Name: דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: למדו שימוש במודל אקס-ויו של קרנית ארנבת ותורם אנושי לחקר זיהום HSV-1 אפיתליאלי חריף. שיטה זו מספקת תובנות לפתוגנזה של וירוס הרפס ומחלות קרנית אחרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התמיכה של בנק עין אריות דלאוור העמק הייתה רבה ערך עבור עבודה זו. נוגדן חד שבטי עכבר העיקרי נגד ICP8 היה מתנה מסוג ד&quot;ר דוד Knipe (הספר לרפואת הארוורד). אנו מודים גם לד&quot;ר סטיבן ג&#39;נינגס (דרקסל מכללה לרפואה של אוניברסיטה) ופיטר ד&quot;ר Laibson (צוואות Eye Institute) לדיונים מועילים ואת המומחיות.

כל ריאגנטים והציוד נרכשו סטרילי או עוקרו לפני ההליך. מאמר זה מתאר את השלבים של הקמת מודל vivo לשעבר מתחיל בעין מראש enucleated. בניסויים שלנו, אנו משתמשים בעיניים שלמות טריות מ( 8-12 wks) ארנבות בקנים צעירות (PEL-freez ביולוגי, רוג&#39;רס, AR). בנוסף, אנו משתמשים בקרניות של אדם שנלקחו מבנק העין המקומי. אם ביצוע enucleation עצמך, לטפל כדי למנוע ניזק לקרנית או גובל במהלך ההליך. פרוטוקולי enucleation ארנב ניתן למצוא במקום אחר 2. חלק 1: כריתתן Corneoscleral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרטב את הרצועה צרה של גזה עם PBS ולעטוף איתו את גלגל העין כדי להקל מחזיק אותו במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל חד לעשות חתך משיק בלובן העין, במרחק של כ 0.5 סנטימטרים מימבוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים חדים להרחיב את החתך ולחלוטין בלו גכפתור orneoscleral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכפתור corneoscleral מבודד, להקניט את הקשתית תוך החזקת חישוק scleral עם מלקחיים. למנוע ניזק האנדותל או הפעלת לחץ מוגזם על הקרנית. </li></ol> חלק 2: מבוא של קרנית לתרבות Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרניות Explanted מתורבתות במדיום החיוני המינימאלי (MEM) בתוספת חומצות האמין שאינם חיוניות (1X), L-גלוטמין (2 מ&quot;מ), פניצילין (200 U / ml) וסטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ&quot;ל). סוכן נגד פטריות, כגון amphotericin, ניתן גם להוסיף במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון agarose 1% במדיום התרבות ולשמור אותו מוכן בשעת 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב את הקרנית ב PBS המכיל פניצילין סטרילי (200 U / ml) וסטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צד אפיתל הקרני לתוך היטב של צלחת מקום סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הבינוני agarose המכיל לקעירות האנדותל של הקרנית מספיק כדילמלא אותו לחלוטין. אפשר ~ 1 דקות לagarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרנית עם התמיכה בצד אפיתל ג&#39;ל פיגום לתוך צלחת תרבית רקמה 35 מ&quot;מ ולהוסיף התרבות הבינונית שיכסו את פני שטח האפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנית עלולה להיות מתורבתת בדרך זו ליותר משבוע, עם שינויים בינוניים כל 48 שעות. </li></ol> חלק 3: זיהום בHSV-1 וטיפול בתרופות ניסיוניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של מדיום המכיל את הכמות הרצויה של וירוס לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ. אנחנו בדרך כלל להדביק עם 1x10 4 pfu של הזן KOS HSV-1 לקרנית. כייל המניות שלנו נקבעים על ידי ביצוע מבחנים פלאק על CV-1 monolayers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרנית ביחד עם צד אפיתל agarose הפיגום לתוך מדיום וירוס המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרנית לרקמות תרבות חממה להדביק לשעה 1 עם נדנדה לסירוגין כל 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השעה 1, לשאוב וירוסי contaiנינג הבינוני ולשטוף 2-3 פעמים עם PBS להסיר כל חלקיקים נגיפיים שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרנית חזרה