בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה במבחנה להעברת תאי גזע ממיקרוספירות צ'יטוזן לפיגום ג'ל קולגן, קציר ותרבית. תאי הגזע הראשוניים של השומן מתחלבים ומשחזרים תכשיר של מיקרוספירות צ'יטוזן. לאחר מכן, זרעו את תאי הגזע על המיקרוספירות של הצ'יטוזן ותרבו אותם בתוספת צלחת תרבית ממברנה בגודל שמונה מיקרון כדי לייצר CSM טעון CS ולבסוף ערבבו את מערכת אספקת המיקרוספרה עם פיגום ג'ל קולגן תלת מימדי.

בסופו של דבר, מערכת CSM זו מציעה פוטנציאל לשימוש ברפואה רגנרטיבית ומתן תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הזרקת תאים או מיקרו-אנקפסולציה, הוא היכולת של תאים להיצמד לחומר נשא ולהתמיד לאחר היישום הראשוני. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שלמיקרוספירות אסאן יש מטען סטטי מובנה.

והעמסת תאים על מיטת מיקרוספרה תהיה מאתגרת מבלי להפריע להם. כריתה ושטיפה, רקמת שומן פרינאלית ואפידרמיס מעטיפה טוחנת את הרקמה, ולאחר מכן מעבירה גרם אחד עד שניים ל-25 מיליליטר של HBSS המכיל 1% FBS. לאחר הצנטריפוגה, אוספים את שכבת רקמת השומן הצפה החופשית לבקבוק ארלנמאייר בנפח 125 מיליליטר.

הוסף 25 מיליליטר של קולגנאז סוג 2 ודגר תגובה על שייקר מסלולי. כעת הסר בזהירות את השבר הנוזלי מתחת לשכבת השמן והשומן וסנן ברצף דרך מסנני רשת ניילון של 170 מיקרון. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה לאחר שתי שטיפות עם 25 מיליליטר.

HBSS Resus, השעו את הגלולה ב-30 מיליליטר של מדיום גידול מזן פרו תוסף. פצלו את תאי הגזע שמקורם בשומן המטוהר לשתי צלוחיות תרבית T 75 והגבירו את תכשיר A SC באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. פרוטוקול CSM זה הוא תהליך תחליב מים בשמן המשתמש בטכניקת תחליב יוני.

מתחלב שישה מיליליטר של תמיסה מימית של צ'יטוזן ב-100 מיליליטר של תערובת פאזות שמן באמצעות ערבוב עילי ומגנטי בו זמנית בכיוונים מנוגדים למשך שעה אחת לתחליב המים והשמן היציב, הוסף 1.5 מיליליטר של 1% אשלגן הידרוקסיד ב-n אוקטלי כל 15 דקות למשך ארבע שעות. לאחר השלמת תגובת הצליבה היונית, יש לשפוך לאט את שלב השמן ולהוסיף מיד את הכדורים ל -100 מיליליטר אצטון. שוטפים את הכדורים באצטון עד להסרת שלב השמן לחלוטין.

לאחר מכן יבש את הכדורים המשוחזרים בוואקום. ייבוש קובע את שטח הפנים הממוצע של גודל חלקיקי CSM למיליגרם ואת נפח היחידה המעוקב באמצעות מנתח גודל החלקיקים. המשך לשטוף CSM שלוש פעמים במים סטריליים כדי להסיר מלחים שנותרו.

כעת עקרו את תכשיר CSM עם אלכוהול מוחלט לשימוש בניסויים בתאים בשפופרת זכוכית של 50 מיליליטר, ערבבו חמישה מיליגרם של מיקרוספירות עם מיליליטר אחד של תמיסת 0.5% TNBS בדגירה למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מוסיפים שלושה מיליליטר של שש חומצה הידרוכלורית רגילה ודוגרים בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר קירור הדגימות לטמפרטורת החדר, הוסיפו חמישה מיליליטר מים נטולי יונים ו -10 מיליליטר אתל אתר.

