קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסנן צמחים נגועים בנמטודות של קשרי שורשים. ראשית, גדלו שתילים בריאים באדמה חולית או בשקיקי גידול. לאחר מכן, הכינו תמיסת הדבקה (inoculum) של נמטודות קשרי שורשים בשלב juvenile השני עם רמה גבוהה של זיהום.

לאחר מכן, חטטו והדביקו כראוי את השתיליים. לבסוף, העריכו את התפתחותן של מסות ביצי נמטודות במערכת השורשים של המארח. נדגים סריקות בעלות תפוקה גבוהה ונמוכה של צמחים עם שורשים, ללא נמטודות.

והיתרונות העיקריים של מערכת הסריקה ברזולוציה גבוהה (high throughput) הם הצורך בשטח מוגבל להצמחת הצמחים והקלות בהערכת הזיהום. גישות אלו יובילו לזיהום אחיד וניתן לשחזור, זיהום של שורשי הצמחים בנמטודות, ובכך להערכה טובה יותר של מעמדו של הצמח כמארח. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בהערכת צמחים עם נמטודות בשורשים עשויים להתקשות בשל אי-שימוש בשלב ההתפתחותי המתאים להדבקת השורשים בנמטודות.

כמו כן, באמצעות שימוש בנמטודות בשלב זחליים מידויים בני מספר ימים, אשר בדרך כלל בעלי יכולת הדבקה נמוכה. את הפרוצדורה יעמידו בהדגמה סטודנטים לתואר ראשון ולתואר שני. במעבדה שלי, אדגים את הפרוצדורה לסריקה בשקיקי גידול עבור בדיקות בעציצים. שתלו זרעי עגבנייה בעציץ בודד מלא באדמה עשירה בחומר אורגני, כגון sunshine mix, תוך שמירה על חממה בטמפרטורה של 22 עד 28 °C לאחר הנבטה.

יש לדשן פעם בשבוע עם miracle grow, כשבועיים לאחר ההנבטה ובשלב שני העלים האמיתיים. יש להעביר שתילים בודדים לעציצים מלאים באדמה חולית סטרילית, המורכבת מ-90% חול ו-10% חומר אורגני. יש להוסיף דשן לשחרור איטי מסוג osmo coat ולהחזיק בחממה בטמפרטורה של 22 עד 28 degrees Celsius למשך שבועיים. יש להמשיך לדשן פעם בשבוע עם miracle grow.

עבור סריקות בתפוקה גבוהה, יש לשתול את זרעי הצמחים ישירות בתבניות בקרקע חולית. כסו בניילון נצמד עד לנביטה ושמרו בתנאים שתוארו קודם לכן. לאחר הנביטה, הוסיפו דשן בשחרור איטי מסוג Osmo coats ודשנו פעם בשבוע ב-miracle grow; ניתן להנביט זרעים בצלחת פטרי המרופדת במספר שכבות של נייר Kim White המוצבת באינקובטור בטמפרטורה של 25 עד 28 degrees Celsius, ולאחר מכן העבירו את השתילים לשקיות בודדות.

לחלופין, ניתן להניח את הזרעים בחריץ הנייר כדי להנביט אותם ישירות בתוך שקיקים אישיים. הניחו את השקיקים בתוך תיקיית תלייה מפלסטיק לכל תיקייה, וסדרו את התיקיות על מדף במצב אנכי.

הנח את המתקן בתא סביבתי מבוקר בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס ובמחזור של 16 שעות אור ושמונה שעות חשיכה. השקה את השקיות פעם או פעמיים ביום במים מזוקקים (reverse osmosis water) כ-10 עד 14 ימים לאחר הזריעה. כאשר התפתח מערכת שורשים נאותה עם קצוות שורש שלישוניים, השתילים מוכנים להחדרה. לפני תחילת חילוץ הביצים, שטוף היטב את אזור העבודה ואת כל הכלים במים חמים כדי למנוע זיהום.

הניחו דלי בכיור לאיסוף התמיסות הזורמות, והניחו תמיכת רשת מתכת מעליו. ערמו שלושה מסננים מלמעלה למטה לפי סדר גודל נקבים יורד, כך שהביצים ייאספו במסנן של 25 מיקרון. גזרו את חלקי העלה העליונים של הצמחים הנגועים והשליכו אותם בזהירות.