למקומה הקודם ולהוסיף מדיום התרבות טרי כדי לכסות את פני השטח האפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים ניסיוניים עשויים להיות נכתבו לפני או אחרי הזיהום, בהתאם לאופי של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום תרבות משתנה כל שעה 48. </li></ol> חלק 4: אוסף דוגמאות <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לניתוח assay פלאק. מערבב היטב הבינוני ולהשתמש בו באופן מיידי לבדיקת שלט או חנות ב-80 ° C לשימוש מאוחר יותר אם איסוף דגימות בנקודתי זמן שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דנ&quot;א, רנ&quot;א, חלבונים, או תאי האפיתל מקרנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את agarose הפיגום ולשטוף היטב עם קרנית PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הטבעת של רקמת scleral מהקרנית על מנת להבטיח שחומר אפיתל קרני רק תיאסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uלשיר אזמל, לגרד מתאי האפיתל של הקרנית למאגר המתאים, תלוי בסוג של חומר להיות מבודדים. לבידוד של DNA ו-RNA, אנו משתמשים בערכת הדם ורקמות DNeasy וקיט RNeasy מיני, בהתאמה (Qiagen, Hilden, גרמניה). לאוסף של lysates חלבון, אנו משתמשים במאגר Laemmli. לניתוח cytometry זרימה של תאי אפיתל קרניים, אנחנו מראש דגירת הקרניות בכמות קטנה של טריפסין כדי לשחרר את התאים, ואחר כך לשלוף אותם לטריפסין עם אזמל. מאחר שמגרד את האפיתל של הקרנית אינו מניב כמויות שווות של רקמה, חשוב לכלול פקדים מתאימים בעת ניתוח הדגימות. אנו משתמשים rRNA 18S כתעתיק התייחסות בqRT-PCRs, GAPDH כגן התייחסות בqPCRs, וnucleolin כבקרת טעינה לכתמים מערביים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות רקמה לאימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את agarose הפיגום ולשטוף את התירסEA גם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם למטרת הניסוי שלך, השתמש בקרנית לעשות בלוק פרפין רקמה או גוש רקמה קפוא, כפי שמוצג בסרטון. אנו עוקבים אחר נהלים סטנדרטיים בעת הכנת חלקי רקמת קרנית. </li></ol></li></ol> נציג תוצאות רוב השיטות הזמינות ללימוד תאים בתרבית רקמה ניתן להתאים בקלות לשימוש בקרניות נגועות בvivo לשעבר HSV-1. מוצג כאן הם תוצאות יציגות לכמה מהטכניקות הישימות ללימוד זיהום HSV-1 הנפוצות ביותר - qPCR (1D איור), qRT-PCR (האיור 1B), מערבי כתם (האיור 1F), assay פלאק (התרשים 1C), ו הרקמה immunofluorescence (האיור 1E). <img src="/files/ftp_upload/3631/3631fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. הניתוח של קרניות נגועות HSV-1 לשעבר vאיבו. (א) ייצוג סכמטי של מודל vivo לשעבר של הזיהום חריף בקרנית אפיתל HSV-1. (BF) ניתוח של קרניות הנגועות בשיטה שתוארה במאמר זה וידאו. קרניות ארנב Explanted היו נגועות ב1x10 4 / קרנית pfu של הזן KOS HSV-1 ותרבית בנוכחות (Paa) או העדרה (מוק) של חומצת phosphonoacetic (400 מיקרוגרם / מ&quot;ל), מעכב ידוע של שכפול HSV. (ב) RNA סה&quot;כ נאסף בנקודתי הזמן המצוין, ושעתוק נגיפי הוערך על ידי qRT-PCR עם פריימרים לפולימרז HSV-1. Primers נגד 18S rRNA שמש כנקודת התייחסות. n = 3. ברי שגיאה מצביעים ± SEM. (ג&#39;) הבינוניים תרבות נאסף בגיל 48 HPI, וייצור חלקיקים מדבק הוערך על ידי assay פלאק על משטחי CV-1. (ד &#39;) ה-DNA סה&quot;כ נאספה בגיל 48 HPI, ושכפול הגנום נגיפי הוערך ב assay qPCR עם פריימרים לגנום HSV-1. יחסי הציבורimers נגד GAPDH שמשו כנקודת התייחסות. n = 3. ברי שגיאה מצביעים ± SEM. (E) מוק הקרניות שטופלו היו פלאש קפוא ב 48 HPI, נותח, ונותחו על ידי immunofluorescence העקיף לנוכחות של חלבון נגיפי מוקדם (ICP8) בתוך האפיתל הנגוע. גרעיני counterstained עם Hochst 33258. (F) lysates החלבון נאספו בגיל 48 HPI, והביטוי של חלבון נגיפי (ICP0) הוערך על ידי כתם מערבי. BCA assay שמש כדי להבטיח טעינה שווה של דגימות. HPI = שעתי זיהום הודעה.

