ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס In vivo Electroporation

ג'יין הועברה לאוזן הפנימית של העכבר המתפתח על ידי in vivo, אלקטרופורציה לינג וואנג, האן ג'אנג וג'ון בורגנדי, מרכז מחקר השמיעה של אורגון, אוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע. שמי ג'ון בורגנדי. המעבדה שלי נמצאת במרכז לחקר השמיעה של אורגון באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע.

שמי אנג. אני פוסטר במעבדה של ג'ונס. אני גם במעבדת ג'ונס כעוזרת מחקר.

המצגת שלנו מחולקת לארבעה חלקים. הראשון הוא לפרוטומיה גחונית. אנו מדגימים עט נתרן, הרדמה מבוססת ברביטל, כיצד לבדוק את נאותות ההרדמה, הגנה על הקרנית, הכנת אתר הניתוח, גיליון נתונים של ניתוח הישרדות עכברים בחיטוי, חתך קו האמצע הגחוני של הסוויטה הכירורגית דרך העור ודופן הבטן והחצנה של קרני הרחם.

החלק השני הוא מיקרו-הזרקה דרך הרחם. אנו מדגימים הארה טרנס של העובר, העובר, התמצאות מחדש, מיקרו-הזרקה, פיפטה, ייצור ומיקרו-הזרקה לתוך האוטיס ביום העוברי 11.5 וביום העוברי 12.5. החלק השלישי הוא אלקטרופורציה in vivo.

אנו מדגימים מיקום אלקטרודה בסגנון הנעה, ואלקטרופורציה של סיוע העכבר ביום העוברי 11.5 O של העכבר. החלק הרביעי הוא תוצאות מייצגות. אנו מראים את הביטוי של GFP בשבלול עוברי מאוחר ומוקדם לאחר הלידה.

זה נבע מאלקטרופורציה in vivo של האוטיס עם ביטוי פלסמיד ביום העוברי 11.5 חלק ראשון לפרוטומיה גחונית. הסכר מוחזק היטב על ידי אחיזת העור מאחורי הצוואר, הזנב והגפה האחורית השמאלית. הזרקה תוך-צפקית של חומר הרדמה מבוסס נתרן פנטוברביטל ניתנת לאחר דגימת הבטן באתנול 70%.

העכבר מונח בתוך כלוב הבית שלו למשך ארבע עד חמש דקות כדי לאפשר לחומר ההרדמה לפעול. צביטות בכף הרגל ובזנב משמשות להערכת הלימות ההרדמה. סכר זה נסגר בתגובה לצביטה בזנב וצריך שתי דקות נוספות לפני שהוא לא מגיב לגירויים מזיקים.

משחת עיניים סטרילית מוחלת על העיניים כדי להגן על הקרניות מפני התייבשות. אנו מכינים את אתר הניתוח במכסה אדים כימי כדי למזער את התפשטות הפרווה והקשקשים. הפרווה מגולחת בלהב דק כדי לחשוף את העור המכסה את דופן הבטן.

הסרת פרווה מלאה מקלה על ריפוי החתך לאחר הניתוח. חיטוי עור הבטן מושג על ידי מעברים לסירוגין של 70% אתנול בטדין ו-70% אתנול. החלק תמיד מרוסטרל לקיפוד והשתמש בצמר גפן כירורגי טרי או באפליקטור עם קצה כותנה.

עבור כל מעבר, אנו מעריכים את עומק ואיכות הנשימות במהלך החיטוי כדי להבטיח שהסכר אינו מגיב לאחר מכן, לאחר מעבר האתנול השני של 70%, הנחנו מיד את משטח הגחון הארור על וילון סטרילי והנחנו אותה על כרית מחוממת למשך שתיים-שלוש דקות כדי לחמם אותה. זהו זמן נוח לרשום נתונים טרום ניתוחיים בגיליון יומן ניתוח ההישרדות של העכברים. צירפנו את גיליון הנתונים שלנו לניתוח הישרדות עכברים כמידע משלים.

שקול לכלול את גיליון הנתונים ואת פרוטוקול הטיפול בבעלי החיים שלך כדי שוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית שלך תוכל לראות כיצד תפקח על הנתונים לפני הניתוח ואחרי הניתוח. אנו משלימים דף יומן אחד לכל נבדק כירורגי. אנו מעדיפים לבצע ניתוח בסביבה סטרילית, אם כי זה בדרך כלל לא נדרש למכרסמים.