הוציאו את הצמח מהעציץ ושטפו את השורשים על ידי טבילה בדלי פלסטיק מלא במים. שטפו את השורשים באופן נוסף תחת מים זורמים עד להסרת כל חלקיקי האדמה. לאחר מכן, הוציאו ביצי נמטודות של קשרי שורשים משורשי עגבנייה נגועים.

ראשית, גזרו את השורשים לחתיכות קטנות באמצעות מספריים והשליכו את השורש הראשי. העבירו את השורשים הקצוצים מצמח בודד לצנצנת פלסטיק גדולה עם מכסה, והוסיפו כמות מספקת של תמיסת bleach בריכוז 10% כדי לכסות את השורשים. סגרו את המכסה ונערו את הצנצנת במשך שתי דקות.

פתחו את הצנצנת, שפכו את השורשים על הנפה העליונה ושטפו באמצעות צינור המחובר לפיית התזה. שטפו היטב עד להסרת כל ריח המלבן. השתמשו בפטיש גומי כדי להקיש על דפנות הנפות כדי למנוע סתימה שלהן.

עצרו, הסירו את הנפה העליונה ושטפו את השאריות. וכך גם את הנפה השנייה. הסירו את הנפה השנייה ואספו את השאריות העדינות, הכוללות את הביצים מהנפה האחרונה, באמצעות זרימה עדינה מבקבוק מים.

הזיזו את השאריות לצד אחד של הנפה. אספו את השאריות ואת הביצים לכוס כימיקלית נקייה עם כמות מינימלית של מים. העבירו את המים שנאספו בדלי דרך נפת 25 micron כדי לאסוף ביצים שעשויות היו להישמט.

שטפו היטב במים ואספו לאותו כלי כימי. רפדו סלסילת מתכת נקייה במספר שכבות של נייר סופג Kim. נגבו והניחו על צלחת פטרי מזכוכית, תוך השארת מרחק של סנטימטר אחד בין התחתית לבין הצלחת.

שפכו את ביצי הנמטודות שהופקו על הנייר שבתוך סל הסריג. הוסיפו מספיק נוזל כך שתחתית סל הסריג תיגע במשטח המים אך לא תהיה טבולה במים.

כסו את החלק העליון במכסה פלסטיק מדי יום. בדקו אם חלה אידוי של מים והוסיפו מעט מים לצלחת פטרי כך שתחתית הסל תגע במים. כדי למנוע מהביצים להתייבש, אחת לשני ימים לאורך שישה עד שמונה ימים, אספו את המים המכילים את הנמליליים בשלב השני או J twos מצלחת הפטרי אל תוך כלי כימי (beaker).

במידה ולא נעשה בהם שימוש, יש לאוורר מיד את האינוקולום שנאסף בטמפרטורת החדר באמצעות אספקת אוויר מעבדתית או אוויר המופק על ידי משאבת אקווריום. התחילו את השלב הבא על ידי ערבוב של האינוקולום על פלטת ערבוב מגנטית במהירות נמוכה. השתמשו בשלוש מנות (aliquots) של הנמטודות שנאספו.

כדי לספור את מספר ה-J twos בחשבונאות. תחת זכוכית כיסוי או צלחת, חשב את הממוצע וקבע את הנפח הרצוי להחדרה. אלו הם J twos כפי שהם נראים תחת מיקרוסקופ.

בדרך כלל, משתמשים ב-3000 J twos לכל צמח בעציצים וב-500 J twos לצמחים הגדלים במגש שתילים. לפני חידולם הצמחים, ודאו שהקרקע לחה אך לא רטובה מדי. עבור חידולם בעציצים, חפרו שלושה חורים בעומק של כחצי מעומק העציץ בחול סביב כל מערכת שורשים של עגבנייה.

בעזרת עיפרון, חסנו כל צמח על ידי העברת ה-J twos לשלוש החורים באמצעות פיפטה. לאחר מכן, כסו את החורים עבור בדיקות הסריקה בעלת התפוקה הגבוהה במגשים. השתמשו במחט בעלת קצה אטום ומודגש עם חורים בצדדים, המודבקת לפיפטה של 5 mL.