<ol><li>Kaye, S., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex keratitis.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).</li>
<li>Holmberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+exotic+pets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enucleation of exotic pets.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).</li>
<li>Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+herpes+simplex+virus+keratitis%3A+the+pathogenesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul.+Immunol.+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited.</a> Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).</li>
<li>Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+organ+culture+model+for+assessing+the+effects+of+growth+factors+on+corneal+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization.</a> Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).</li>
<li>Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+organ+culture+model+for+assessing+epithelial+responses+to+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants.</a> Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).</li>
<li>Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Corneal gene therapy.</a> J. Control Release. 124, 107-133 (2007).</li>
<li>Halford, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICP0+antagonizes+Stat+1-dependent+repression+of+herpes+simplex+virus%3A+implications+for+the+regulation+of+viral+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency.</a> Virol. J. 3, 44(2006).</li>
<li>Bhattacharjee, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+ocular+HSK+with+a+human+apolipoprotein+E+mimetic+peptide+in+a+mouse+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model.</a> Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).</li>
<li>Novitskaya, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difficulties+imaging+herpes+simplex+keratitis+with+fluorescein+isothiocynate-labeled+anti-HSV-1+antibodies+in+an+ex+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model.</a> Cornea. 28, 421-425 (2009).</li>
<li>Sharma, A., Shimeld, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunofluorescence+to+diagnose+herpes+simplex+virus+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה יתאר וידאו שיטה ללימוד הזיהום חריף בקרנית אפיתל HSV-1 במודל vivo לשעבר. המודל הזה הוא קרש קפיצה שימושית בין במבחנה במודלי vivo, משום שהיא מאפשרת לאימות פיזיולוגית מדויקת-תוצאות תרביות תאים, ובכך מגבילה את כמות הניסויים בבעלי חיים שהם צריכים לבצע. בנוסף, מודל vivo לשעבר מספק הזדמנות ייחודית ורבת ערך כדי ללמוד זיהום הרפס אפיתל בקרניות אנושיות שלמות. מפורטות להלן כמה שיקולים שצריך לקחת בחשבון בעת ​​שימוש במודל זה: <ul style=";text-alig...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים / ספקים </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td></tr><tr><td> בינוני חיוני מינימאלי (MEM) </td><td> Mediatech </td><td> 10-010-CV </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות (פתרון 100x) </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CI </td></tr><tr><td> מלח נתרן G פניצילין </td><td> סיגמא </td><td> P3032 </td></tr><tr><td> מלח סולפט סטרפטומיצין </td><td> סיגמא </td><td> S9137 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט (PBS) </td><td> הוכן במעבדה </td><td> N / </td></tr><tr><td> טריפסין EDTA (1x) &lt;/ Td&gt; <td> Mediatech </td><td> 25-053-CI </td></tr><tr><td> דם DNeasy &amp; קיט רקמות </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> ערכת המיני RNeasy </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Laemmli המאגר </td><td> הוכן במעבדה </td><td> N / </td></tr><tr><td> חיתוך טמפרטורה אופטימלי מתחם (אוקטובר) </td><td> רקמה-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> עיני ארנב שלמות (צעיר) </td><td> PEL-freez </td><td> 41211-2 </td></tr><tr><td> קרניות עיני אדם ושלם </td><td> בנק עיניים מקומי </td><td> N / </td></tr><tr><td> צלחת פורצלן ובכן ספוט 12 </td><td> אספקת מעבדת אבוגדרו </td><td> 1877 </td></tr><tr><td> תבשיל תרבית רקמה 35 מ&quot;מ </td><td> בז </td><td> 353001 </td></tr><tr><td> 6 ובכןפלייט תא התרבות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Cryomold ביניים </td><td> רקמה-Tek </td><td> 4566 </td></tr></tbody></table>