משטח העבודה נפרד ממנוע המפוח ומבית המליאה, כך שלא מועבר רטט למשתמש. במהלך המיקרו-הזרקה, הוספנו כמידע משלים, סכימה של השינויים שביצענו במכסה הזרימה הלמינרי שלנו כדי להקל על העברת גנים ברחם, השינויים החיוניים הם אתגר וואט נמוך וחיתוכי תאורת מסלול ושקעים נסתרים לכבלי חשמל של מכשירים, ונתיב ניתוב למעגלים חשמליים אביזרים. הסוויטה הכירורגית מורכבת משקית IV חשמלית של צלצולים, אמבטיה חמה, מניפולטור XY, Z, פלואורסצנטי סטריאו, מיקרוסקופ ניתוח, מקור אור סיבים אופטיים ומכשירים כירורגיים.

דוושות רגל משמשות להפעלת מזרק המיקרו, אלקטרו פרטר נכנס למוקד. מכשירי הניתוח של ההיקף מעוקרים בחיטוי. יש לעקר מחדש מכשירים בין עכברים באמצעות מעקר חרוזי זכוכית או על ידי חיטוי מחדש של נהג המחט.

מספריים Balli, מלקחיים טבעתיים ומלקחיים כלי דם הם הכלים החיוניים. חתך קו אמצע גחוני, תפוס את העור בעזרת מלקחיים וסקולריים וכרת את המכלול בעזרת המספריים עם קצה הכדור, הארך את החתך 10 עד 14 מילימטרים. זהה את רצועת כלי הדם הלבנה של הרקמה המחוברת הנקראת linea alba וקו האמצע הגחוני של הבטן חותך את האלבה הליניארית עם המספריים עם קצה הכדור.

היזהר לא לחתוך את המעיים או את כריות השומן המפשעתיות. להשקות מיד את הבטן בתמיסת רינגר חלב סטרילית מחממת מראש. להעריך את אתרי החתך בעור ובדופן הבטן לאיתור דימום.

לחץ ישיר עם מלקחיים קהים יעצור דימום קל אם קיים, החצין את קרני הרחם הימנית והשמאלית בעזרת מלקחיים עם קצה טבעת. תפוס בעדינות את קרן הרחם הימנית עם קצה טבעתי אחד של המלקחיים ומשוך את הרחם לכיוון חתך קו האמצע. השתמש בידך החופשית כדי לתפעל בעדינות את הצד הצדדי של הסכר כדי להקל על חיבור הרחם.

המלקחיים לעולם אינם משמשים לדחיסת הרחם ולמשיכתו החוצה. מכיוון שהדבר עלול לפגוע בכלי הרחם או בעוברים, חזור על הליך ההחצנה לקרן הרחם השמאלית. השקו מיד את קרני הרחם החדשות שמוחצנו בתמיסת רינגר חלב חמה מראש, הכנסו בעדינות את רפידות השומן הפנימיות או את המעיים אם הם מוחצנים עם הרחם.

זה לא נתקל לעתים קרובות. חלק שני: הזרקת מיקרו רחם. הסכר מסודר מתחת למטרה למרחק עבודה ארוך ונורת סיבים אופטיים של כבל רך מוצבת על דופן הרחם.

הרחם נלחץ בעדינות עם אצבע היד החופשית. כדי להקל על זיהוי כיוון העובר. האור מכבל הסיב האופטי צריך להיות בעוצמה הנמוכה ביותר הנדרשת כדי להעריך במדויק את כיוון העובר.

אור עז יכול להעביר חום לרחם שעלול לגרום לסיבוכים. אנו מחזיקים את אור הסיב האופטי ואת הרחם ביד אחת ומשתמשים באצבע ביד החופשית שלנו כדי למקם מחדש את העובר על ידי מישוש עדין. אנו מדגימים בשלושת הסרטונים הבאים על ידי קטעי EC במיקרוסקופיה ואת כיווני העובר הנפוצים שנצפו על ידי הרחם.

הצופה יראה את המראה המיקרוסקופי שאנו רואים במהלך הארת טרנס, אם כי בשחור לבן תאורת טרנס של הרחם מאפשרת זיהוי של כיוון העובר in vivo. בדוגמה זו, העובר נמצא בתנוחת עמידת ראש כאשר פני הגחון שלו פונים אל הצופה. על ידי החלפת הרחם קדימה ואחורה, אנו יכולים לזהות את הגפיים האחוריות הימנית והשמאלית, את הזנב ואת צפלון העין השמאלית.

בדוגמה זו, העובר נמצא שוב בתנוחת עמידת ראש, אך מסתובב כ-90 מעלות ביחס לציר האחורי הקדמי. על ידי החלפת הרחם בעדינות קדימה ואחורה, אנו יכולים לראות את צורות ההנעה המגדירות את הגפה האחורית השמאלית ואת הגפה השמאלית. המוח האחורי ניכר גם הוא.