הטה את הפטה של הפ pipette כדי להחדיר את ה-J twos אל תוך הקרקע. השהה את הצמחים בבית חממה בטמפרטורה של 24 to 27 °C למשך שישה עד שמונה שבועות. המשך לדשן פעמיים בחודש באמצעות miracle grow.

להערכת הזיהום. חיתכו את החלקים העליונים, הוציאו בזהירות את הצמחים מהעציצים ושטפו את השורשים. לאחר מכן, צבעו את מסות הביצים בכחול על ידי טבילת השורשים בריכוז של one milligram per liter.

ביצוע הברשה (glossing) של Aerio למשך 15 דקות. שטפו את השורשים במים והעריכו את התוצאות על ידי ספירה של מסות ביצים צבועות על גבי מערכות שורשים בודדות. ניתן להשתמש במגניף מוואר כדי לסייע בויזואליזציה של מסות הביצים, בספירת הנמטודות, בבדיקת האינוקולום, ובערבוב על פלטת ערבוב מגנטית כפי שתיאור בעבר.

הוצאו את השקיות מהתיקיות התלויות והניחו אותן על משטח אופקי. הקרינו כל שקית עם 1,500 J2 בחמישה מיליליטרים. הרימו את הכיסוי הפלסטי של השקית ופזרו את הנמטודות באופן שווה על פני השטח של השורשים.

שמרו את השקיות במצב אופקי למשך 24 שעות לאחר ההסמכה, כשהן מכוסות בנייר כהה כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר מכן, החזירו את השקיות לתיקיות התלייה בתוך המים בתא הגידול. יש להשקות את הצמחים פעם או פעמיים ביום למשך כשלושה ימים בתמיסת Hoagland בריכוז חצי, עד להשגת תגובה לדשן.

בדרך כלל נצפה בירידה בחיוורון העלים (הירגזה של העלים) ובצמיחה נמרצת יותר של הנשירים. לאחר שלושה ימים, שמרו על השקיות לחות באמצעות מים. כ-30 ימים לאחר ההחדרה, השקו כל שקית בכ-10 עד 20 milliliters של 75 milligrams liter.

צביעה באוויר (Aero glossing). השארו את השקיות מוצפות בצבע במצב אופקי למשך הלילה. למחרת, רוקנו את השקיות והעריכו את מערכות השורשים על ידי ספירת מסות הביצים תחת שולחן מואר.

בתמונה מוגדלים שורשים של צמח עגבנייה מזוהם היטב, עם מסות ביצים נרחבות הצבועות בכחול. השימוש במגשים מאפשר סריקה של מאות צמחים במרחב גידול קטן. שקיות גידול מאפשרות גם הערכה מהירה, יעילה ולא הורסת של השורשים ושל זיהומי נמטודות, ללא צורך בשטיפת השורשים.

שיטה זו מאפשרת גם סריקה בעלת תפוקה גבוהה של אלפי צמחים במרחב גידול קטן. כאן מערכת השורשים של צמח cow P שגודל בשק מראה מסות ביצים שצבעו בכחול לאחר ההדבקה. תזמון הזיהום הוא קריטי מאוד בבדיקות צמחים עם נמטודות.

לפיכך, עיכוב של ההדבקה אפילו בכמה ימים עלול להוביל לרמות הדבקה נמוכות מאוד. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם כעת הבנה טובה של האופן שבו מדביקים ומעריכים צמחים עם נמטודות שורש (root knot nematodes). אל תשכחו שיש לטפל בשורשים המודבקים בנמטודות באופן נאות.

סטריליזציה באוטוקלאב של השורשים לפני השלכתם תגביל את התפשטות הנמטודה. כמו כן, יש להיזהר בשימוש בגליסין הניתן בריסוס בשל המינונים הגבוהים; הוא נחשב למסרטן.

לפיכך, עליכם להשתמש בכפפות בעת טיפול בשורשים שהודבקו בחומר כימי זה וכן בעת הכנתו.