Name: קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp. /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: למד שיטות סינון בקצב גבוה ונמוך לזיהוי צמחים נגועים בנמטודות Meloidogyne spp. הפרוטוקולים מאפשרים הערכת עמידות יעילה ללא הרס השורשים ותומכים בתוכניות הרבעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר Kaloshian המעבדה ממומנת על ידי מענק מטעם ארצות הברית המכון הלאומי המזון והחקלאות (2007-35607-17765). מחקר רוברטס המעבדה ממומנת על ידי תרומות של ארצות הברית הסוכנות לפיתוח בינלאומי (GDG-G-00-02-00012-00 ו-EDH-00-07-00005) ו יבש קליפורניה עמוד שעועית המייעצת.

1. שתיל עגבניות הצמיחה סירים ומגשים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל הדלי, מבחני עגבניות זרעי צמחים בסיר אחד אדמה אורגני עשיר כגון תמהיל סאנשיין. לשמור בחממה ב 22-28 ° C. לאחר הנביטה, לדשן פעם בשבוע עם נס-Gro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשבועיים לאחר הנביטה, בשלב נכון עלים 2, השתלת בנפרד את השתילים לתוך הסירים (10 ס&quot;מ קוטר ו -17 ס&quot;מ בעומק) מלא אדמה חולית סטרילית המכילה חול 90% ומערבבים אורגני 10%. הוסף Osmocote דשן שחרור איטי ולשמור בחממה ב 22-28 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. המשך להפרות צמחים פעם בשבוע עם נס-Gro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תפוקה גבוהה המסכים, זרעי צמחים ישירות מגשי באדמה חולית, מכסים את המגש בניילון נצמד ולשמור עד נביטה לעיל. לאחר הנביטה, להוסיף Osmocote דשן שחרור איטי ולדשן פעם בשבוע עם נס-Gro. </li></ol> 2. Cowpea צמיחה בתיקי שתיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seeds הם מונבטים או בצלחת פטרי, מצופה בכמה שכבות של נייר Kimwipe, והועברו ביחידות אל שקיות או ממוקם ישירות לתוך חריץ הנייר של הכיס ואת מונבטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקיות הפלסטיק הקובץ בתיקייה תלוי, 2 לכל תיקייה, ולסדר את התיקיות במעמד במצב אנכי. מניחים את המדף בחדר בסביבה מבוקרת, שמרו על טמפרטורה של 25-28 מעלות צלזיוס ו - 16 שעות אור / 8 מחזור H כהה. Racks גם יכול להישמר בחממה, אך דורשים נייר או עטיפת נייר נוקשה להציב על המדף משני צידי הגבעולים צמח, כדי להפחית את פוטנציאל זיהום פטרייתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את שקיות המים פעם או פעמיים ביום עם מים אוסמוזה הפוכה. בערך 10 עד 14 יום לאחר זריעה, כאשר מערכת שורשים נאותה עם טיפים שורש שלישוני פיתחה (איור 1), את השתילים מוכנים חיסון. </li></ol> 3. הפקת ביצים נמטודות הפקת הggs מהשורשים נגועים הוא שונה מכל פרוטוקול שפותח על ידי Hussey ו בארקר (1973). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה עד ארבעה ימים לפני חיסון נמטודות, לחלץ השורש קושר את הביצים נמטודות מהשורשים עגבניה נגועים. לפני תחילת שאיבת הביצית, לשטוף את אזור העבודה ביסודיות עם מים חמים, כדי למנוע זיהום. גם לשטוף במים חמים בלנדר, שני דליים, רשת תיל תמיכה, פטיש גומי, שלוש הנפות של 425, 90 ו 25 צמצם מיקרומטר, גליל המדורג ומספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסדר את הנפות מלמעלה למטה בסדר הבא: 425, 90 ו 25 צמצם מיקרומטר. הביצים יאספו על מסננת 25 מיקרומטר בתחתית. שים את הנפות על רשת תיל נתמך בכיור. שים דלי מתחת רשת תיל לאסוף את הפתרון באמצעות ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלק העליון של הצמח הנגוע (ים), המשמש כמקור הבידוד, וזורקים. מוציאים בזהירות את הצמח מהסיר. לשטוף את השורשים על ידי טבילה בדלי פלסטיק מלאה במים. יש לשטוף את השורשים נוסף לפי לרוץנינג מים עד חלקיקי הקרקע נשטפים מן השורשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את השורשים עם מספריים לחתיכות קטנות. השלך את