העובר נמצא במצב זקוף כשצדו השמאלי פונה אל הצופה. החדר הרביעי המתהווה ניתן לזיהוי ככתם בהיר במוח האחורי. צפלון העין השמאלית, ארבע הגפיים השמאליות והגפיים האחוריות השמאליות ניכרים גם הם.

לחץ עדין על הרחם מכוון מעט את העוברים כדי לאפשר זיהוי של תא המטען הראשי של וריד הראש הראשוני והענפים הקדמיים והאחוריים שלו, המסומנים בכוכבית לבנה ושחורה בהתאמה. כפי שנראה, האוטיס ממוקם באמצע הדרך בין הענפים הקדמיים והאחוריים של וריד הראש הראשוני. לא ניתן לראות את האוטיס עצמו דרך הרחם על ידי הארה.

אנו מדגימים בשני קטעי מיקרוסקופ וידאו עוקבים כיצד לכוון מחדש את העובר למיקרו-הזרקה לסיוע אוטיס. המטרה היא לזהות את ציוני הדרך העובריים המאפשרים אינטרפולציה של מיקום האוטיס בראש הרוחבי. בנוסף, המטרה שלנו היא לכוון מחדש את העובר ממצב הגב למצב הצדדי כדי שנוכל לזהות את וריד הראש הראשוני.

החדר הרביעי של המזנספלון והגפה השמאלית ניכרים במיקום הגב. לחץ עדין על הרחם מעביר את כיוון העובר מהגב למועד מאוחר יותר. צפלון העין השמאלית, המזנספלון והחדר הרביעי נראים בקלות.

וריד הראש הראשוני והענף האחורי שלו המסומנים על ידי הכוכבית ברורים גם הם. הענף הקדמי של וריד הראש הראשוני אינו מזוהה בבירור. המטרה שלנו, שוב, היא לכוון את העובר כך שיוכל לזהות את וריד הראש הראשוני, אך בהגדלה גבוהה יותר המתאימה למיקרו-הזרקה ברחם.

כלי הרחם, הרצועה העשרונית והעין השמאלית נראים בפרספקטיבה רוחבית זו. לחץ עדין על הרחם משנה את מיקום העובר, כך שנוכל לזהות את העין השמאלית של החדר הרביעי. וריד הראש הראשי והענף האחורי שלו המסומן בכוכבית, וריד הראש הראשי וענפיו יוצרים את צורת הפוטבול האמריקאי זקוף.

לא ניתן לראות את השלפוחית האוטית דרך הרחם, אך היא ממוקמת במרכז הזקופים. לין יזמה רצף הזרקה לעובר אחד. היא מאירה את הרחם, מכוונת מחדש את העובר לזריקת מיקרו, ומביאה את פיפטת הזרקת המיקרו המלאה בירוק מהיר לשדה.

פיפטת המיקרו הזרקה מחוברת למחזיק פיפטה המוחזק על ידי מניפולטור X, Y, z מיקרום. המעמד המגנטי של המניפולטור מחובר ללוח פלדה עם בסיס טפלון המאפשר מיקום גס ללא מאמץ של פיפטת המיקרו-הזרקה. המחט מתקדמת באמצעות כפתור בקרת המיקרומטר הקדמי במניפולטור כראוי.

פיפטות מפוברקות חיוניות להזרקת מיקרו טראומטית לעובר העכבר בשלב אוטיס המוקדם. אנו מושכים צינורות נימי זכוכית בורוסיל עבים עם קירות עם מושך פיפטה אופקי. הפיפטה המתקבלת המוצגת ב-A נשברת ידנית עם מלקחיים בערך במיקום הקוטר החיצוני של 14 עד 16 מיקרון המצוין על ידי ראש החץ ב-B. השבירה הגסה של הפיפטה המוצגת ב-C היא משוננת ושברירית.

אנו משופעים את הפיפטה בכ-20 מעלות כדי לחדד את קצה הפיפטה כפי שניתן לראות בלוח D פרמטרים למשיכה ושיפוע של פיפטות מיקרו-הזרקה מסופקים בטקסט הנלווה. אנו מדגימים בשני קטעי המיקרוסקופיה הבאים מיקרו-הזרקה לסיוע האוטי של העכבר בימים העובריים 11.5 ו-12.5. המטרה שלנו היא להדגים מיקרו-הזרקה של הרחם ליום העוברי, 11.5 עכברים.

ראשית, אנו מזריקים את ה-otics ללא נוכחות הרחם כדי להראות באופן חד משמעי כיצד נראית זריקה ממוקדת נכונה. לאחר מכן אנו מדגימים הזרקת מיקרו טרנס-רחמית אותנטית. עבור הזרקה ראשונה זו, הרחם נחתך בקפירה כדי לאפשר לשק הקרביים להוציא את הרצועה העשרונית המכסה את שק החלמון הקרביים.