דגם גופיים organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

keratitis הרפס הוא האחת הפתולוגיות החמורות ביותר הקשורות לוירוסים מסוג 1 (HSV-1) הרפס סימפלקס. keratitis הרפס הוא כיום הגורם המוביל לשניהם נגזרו קרנית וזיהום הקשור בעיוורון בעולם המפותח. מצגת טיפוסית של הרפס קרטיטיס כוללת דלקת של האפיתל של הקרנית ולפעמים עמוקים יותר סטרומה ואנדותל בקרנית, מה שמוביל למחל קרנית קבועות כגון צלקות, דלילים, ואטימות 1. זיהום קרני HSV-1 הוא למד באופן מסורתי בשני סוגים של מודלי ניסויים. במבחנת מודל, שבי monolayers תרבית של תאי אפיתל קרניים נגוע בצלחת פטרי, מציע פשטות רמה גבוהה של replicability, ניסויים מהירים, ועלויות נמוכות יחסית. מצד השני, in vivo מודל, שבי חיות כמו ארנבים או עכברים מחוסנות באופן ישיר בקרנית, מציע פיסיולוגי מתוחכם ביותרמערכת, אבל יש עלויות גבוהות יותר, ניסויים ארוכים יותר, טיפול בבעלי חיים הכרחיים, ובמידה רבה יותר של השתנות. במאמר זה וידאו, אנו מספקים הדגמה מפורטת של דגם חדש vivo לשעבר של זיהום HSV-1 אפיתל קרני, המשלב את היתרונות של שניהם במבחנה במודלי vivo. מודל vivo לשעבר מנצל קרניות שלמות שמרו organotypically בתרבות ונגועה בHSV-1. השימוש במודל vivo לשעבר מאפשר למסקנות מאוד מבוססות מבחינה פיזיולוגית, ובכל זאת היא לא זולה ודורשת מחויבות זמן דומים לזה של מודל במבחנה.

במאמר זה יתאר וידאו השימוש חדש<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; מודל של הרפס סימפלקס סוג וירוס האקוטי אני זיהום האפיתל של קרנית.

דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

קרטיטיס הרפטית היא אחת הפתולוגיות החמורות ביותר הקשורות לנגיף ההרפס סימפלקס מסוג 1 (HSV-1). קרטיטיס הרפטית היא כיום הגורם המוביל...