השורש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השורשים הקצוצים מצמח אחד בצנצנת פלסטיק גדולה עם מכסה, להוסיף מספיק פתרון אקונומיקה 10% כדי לכסות את השורשים ולסגור את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הצנצנת המכילה את השורשים של 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הצנצנת ושופכים את השורשים על גבי מסננת העליון ולשטוף עם צינור מחובר נחיר ערפול. לשטוף היטב עד שכל ריח אקונומיקה נעלם. השתמש בפטיש כדי לנצל את הצדדים של הנפות כדי למנוע סתימת נקבוביות מסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסננת למעלה לשטוף את הפסולת על מסננת 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסננת 2 ולאסוף את הפסולת בסדר, הכולל את הביצים, מן מסננת האחרון. עם זרם עדין מבקבוק המים, להעביר את הפסולת בצד אחד של המסננת. איסוף פסולת ביצים לתוך כוס נקייה עם כמות מינימלית של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננת שוב מים שנאספודלי דרך מסננת 25 מיקרומטר לאסוף את כל הביצים שאולי נמלטים. יש לשטוף היטב עם מים בכוס לאסוף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך את פסולת צמח מ מסננת למעלה לשטוף ביסודיות את כל שלושת הנפות עם מים בלחץ. אל תיגע חלק רשת הנפות אשר יהא לעוות את גודל הנקבוביות. </li></ol> 4. נמטודות דגירה ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקו סל מתכת נקייה עם כמה שכבות של נייר Kimwipe ולהתאים על צלחת פטרי מזכוכית. אפשר במרחק 1 ס&quot;מ בין החלק התחתון של הסל ואת המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הביצים נמטודות שחולצו על הנייר בסל תיל. הוסף נוזלי מספיק כך את תחתית סל חוט נוגע פני המים אך אינו שקוע במים. תכסה את חלקו העליון עם מכסה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל יום לבדוק אם יש אידוי מים ומוסיפים מעט מים בצלחת פטרי כדי התחתון של הסל נוגעת במים. זה ימנע את הביצים מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל יום אחר, לאסוף WAter המכיל את J2s מן צלחות פטרי לתוך הכוס. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, לאורר הבידוד שנאספו בטמפרטורת החדר בעזרת אוויר או במעבדה אספקת האוויר הנוצר על ידי משאבת האקווריום. השתמש הבידוד aerated בתוך 2 ימים. J2s ניתן לגבות מן הבקיעה להקים על פני תקופה של 6-8 ימים. </li></ol> 5. רוט עגבניות זיהום בעציצים או מגשים והערכת זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שלוש aliquots של נמטודות שנאספו כדי לספור את מספר J2s בשקופית לספור או צלחת, לחשב את הממוצע ולקבוע את עוצמת הקול הרצויה חיסון. בדרך כלל 3000 J2s משמשים לכל צמח בעציצים ו -500 J2s עבור הצמחים הגדלים מגשי שתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הבידוד על צלחת ערבוב המגנטי במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לחסן את הצמחים, לוודא כי הקרקע לחה אך לא רטובה מדי. עבור חיסון הסיר, לעשות שלושה חורים בעומק של 1/2 סיר על בחול סביב כל מערכת עגבניות שורש באמצעות עיפרון (איור 2 </strong&gt;). לחסן כל צמח על ידי אספקת J2s לתוך שלושת החורים בעזרת פיפטה. לאחר מכן, לכסות את החורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תפוקה גבוהה מסכי במגשים, השתמש במחט שונה עצה חתום עם חורים בצידי דבוקות עצה פיפטה של 5 מ&quot;ל יחד pipetter (איור 3) כדי לספק את J2s לתוך האדמה. לחלופין, ניתן לשלוח נמטודות כמו בשלב 5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על הצמחים בחממה ב 24-27 מעלות צלזיוס למשך שישה עד שמונה שבועות. המשך להפרות פעמיים בחודש עם הנס-Gro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת זיהום, להסיר בזהירות את הצמחים מן הסירים לשטוף את השורשים (כפי שמתואר בשלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ההמונים