרטוני צבע מקודדי Z כדי להקל על מעקב אחר תאים פלואורסצנטיים בודדים. מידע מפורט מסופק בטקסט למעקב אחר חלקיקים שונים לאורך זמן בעומק בכל סרטון באמצעות קואורדינטות X, Y, Z ו-T. ניתן לחשב פרמטרי ניידות, כגון כיווניות, מהירות ממוצעת וזמן שהייה, ולהציגם כמיפויי התפלגות כדי לאפשר ניתוח השוואתי בין אוכלוסיות של זנים. ניתן לצלם זרימה כלי דם בטחול על ידי הזרקה סיסטמית של מספר מולקולות פלואורסצנטיות המתוארות בטבלה התומכת, כגון דקסטרין.ובאמצעות סריקה בניגוד השתקפות של תאי דם אדומים אנדוגניים, סרקו את זרימת הדם בקו המרכז על ידי הצבת כלי הדם באופן אופקי לכיוון סריקת הלייזר ושימוש בממוצע קו משופר (enhanced Line average). בתמונות אלו, הפסים הנובעים מתאים נעים ישמשו לחישוב זרימת הדם; צלמו כלי דם בעוביים שונים ובמהלך מחזור הלב השלם כדי לפצות על תנודות. הטחול נחשב מזה זמן רב כ"קופסה שחורה" במחקר המלריה, וכאן פיתחנו גישה של מיקרוסקופיה אינטרה-וייטלית כמותית כדי להשיג תובנה לגבי הדינמיקה של זיהום הפarasite וזרימת הדם באיבר זה, מה שמאפשר לנו להתייחס לשאלות ביולוגיות חשובות, כגון היצמדות in vivo של תאי דם אדומים נגועים לטחול.תודה ו-.

intravital-microscopy-spleen-quantitative-analysis-parasite-mobility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפילים במקרופאגים שמקורם במח עצם (BMM). תאי המקרופאגים נגועים בשלבים הפולשניים התנועתיים והלא תנועתיים של לישמניה, פרומסטיגוטים מטאציקליים ואמסטיגוטים, בהתאמה. הטפילים פולשים למקרופאגים, מופנמים לחלל טפילי ומתרבים בפנים. צמיחת הטפיל התוך-תאי מכומתת באמצעות מיקרוסקופ על צביעה פלואורסצנטית של גרעיני המקרופאגים והטפילים.

בדיקה חוץ גופית לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפיל במקרופאגים

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם...

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

מאמר זה מדווח על שיטה מפורטת למדידה דינמית וכימות של מהירות זרימת הדם בתוך כלי דם בודדים של כלי הדם בכבד העכבר באמצעות הדמיית מיקרוסקופיה תוך-חיונית בשילוב עם מתודולוגיה ספציפית לרכישת וניתוח תמונה.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

פולש טפיל המלריה והמשכפל בתוך תאי דם אדומים. ההערכה מדויקת של פלישת merozoite וparasitemia לכן חיונית בהערכה במהלך הידבקות במלריה. כאן אנו מתארים זרימה cytometry פרוטוקול מבוסס למדידת הפרמטרים הללו במודל עכבר של מלריה.

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

יישום פשוט זה של מיקרוסקופיה תוך-חיונית של ורידי מזנטריה בעכברים יכול לשמש במודלים שונים של דלקת כדי לצפות באינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וטסיות-לויקוציטים.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

כל המינים לישמניה פתוגניים שוכנים וישכפלו בתוך המקרופאגים של מארחיהם חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדביק מאתר מקרופאגים הנגזרות מח עצם בתרבות עם לישמניה, ואחריו כימות מדויק של קינטיקה גידול תאיים. שיטה זו שימושית עבור לימוד בודדים הגורמים המשפיעים על אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, לישמניה התקפה אלימה.

כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

למד מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית כמותית של הטחול לניתוח ניידות טפילי מלריה ודינמיקת זרימת דם. השיטה מאפשרת מעקב אחר טפילים GFP בדגם מכרסמים ומספקת תובנות לגבי אינטראקציות טפיל-מערכת חיסון.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

גלה סרטונים נוספים