כדי לחלץ את ה-TNBS החופשי, הסר 5 מיליליטר מהפאזה המימית והתחמם ל-40 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 15 דקות כדי לאדות כל אתר שנותר לאחר קירור לטמפרטורת הסביבה. מדללים עם 15 מיליליטר מים בעזרת ספקטרופוטומטר. מדוד את הספיגה של מיקרוספירות הצ'יטוזן המוכנות ב-345 ננומטר באמצעות TNBS כריק.

מדוד גם את הצ'יטוזן המשמש להכנת CSM. כעת, חשב את מספר קבוצות האמינו החופשיות של CSM ביחס למספר הכולל של קבוצות אמינו בצ'יטוזן. אזנו חמישה מיליגרם של מעשן הסיגריות המעוקר ב-HBSS סטרילי בן לילה.

העבירו את ה-CSM לתוספת קרום של שמונה מיקרון ל-24 צלחות תרבית באר. לאחר שה- CSM התייצב, שאפו בזהירות את ה- HBSS. כעת הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום גידול לחלק הפנימי של התוספת, ו-700 מיקרוליטר של אמצעי גידול לחלק החיצוני של התוספת. החייאה.

השעו את תאי הגזע שמקורם בשומן ב-200 מיקרוליטר של גדילה, מדיום וזרע מעל CSM בתוך צלחת התרבית. הכנס את הדגירה למשך 24 שעות בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. העבירו את CSM טעון SC לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי מבלי להפריע לתאים שנדדו לתוך קרום ההכנסה.

כעת הסר את המדיום הנותר והוסף 250 מיקרוליטר של מדיום גידול טרי לכל צינור. הוסף 25 מיקרוליטר של חמישה מיליגרם לתמיסת MTT מיליליטר ודגירה למשך ארבע שעות. הסר את המדיה והוסף 250 מיקרוליטר של מערבולת תחמוצת דימתיל סולף כדי להמיס את הצורה כצנטריפוגה מורכבת, ה-CSM ב-2, 700 גרם למשך חמש דקות.

מדוד את ספיגת הסופרנטנט ב-570 ננומטר באמצעות 630 ננומטר כהפניה. המשך לקבוע את מספר התא המשויך ל- CSM ביחס לערך הספיגה המתקבל ממספרים ידועים של A SC בר קיימא. מערבבים חמישה מיליגרם של CSM טעון SC עם 7.5 מיליגרם למיליליטר. קולגן סוג 1 המופק מחולדות.

גיד הזנב, התאם את ה-pH ל-6.8 באמצעות שני נתרן הידרוקסיד רגיל ושפך לצלחת תרבית. מכניסים לסיבים כעת מעבירים לצלחת של 12 בארות ודוגרים למשך 30 דקות. המשיכו לרענן את המדיום לג'ל הקולגן A-S-C-C-S-M כל יומיים בתקופת הדגירה.

כמו כן, ניטור, שחרור והגירה של תאים ממעשן הסיגריות לג'ל באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות. דוגמה זו מתארת את אסטרטגיית המבחנה להעברת תאי גזע שמקורם בשומן ממיקרוספירות צ'יטוזן לפיגום ג'ל קולגן. תמונות SEM ו-TEM מצביעות על הכנה של CSM נקבובי בגודל אחיד.

דגירה של המיקרוספירות עם תאי גזע ראשוניים שמקורם בשומן מצביעה על 4,000 תאים למיליגרם של סידן CSM. צביעה של SC מראה התפשטות על פני מעשן הסיגריות עם פילופודיה מתרחבת לתוך החריצים הנקבוביים של המיקרוספרה. כאשר CSM טעון התאים מעורבב עם ג'ל הקולגן, התאים נודדים לתוך הג'ל וניתן לעקוב אחריהם לאורך זמן.

ההשלכות של טכניקה זו מתרחבות באופן מיידי לטיפול באובדן רקמות מסיבי וכרוני. עם זאת, למשטר טיפול זה יש הרבה יותר פוטנציאל בשל הרבגוניות שלו להשתלב עם מגוון תאים ו/או ביו-חומרים המשמשים לטיפול ברמות שונות של אובדן רקמות רכות ולב. ספק אם שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי העברת תא מארח.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון זריקות, אספקת תרופות טיפוליות, פיתוח מערכות היברידיות להעברת תאים ותרופות טיפוליות יחד.