ביצים כחולות על ידי הצללה השורשים של 1 מ&quot;ג / ל &#39;erioglaucine, במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השורשים במים ולהעריך על ידי ספירת ההמונים ביצה צבעונית במערכת השורש היחיד. זכוכית מגדלת שולחן מואר יכול לשמש כדי לעזור לדמיין את המוני ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצמחים הוקרן יש צורך גרם נוסףמחקרים enetic, לא לחתוך את צמרות לפני הכביסה השורשים להערכה. לאחר מכתים והספירה ההמונים ביצה, לשתול את השתילים בקרקע אורגנית, לגזום את ראשי בכבדות כדי להפחית את הדיות, ולשמור בחממה. </li></ol> 6. Cowpea זיהום רוט בתיקי והערכת זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספור את הבידוד נמטודות ומערבבים בצלחת בחישה מגנטי, כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את שקיות מהתיקיות תלויים ומניחים על משטח אופקי. מחסן לכל כיס עם 1500 J2s ב 5 מ&quot;ל. הרם את מכסה הפלסטיק של כיס ולהפיץ את נמטודות באופן שווה על פני השטח של השורשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור את שקיות במצב מאוזן על 24 שעות לאחר חיסון, מכוסה בנייר כהה כדי להוציא לאור, ולאחר מכן לחזור התיקיות תלויים בתא הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקות את הצמחים לפי הצורך, פעם ביום או פעמיים, עם פתרון חצי כוח של הוגלנד (הוגלנד &amp; ארנון, 1950, טבלה מס &#39;1 </&gt; חזק) עד בתגובה דשן הוא ציין, הורקה העלווה משופרת בדרך כלל וצמיחה לירות נמרצת יותר. בדרך כלל הצמחים להשקות עם חצי כוח הוגלנד 3 ימים ברציפות. לאחר מכן לשמור על לחות שקיות עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 30 ימים (טווח 28-35 ימים) לאחר חיסון, להחדיר בכל כיס עם כ 10-20 מ&quot;ל של erioglaucine מ&quot;ג / ל &#39;75. לשמור את שקיות מוצפים עם צבע במצב אופקי בין לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את שקיות ולהעריך את מערכות השורשים על ידי ספירת ההמונים ביצה תחת זכוכית מגדלת שולחן מואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצמחים הוקרן יש צורך במחקרים גנטיים נוספים או עבודה פורייה, שלוף בזהירות את השורשים מהשתלת נייר, באדמה אורגנית סירים ולשמור בחממה. </li></ol> 7. נציג תוצאות בשלבים המתאימים של צמחי עגבניות cowpea עבור חיסונים נמטודות עבור שתי מערכות המתוארות מוצגות דמויות1 ו 2. בנוסף, דוגמאות היטב נגועים שורשי עגבניות cowpea מוצגים איורים 4 ו -5. כמו רוב מסכי עמידות למחלות, מומלץ להשתמש לפחות 6-10 צמחים לכל גנוטיפ עבור חיסון נמטודות כדי לחשב את הממוצע של שיעור זיהום. וריאציה זיהום נמטודות בין צמחים, של גנוטיפ זהה, ניתן להפחית באמצעות גודל המפעל אחיד סכום מדויק מסירה של הבידוד. השימוש מגשי שקיות צמיחה מאפשר הקרנה של מאות עד אלפי צמחים בחלל גידול קטן. שקיות הצמיחה גם לאפשר מהיר ויעיל שאינו הרסני הערכה של השורש קושר זיהומים נמטודות ללא צורך שורשים כביסה (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> באיור 1. 2 בת שבוע במפעל cowpea גדל בכיס ומוכן שורש הקשר NEMAtode חיסון. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> איור 2. 3 שבועות בן צמח עגבניות מוכן חיסון שורש הקשר נמטודות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> איור 3. מחט שונה עצה ו פיפטה המשמש חיסון תפוקה גבוהה של נמטודות. בתחתית המחט נחתם ושלוש קבוצות של חורים שנקדחו מחט באמצעות קרן לייזר. ואז, המחט שונה היה מודבק על קצה פיפטה של ​​5 מ&quot;ל. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> איור 4. שורש עגבניות מערכת נגוע השורש קושר את נמטודות. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> איור 5. מערכת השורש cowpea עם המוני מוכתמים ביצה erioglaucine 30 יום לאחר חיסון גדל ב28 ° C.