אני ג'יין קליפורד, פרופסור וראש המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית במכללה לרפואה של אוניברסיטת דרקסל, ושמי אוליב, ואני סטודנט למסלול MD PhD במעבדתה של ד"ר קליפורד. הסרטון שאני ואוליב הכנו עבורכם מדגים תרבית ex vivo של קרניות שהושגו מארנבים וממתרמים אנושיים.השתמשנו בקרניות אלו למחקר של זיהום בנגיף ההרפס, והן בהחלט מתאימות למחקר של מחלות אחרות של הקרנית; זהו מודל ex vivo רלוונטי במיוחד בהשוואה לתרביות מונו של תאים. קרטיטיס הרפסית היא אחת הפתולוגיות החמורות ביותר הקשורות לנגיף ההרפס סימפלקס מסוג 1. נכון להיום, היא הגורם המוביל לעיוורון ממקור קרניתי ומזיהומים בעולם המפותח.דלקת קרנית הירפס נחקרת באופן מסורתי בשני סוגים של מודלים ניסיוניים. המודל ה-in vitro, שבו מדביקים שכבות מונו של תאי אפיתל של קרנית בתוך צלחת פטרי, מציע פשטות, רמת שחזור גבוהה, ניסויים מהירים ועלויות נמוכות יחסית. מאידך, המודל ה-in vivo של דלקת קרנית הירפס, שבו מחדירים את הנגיף ישירות לקרנית של בעלי חיים כגון ארנבונים או עכברים, מציע מערכת פיזיולוגית מתוחכמת ביותר, אך כרוכה בעלויות גבוהות יותר, ניסויים ממושכים יותר, צורך בטיפול בבעלי חיים ומידה גבוהה יותר של שונות.במאמר וידאו זה, אנו מספקים הדגמה מפורטת של מודל ex vivo חדש להדבקה חריפה של HSV 1 באפיתית קרנית, המשלב את היתרונות של מודלים in vitro ו-in vivo. מודל ה-ex vivo משתמש בקרניות שלמים המוחזקים בדרך כלל בתרבית ומוחדקים ב-HSV. השימוש במודל ה-ex vivo מאפשר הסקות המבוססות באופן פיזיולוגי גבוה, אך הוא זול למדי ודורש השקעת זמן ומאמץ הדומה לזו של מודל ה-in vitro.הכינו את הפריטים הבאים לפני תחילת הפרוצדורה: פטריה עם PBS (מלח פוספט), מצע גידול לקרנית ומצע גידול לפיגום, פלטת נקודות, רצועת גזה, גלגל עין טרי, סקלפל, פינצטה ומספריים חדים. הרטיבו רצועת גזה צרה ב-PBS ועטפו אותה סביב גלגל העין כדי להחזיקו בבטחה.במהלך הפרוצדורה, השתמש בסכילה חדה כדי לבצע חתך מותנגי בלחמית (sclera) במרחק של כחצי סנטימטר מהשוליים. השתמש במספריים כדי להוציא לחלוטין את כפתור הקרנייה-לחמית (corneal scleral button). ככל שהחתך יתרחב, הלחץ בתוך גלגל העין יירד, מה שיהפוך את האחזקה והמניפולציה של הרקמה לקשות יותר.מסיבה זו, אנו ממליצים להשתמש במספריים אמינים וחדים בשלב זה. לאחר בידוד כפתור הקרנייה והסקלרה (corneal scleral button), הפרידו בעדינות את הקשתית תוך כדי החזקת שולי הסקלרה באמצעות פינצטה. הימנעו מפגיעה באנדותל או מהפעלת לחץ מוגבר על הקרנייה.הכינו תמיסת agarose בריכוז 1% והשאירו אותה מוכנה. בטמפרטורה של 55 °C, שטפו ביסודיות את הקרנית ב-PBS סטרילי המכיל פניצילין וסטראפטומייצין. הניחו את הקרנית, כאשר הצד האפיתלי פונה כלפי מטה, לתוך באר של Spotlight סטרילי.הוסיפו agarose המכיל Medium לשקע האנדותליאלי של הקרנית. כמות מספיקה כדי למלא אותו לחלוטין. המתינו כדקה עד שה-agarose יתמצק.הניחו את הקרנית עם פיגום ה-agros התומך, כאשר הצד האפיתלי פונה כלפי מעלה, בתוך צלחית לתרבית רקמה והוסיפו מצע MEM מועשר לכיסוי הפני השטח האפיתליים. ניתן לתרבת את הקרנית באופן זה במשך למעלה משבוע, עם החלפת מצע מדי 48 שעות. הוסיפו לצלחית לתרבית הרקמה מיליליטר אחד של מצע המכיל את כמות הנגיף הרצויה.הניחו את קרנית העין עם פיגום ה-agro בצד האפיתליאלי הפונה כלפי מטה לתוך המצע המכיל את הווירוס. הכניסו את הקרנית למדגרת תרביות רקמה להדבקה למשך שעה אחת, תוך כדי ניעור לסירוגין בכל 10 עד 15 דקות. לאחר שעה, שאבו את המצע המכיל את הווירוס ושטפו שתיים עד שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר חלקיקים ויראליים ששאיריים.בעת השטיפה ב-PBS, יש להיזהר לא להסיר את הקרנייה מהפיגום (scaffold) האגרו. הוסף מצע טרי כדי לכסות את פני השטח האפיתליאליים. ניתן להתחיל בטיפולים ניסיוניים לפני או אחרי ההדבקה, בהתאם לאופי הניסוי.יש להחליף את מצע התרבית מדי 48 שעות. ערבבו את המצע היטב והשתמשו בו מיד לבדיקת פלאקים (plaque assay). לחלופין, ניתן לאחסן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. במקרה של איסוף דגימות בנקודות זמן שונות, שטפו היטב את הקרנית עם PBS.הסיר את פיגום האגרו (agro scaffold), והסר את טבעת רקמת הלובן (sclera) מהקרנית כדי להבטיח כי נאסף רק חומר מהאפיתל של הקרנית. בעזרת סקלפל, גרד את תאי האפיתל של הקרנית אל תוך הבאפר המתאים, בהתאם לסוג החומר שיש לבודד. הסרת שולי הלובן מאפשרת לסטרומה של הקרנית להתנפח במהירות על ידי ספיגת מים.מכיוון שהנפיחות עלולה להקשות על הגרידה, אנו ממליצים לבצע את השלב במהירות ולשטוף את פטריית פטרי כדי להבטיח שכל הדגימה נאספה. הוצא את פיגום האגרו (agro scaffold) ושטוף היטב את הקרנית ב-PBS.השתמש בקרנית כדי להכין בלוק רקמה בפראפין או בלוק רקמה קפוא, כפי שמוצג כאן, בהתאם למטרת הניסוי שלך. הטמע את הקרנית בתרכובת OCT (Optimal Cutting Temperature) בתוך תבנית דגימה. הקפא את הקרנית בהקפאה מהירה במסננת של אתנול וקרח יבש. מה שהצגנו כאן בסרטון זה הוא הכנת קרניות, דיסקציה של הקרנית, הנחתה בתרבית ex vivo והדבקת קרניות בנגיף ההרפס.בסרטון זה הוצגה הטכניקה למודל שהיה מועיל מאוד עבורנו במחקרי זיהום בנגיף ההרפס, ex vivo, ואנו מקווים שהוא יהיה מועיל לאחרים בניסויים עם תאי קרנייה.