<ol><li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li>
<li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Circ%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li>
<li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.%2C+including+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li>
<li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li>
<li>Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatkin%2C+OA+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Manual%22">Calif. Agric. Exp. Stn. Manual</a>. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).</li>
<li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li>
<li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li>
<li>Perry, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+RN+%22Root-Knot+Nematodes%22">Root-Knot Nematodes</a>. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).</li>
<li>Starr, J. L., Cook, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStarr%2C+JL+%22Resistance+to+Parasitic+Nematodes%22">Resistance to Parasitic Nematodes</a>. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

יש שני שלבים קריטיים עבור המסך נמטודות מוצלח: הכנת הבידוד זיהומיות מאוד באמצעות צמחים בשלב התפתחותי תקין. שיעור הבקיעה של שורש, פקעת ביצים נמטודות הוא משתנה מאוד ונע בין 5 ל - 50%. לכן כדי להשיג רמות אופטימליות של הפתח J2s זיהומיות ביותר, תשומת לב רבה יש לשלם מיצוי הליכים ביצה הבקיעה. הביצים צריכים להיות חשופים אקונומיקה למשך זמן מינימלי אקונומיקה יש לשטוף היטב את התערובת מן השורש. כאשר הבקיעה את הביצים, slurry המכיל את הביצים לא צריך להיות שקוע במים. בנוסף, יש להימנע לשפוך את הביצים לתוך צלחת פטרי הבסיסי שבו בקעו צעירים נאספים. דרך אחת להימנע לשפוך את הביצים תוך כדי תהליך הבקיעה הוא לא להוסיף מים ישירות Kimwipe כמו נייר עשוי להישבר. במקום להוסיף את המים ישירות אל צלחת פטרי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש J2s שבקעו זה עתה. אם hatcשיעור H נמוך הבידוד יותר יש צורך, J2s ניתן לאחסן על 15 מעלות צלזיוס למשך תקופה ארוכה. לחמם את הבידוד המאוחסן בטמפרטורת החדר כדי להחיות את נמטודות שקדמו חיסון. עם זאת, אין לאחסן את J2s לתקופות ממושכות אפילו 15 מעלות צלזיוס כ J2s מורעבים לא להדביק ביעילות. שתילים צעירים בשלב ההתפתחותי הטוב ביותר עבור חיסון שורש הקשר נמטודות. עם זאת, זה צריך להיות מאוזן עם הקמתה של מערכת שורשים נאותה לספק בכמות מספקת של טיפים שורש כמו נקודות הכניסה עבור J2s את. שמירה על מצב אופטימלי גידול צמחים חיוני גם עבור המסכים. הימנע יתר משקים צמחים במיוחד אלה גדל שקיות. יתר משקה את שקיות, כפי שצוין על ידי מים עומדים בבית התחתון של הנרתיק, יכול לקדם את צמיחת הפטרייה ולצמצם בריאות השורש. עם הערכה מבחני הן עוד יותר של זיהום נמטודות וחישוב של מספר ביצים / מערכת שורש וביצים / גרם freהשורש ש ניתן לבצע. עבור מבחני העגבניות, שורשים בודדים שקל וביצים שחולצו כפי שתואר על הבידוד הכנה (סעיף 3). בעת עיבוד של מספר גדול של דגימות צמחים, מערכות שורש בודדים ניתן macerated באמצעות בלנדר להפקת הביצים. מספר הביצים יש לספור לפחות שלושה aliquots והביצים / גרם שורש טרי של מערכת מחושב. עבור מבחני כיס, מערכת השורשים היא הסירה את הכנס נייר, שקל, וביצים חילוץ.

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות meloidogyne spp.</em

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

השורש קושר את נמטודות (הסוג Meloidogyne) הם טפילים צמחים המחייבות. הם polyphagous מאוד נחשב לאחד החשובים ביותר נמטודות צמחים טפילים מבחינה כלכלית. מיקרוסקופית השלב השני נעורים (J2), נשל פעם הביצה, הוא השלב של התולעת. J2s את בוקעים מן הביצים, לנוע בחופשיות באדמה בתוך הסרט של מים, ולאתר טיפים שורש של מיני צמחים מתאימים. לאחר חדירה שורש הצמח, הם נודדים אל הגליל כלי הדם שם הם להקים אתר האכלה וליזום האכלה באמצעות stylets שלהם. האתר האכלה תאיים מורכב מספר תאים הנקראים multinuclear מוגדלים של התאים ענק של דבר נוצרים תאים שעברו karyokinesis (חזר מיטוזה) ללא cytokinesis. תאים pericycle השכנות הפרד להגדלה בגודל והוליד המרה רגילה או הקשר שורש, סימפטום אופייני של זיהום שורש הקשר נמטודות. לאחר ההאכלה הוא יזם, J2s להיות פעילים ובטלdergo שלושה molts נוספים להיות מבוגרים. הנקבה הבוגרת מטילה ביצים 150-250 במטריצה ​​דביקות או מתחת לפני השטח של השורש. מן הביצים בוקעים J2s זיהומיות חדשים ולהתחיל מחזור חדש. שורש הקשר מחזור החיים נמטודות הושלמה ב 4-6 שבועות 26-28 ° C. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול המסורתית להדביק צמחים הגדלים בעציצים, עם השורש, ומשלב את נמטודות ואת שתי שיטות מבחני תפוקה גבוהה. השיטה הראשונה תפוקה גבוהה משמש בצמחים בעלי זרעים קטנים כגון עגבניות ואילו השני הוא לצמחים בעלי זרעים גדולים כגון שעועית cowpea משותף. זרעים גדולים לתמוך בצמיחה שתיל ממושך עם תוסף תזונתי מינימלי. Assay 1 תפוקה גבוהה מנצל שתילים שגודלו חול מגשי בעוד הצמחים assay השני מגדלים שקיות בהעדר אדמה. נרתיק גידול שתיל עשוי הפתיל 15.5 x 12.5cm נייר, מקופל בראש להקים שוקת 2 ס&quot;מ עמוק שבו זרע או שתיל ממוקמת.הפתיל נייר נכלל בתוך כיס פלסטיק שקוף. אלה שקיות הצמיחה לאפשר תצפית ישירה של זיהום תסמיני נמטודות, מהחוצפה של שורשים לייצור המוני ביצה, מתחת לפני השטח של כיס שקוף. שתי השיטות לאפשר את השימוש הצמחים הוקרן, לאחר phenotyping, למעבר או הזרעים הייצור. יתרון נוסף של השימוש שקיות הצמיחה היא הדרישה שטח קטן בגלל שקיות מאוחסנים בתיקיות פלסטיק תלויים מדפים מסודרים.

שתי שיטות שונות על צמחים מסך עם השורש קושר את נמטודות מתוארים. הגישות שתוארו כוללות תפוקה גבוהה מסכים עם נמטודות באופן הורסות להקל על השימוש בצמחים אלה בתוכניות רבייה.