ex-vivo-organotypic-corneal-model-acute-epithelial-herpes-simplex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

רוב המחקרים של מחלת קרנית herpetic משתמשים במודל זיהום עיקרי. עם זאת, זיהום ראשוני עם HSV-1 אינו בדרך כלל להוביל למחלות אנושיות. כאן אנו מתארים מודל חוזר של מחלה בקרנית herpetic, אשר באופן הדוק יותר מחקה מחלות אנושיות.

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

סרטון זה מתאר פרוטוקול להגדרת מודל ex vivo לקרטיטיס חיידקית באמצעות כפתור corneoscleral שנותח מהעין החזירית. חיידקים מחוסנים חוצים את חתכי אפיתל הקרנית כדי לפלוש לסטרומה הבסיסית וליצור זיהום בתוך רקמות הקרנית המחקה את זיהום in vivo.

מודל הקרנית Porcine Ex vivo של קרטיטיס חיידקית: טכניקה ליצירת זיהום חיידקי בתאי אפיתל בקרנית

סרטון זה מדגים את השיטה לביצוע בדיקת פלאק באמצעות וירוס המתקבל מקרנית חזיר נגועה. קרנית החזיר משמשת לבדיקת היעילות האנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות.

קביעת יעילות אנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות באמצעות בדיקת פלאק

העור הוא רקמת מטרה אחת של הפתוגן האנושי הרפס סימפלקס וירוס סוג 1 (HSV-1). כדי לחקור את מסלול הפלישה של HSV-1 לרקמה, הקמנו מודל זיהום ex vivo של יריעות אפידרמיס של עכברים המייצגות את שכבת העור החיצונית ביותר.

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי להגדיר מודל אקס ויוו חזירי של קרטיטיס חיידקי. פסאודומונס ארוגינוזה משמש כאורגניזם אב-טיפוס. מודל חדשני זה מחקה זיהום vivo כמו התפשטות חיידקים תלויה ביכולתו של החיידק לפגוע ברקמת הקרנית.

הקמת דגם חזיר אקס ויוו קרנית לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס בקטריאלי

אנו מתארים את השימוש בקרנית חזירית כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של תרופות ניסיוניות.

רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

פיתחנו מודל חולדה של דלקת קרנית חמורה באמצעות גרידת אפיתל בקרנית בשילוב עם תפרים בקרנית. המחקר העריך דפוסי דלקת בקרנית, התפשטות אפיתל ושינויים בתאי גזע לימבליים בתנאים דלקתיים.

ביסוס מודל דלקת קרנית חמורה בחולדות המבוסס על גרידת אפיתל בקרנית בשילוב תפרי קרנית

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן...

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

למדו שימוש במודל אקס-ויו של קרנית ארנבת ותורם אנושי לחקר זיהום HSV-1 אפיתליאלי חריף. שיטה זו מספקת תובנות לפתוגנזה של וירוס הרפס ומחלות קרנית אחרות.

דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

גלה סרטונים נוספים