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.</em

נמטודי קשרי-שורשים (סוג .Meloidogyne) הם טפילים מחייבים של צמחים. הם פוליפגיים ביותר ונחשבים לאחד מהחשובים ביותר מבחינה כלכלית...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסנן צמחים נגועים בנמטודות של קשרי שורשים. ראשית, גדלו שתילים בריאים באדמה חולית או בשקיקי גידול. לאחר מכן, הכינו תמיסת הדבקה (inoculum) של נמטודות קשרי שורשים בשלב juvenile השני עם רמה גבוהה של זיהום.לאחר מכן, חטטו והדביקו כראוי את השתיליים. לבסוף, העריכו את התפתחותן של מסות ביצי נמטודות במערכת השורשים של המארח. נדגים סריקות בעלות תפוקה גבוהה ונמוכה של צמחים עם שורשים, ללא נמטודות.והיתרונות העיקריים של מערכת הסריקה ברזולוציה גבוהה (high throughput) הם הצורך בשטח מוגבל להצמחת הצמחים והקלות בהערכת הזיהום. גישות אלו יובילו לזיהום אחיד וניתן לשחזור, זיהום של שורשי הצמחים בנמטודות, ובכך להערכה טובה יותר של מעמדו של הצמח כמארח. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בהערכת צמחים עם נמטודות בשורשים עשויים להתקשות בשל אי-שימוש בשלב ההתפתחותי המתאים להדבקת השורשים בנמטודות.כמו כן, באמצעות שימוש בנמטודות בשלב זחליים מידויים בני מספר ימים, אשר בדרך כלל בעלי יכולת הדבקה נמוכה. את הפרוצדורה יעמידו בהדגמה סטודנטים לתואר ראשון ולתואר שני. במעבדה שלי, אדגים את הפרוצדורה לסריקה בשקיקי גידול עבור בדיקות בעציצים. שתלו זרעי עגבנייה בעציץ בודד מלא באדמה עשירה בחומר אורגני, כגון sunshine mix, תוך שמירה על חממה בטמפרטורה של 22 עד 28 °C לאחר הנבטה.יש לדשן פעם בשבוע עם miracle grow, כשבועיים לאחר ההנבטה ובשלב שני העלים האמיתיים. יש להעביר שתילים בודדים לעציצים מלאים באדמה חולית סטרילית, המורכבת מ-90% חול ו-10% חומר אורגני. יש להוסיף דשן לשחרור איטי מסוג osmo coat ולהחזיק בחממה בטמפרטורה של 22 עד 28 degrees Celsius למשך שבועיים. יש להמשיך לדשן פעם בשבוע עם miracle grow.עבור סריקות בתפוקה גבוהה, יש לשתול את זרעי הצמחים ישירות בתבניות בקרקע חולית. כסו בניילון נצמד עד לנביטה ושמרו בתנאים שתוארו קודם לכן. לאחר הנביטה, הוסיפו דשן בשחרור איטי מסוג Osmo coats ודשנו פעם בשבוע ב-miracle grow; ניתן להנביט זרעים בצלחת פטרי המרופדת במספר שכבות של נייר Kim White המוצבת באינקובטור בטמפרטורה של 25 עד 28 degrees Celsius, ולאחר מכן העבירו את השתילים לשקיות בודדות.לחלופין, ניתן להניח את הזרעים בחריץ הנייר כדי להנביט אותם ישירות בתוך שקיקים אישיים. הניחו את השקיקים בתוך תיקיית תלייה מפלסטיק לכל תיקייה, וסדרו את התיקיות על מדף במצב אנכי.הנח את המתקן בתא סביבתי מבוקר בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס ובמחזור של 16 שעות אור ושמונה שעות חשיכה. השקה את השקיות פעם או פעמיים ביום במים מזוקקים (reverse osmosis water) כ-10 עד 14 ימים לאחר הזריעה. כאשר התפתח מערכת שורשים נאותה עם קצוות שורש שלישוניים, השתילים מוכנים להחדרה. לפני תחילת חילוץ הביצים, שטוף היטב את אזור העבודה ואת כל הכלים במים חמים כדי למנוע זיהום.הניחו דלי בכיור לאיסוף התמיסות הזורמות, והניחו תמיכת רשת מתכת מעליו. ערמו שלושה מסננים מלמעלה למטה לפי סדר גודל נקבים יורד, כך שהביצים ייאספו במסנן של 25 מיקרון. גזרו את חלקי העלה העליונים של הצמחים הנגועים והשליכו אותם בזהירות.הוציאו את הצמח מהעציץ ושטפו את השורשים על ידי טבילה בדלי פלסטיק מלא במים. שטפו את השורשים באופן נוסף תחת מים זורמים עד להסרת כל חלקיקי האדמה. לאחר מכן, הוציאו ביצי נמטודות של קשרי שורשים משורשי עגבנייה נגועים.ראשית, גזרו את השורשים לחתיכות קטנות באמצעות מספריים והשליכו את השורש הראשי. העבירו את השורשים הקצוצים מצמח בודד לצנצנת פלסטיק גדולה עם מכסה, והוסיפו כמות מספקת של תמיסת bleach בריכוז 10% כדי לכסות את השורשים. סגרו את המכסה ונערו את הצנצנת במשך שתי דקות.פתחו את הצנצנת, שפכו את השורשים על הנפה העליונה ושטפו באמצעות צינור המחובר לפיית התזה. שטפו היטב עד להסרת כל ריח המלבן. השתמשו בפטיש גומי כדי להקיש על דפנות הנפות כדי למנוע סתימה שלהן.עצרו, הסירו את הנפה העליונה ושטפו את השאריות. וכך גם את הנפה השנייה. הסירו את הנפה השנייה ואספו את השאריות העדינות, הכוללות את הביצים מהנפה האחרונה, באמצעות זרימה עדינה מבקבוק מים.הזיזו את השאריות לצד אחד של הנפה. אספו את השאריות ואת הביצים לכוס כימיקלית נקייה עם כמות מינימלית של מים. העבירו את המים שנאספו בדלי דרך נפת 25 micron כדי לאסוף ביצים שעשויות היו להישמט.שטפו היטב במים ואספו לאותו כלי כימי. רפדו סלסילת מתכת נקייה במספר שכבות של נייר סופג Kim. נגבו והניחו על צלחת פטרי מזכוכית, תוך השארת מרחק של סנטימטר אחד בין התחתית לבין הצלחת.שפכו את ביצי הנמטודות שהופקו על הנייר שבתוך סל הסריג. הוסיפו מספיק נוזל כך שתחתית סל הסריג תיגע במשטח המים אך לא תהיה טבולה במים.כסו את החלק העליון במכסה פלסטיק מדי יום. בדקו אם חלה אידוי של מים והוסיפו מעט מים לצלחת פטרי כך שתחתית הסל תגע במים. כדי למנוע מהביצים להתייבש, אחת לשני ימים לאורך שישה עד שמונה ימים, אספו את המים המכילים את הנמליליים בשלב השני או J twos מצלחת הפטרי אל תוך כלי כימי (beaker).במידה ולא נעשה בהם שימוש, יש לאוורר מיד את האינוקולום שנאסף בטמפרטורת החדר באמצעות אספקת אוויר מעבדתית או אוויר המופק על ידי משאבת אקווריום. התחילו את השלב הבא על ידי ערבוב של האינוקולום על פלטת ערבוב מגנטית במהירות נמוכה. השתמשו בשלוש מנות (aliquots) של הנמטודות שנאספו.כדי לספור את מספר ה-J twos בחשבונאות. תחת זכוכית כיסוי או צלחת, חשב את הממוצע וקבע את הנפח הרצוי להחדרה. אלו הם J twos כפי שהם נראים תחת מיקרוסקופ.בדרך כלל, משתמשים ב-3000 J twos לכל צמח בעציצים וב-500 J twos לצמחים הגדלים במגש שתילים. לפני חידולם הצמחים, ודאו שהקרקע לחה אך לא רטובה מדי. עבור חידולם בעציצים, חפרו שלושה חורים בעומק של כחצי מעומק העציץ בחול סביב כל מערכת שורשים של עגבנייה.בעזרת עיפרון, חסנו כל צמח על ידי העברת ה-J twos לשלוש החורים באמצעות פיפטה. לאחר מכן, כסו את החורים עבור בדיקות הסריקה בעלת התפוקה הגבוהה במגשים. השתמשו במחט בעלת קצה אטום ומודגש עם חורים בצדדים, המודבקת לפיפטה של 5 mL.הטה את הפטה של הפ pipette כדי להחדיר את ה-J twos אל תוך הקרקע. השהה את הצמחים בבית חממה בטמפרטורה של 24 to 27 °C למשך שישה עד שמונה שבועות. המשך לדשן פעמיים בחודש באמצעות miracle grow.להערכת הזיהום. חיתכו את החלקים העליונים, הוציאו בזהירות את הצמחים מהעציצים ושטפו את השורשים. לאחר מכן, צבעו את מסות הביצים בכחול על ידי טבילת השורשים בריכוז של one milligram per liter.ביצוע הברשה (glossing) של Aerio למשך 15 דקות. שטפו את השורשים במים והעריכו את התוצאות על ידי ספירה של מסות ביצים צבועות על גבי מערכות שורשים בודדות. ניתן להשתמש במגניף מוואר כדי לסייע בויזואליזציה של מסות הביצים, בספירת הנמטודות, בבדיקת האינוקולום, ובערבוב על פלטת ערבוב מגנטית כפי שתיאור בעבר.הוצאו את השקיות מהתיקיות התלויות והניחו אותן על משטח אופקי. הקרינו כל שקית עם 1,500 J2 בחמישה מיליליטרים. הרימו את הכיסוי הפלסטי של השקית ופזרו את הנמטודות באופן שווה על פני השטח של השורשים.שמרו את השקיות במצב אופקי למשך 24 שעות לאחר ההסמכה, כשהן מכוסות בנייר כהה כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר מכן, החזירו את השקיות לתיקיות התלייה בתוך המים בתא הגידול. יש להשקות את הצמחים פעם או פעמיים ביום למשך כשלושה ימים בתמיסת Hoagland בריכוז חצי, עד להשגת תגובה לדשן.בדרך כלל נצפה בירידה בחיוורון העלים (הירגזה של העלים) ובצמיחה נמרצת יותר של הנשירים. לאחר שלושה ימים, שמרו על השקיות לחות באמצעות מים. כ-30 ימים לאחר ההחדרה, השקו כל שקית בכ-10 עד 20 milliliters של 75 milligrams liter.צביעה באוויר (Aero glossing). השארו את השקיות מוצפות בצבע במצב אופקי למשך הלילה. למחרת, רוקנו את השקיות והעריכו את מערכות השורשים על ידי ספירת מסות הביצים תחת שולחן מואר.בתמונה מוגדלים שורשים של צמח עגבנייה מזוהם היטב, עם מסות ביצים נרחבות הצבועות בכחול. השימוש במגשים מאפשר סריקה של מאות צמחים במרחב גידול קטן. שקיות גידול מאפשרות גם הערכה מהירה, יעילה ולא הורסת של השורשים ושל זיהומי נמטודות, ללא צורך בשטיפת השורשים.שיטה זו מאפשרת גם סריקה בעלת תפוקה גבוהה של אלפי צמחים במרחב גידול קטן. כאן מערכת השורשים של צמח cow P שגודל בשק מראה מסות ביצים שצבעו בכחול לאחר ההדבקה. תזמון הזיהום הוא קריטי מאוד בבדיקות צמחים עם נמטודות.לפיכך, עיכוב של ההדבקה אפילו בכמה ימים עלול להוביל לרמות הדבקה נמוכות מאוד. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם כעת הבנה טובה של האופן שבו מדביקים ומעריכים צמחים עם נמטודות שורש (root knot nematodes). אל תשכחו שיש לטפל בשורשים המודבקים בנמטודות באופן נאות.סטריליזציה באוטוקלאב של השורשים לפני השלכתם תגביל את התפשטות הנמטודה. כמו כן, יש להיזהר בשימוש בגליסין הניתן בריסוס בשל המינונים הגבוהים; הוא נחשב למסרטן.לפיכך, עליכם להשתמש בכפפות בעת טיפול בשורשים שהודבקו בחומר כימי זה וכן בעת הכנתו.

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקת סקר לזיהוי היעילות של נמטידים של מולקולות קטנות נגד נמטודות. Nematicides נחשבים יעילים אם הם גורמים לירידה במספר הנמטודות הניידות במדגם לאחר החשיפה.

בדיקת סינון של מולקולות קטנות Nematicides: שיטת תפוקה בינונית לסינון נמטיקוטים פוטנציאליים נגד דיפסאצ'י דיפסאצ'י

נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

כאן, פרוטוקול מוצג עבור הקרנה מהירה הלא הרסנית של גנוטיפים כותנה עבור התנגדות נמטודות. הפרוטוקול כולל בדיקה חזותית את השורשים של שתילי כותנה נגועים nematode כדי לקבוע תגובה זיהום. לירות וגטטיבי מכל צמח מופץ אז לשחזר צמחים לייצור זרעים.

הקרנת כותנה גנוטיפים לעמידות בפני ההתנגדות של רנפורם

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחילוץ יעיל של נמטודות חיות ממצעים טבעיים בשטח.

בידוד מהיר של נמטודות פראיות על ידי משפך ברמן

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אמינה ופשוטה לגידול, איסוף וסינון של Ditylenchus dipsaci.

גידול והקרנה של הנמטודה הטפילית הצמחית דיטלנכוס דיפסאצ'י

כאן, אנו מציגים שיטת השרייה מפורטת של הפרעת RNA ב Bursaphelenchus xylophilus כדי להקל על המחקר של תפקודי גנים.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

הפרוטוקול מתאר זיהום של שורשי Solanum tuberosum בנמטודות טפיליות של צמחים בתנאי חממה in vivo ושורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה במבחנה לניתוח היסטוכימי של מבנה השורשים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית.

זיהום in vivo ו-In vitro של שורשי תפוחי אדמה בנמטודות טפיליות צמחיות להערכת שינויים מבניים מושרים

אנו מציגים שתי שיטות לחקלאים להתרבות המונית של נמטודות אנטומופתוגניות כקוטלי חרקים ביולוגיים. השיטה הראשונה משתמשת בג'ל פוליאקרילאמיד כמצע גידול הנמטודות, בעוד שהשנייה משתמשת בצמר גפן מצופה פולימר כמצע הגידול. שתי השיטות מתבססות על התרבות נמטודות בתוך גופות חרקים.

רבייה מבוססת גידול בחיים של נמטודות אנטומופתוגניות

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

למד שיטות סינון בקצב גבוה ונמוך לזיהוי צמחים נגועים בנמטודות Meloidogyne spp. הפרוטוקולים מאפשרים הערכת עמידות יעילה ללא הרס השורשים ותומכים בתוכניות הרבעה.

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.

גלה סרטונים נוספים