השליה נשארת מחוברת לרחם והעובר חי. עם הסרת הרחם באופן פוקאלי, אנו רואים את החדר הרביעי, וריד הראש הראשוני, וענפיו הקדמיים והאחוריים, הפיפטה והמיקום המשוער של הציסטה בלבן. בתחילת רצף הזרקה זה, זרימת הדם מתגלה בכלי הדם של שק החלמון הקרביים.

הפיפטה מוקדמת דרך שק החלמון הקרביים ודאי מוזרק לתוך תו האוזיס, צינור הלימפה האנדו-לימפטי בגב ומיקום האוטיקה במרכז הזקופים. האוטיקה נמצאת באמצע הדרך בין הענפים הקדמיים והאחוריים של וריד הראש הראשוני, הזרקת מיקרו רחם ליום העוברי. 11.5 OTICS של עכבר דורש זיהוי של וריד הראש הראשוני ולפחות אחד מענפיו כדי להעריך את מיקום הסיוע האוטי.

המטרה שלנו בדוגמה דיאגרמטית זו, הן הענפים הקדמיים והן האחוריים של וריד הראש הראשי מזוהים עם טריטוריית ה-OUC המסומנת בלבן. הצגה מציאותית יותר של העובר היא כזו שבה מתגלה תא המטען הראשי של וריד הראש הראשוני יחד עם אחד מענפיו בלבד והדוגמה המוצגת נראית רק הענף האחורי של וריד הראש הראשוני, אך זה מספיק כדי לפרש את מיקום האוטיקה. ה-PT מתקדם דרך הרחם וצבע מוזרק לתוך האוטיקה.

אנו ממתינים 30 שניות כדי לאפשר לצבע להתנקות מחלל מי השפיר, ובשלב זה אנו יכולים לראות את צינור הלימפה האנדו-לימפטי בגב ואת הפרוזדור. אנו מסיימים בתצוגה בהגדלה נמוכה של העובר שאת הציסטה שלו הזרקנו זה עתה כדי לספק פרספקטיבה אנטומית בתצוגה זו, נראים עין שמאל של החדר הרביעי וכלי הרחם. אנו מדגימים טרנס ומיקרו-הזרקה לציסטה האוטית העוברית של העכבר ביום 12 ומיקרו-הזרקה לחדר הרביעי המתהווה של המוח האחורי.

טרנס-הארה מאפשרת לנו לזהות את וריד הראש הראשוני במבט לרוחב שמאלי זה כמו גם את העין. הפיפטה מוקדמת דרך הרחם לתוך השלפוחית האוטית ומתה מוזרקת כדי למלא את הלומן שלה. כדי להזריק את החדר הרביעי, אנו מסובבים את העובר ב-90 מעלות לתצוגה גבית של המוח האחורי.

הציסטה השמאלית המוזרקת נמצאת כעת בצד שמאל. הפיפטה מתקדמת דרך הרחם וירוקה מהירה מעורבבת עם לור. דקסטרן מצומד מוזרק לחדר הרביעי.

שימו לב שנפח הצבע המוזרק אינו נכנס למוח התיכון in vivo. הקרינה מוערכת לאחר ההזרקה כדי לאמת לוקליזציה של דקסטרן בחדר הרביעי. לאחר מכן העובר מכוון מחדש ממצב גבי לרוחב.

צינור הלימפה האנדו הוא רק גחון לחדר הרביעי במבט רוחבי זה. פלואורסצנציה in vivo מאמתת לוקליזציה של הדקסטרן בחדר הרביעי. בלידה, אנו מסננים גורים לפלואורסצנטיות ירוקה בחדר הרביעי באמצעות אפי פלואורסצנטי.

לניתוח גורי מיקרוסקופ עם פלואורסצנטיות ירוקה במוחם האחורי יש אוזן פנימית שעברה מניפולציה במהלך האמבריוגנזה חלק שלישי אלקטרופורציה in vivo. לאחר מילוי הציסטה בפלסמיד ביטוי, הרחם מושקה טרי בתמיסת רינגר חלב חמה מראש. Transillumination מקל על ריכוז ציסטת ה-ODU בשדה האלקטרודות.

ראש המתכת של אור הסיב האופטי נסוג מפני השטח של הרחם. לפני התחלת רכבת הדופק של הגל המרובע, אנו מדגימים בסרטון המיקרוסקופיה הבא מחזור אלקטרופורציה שלם in vivo. אלקטרופורציה של היום העוברי, 11.5 ציסטה אוטית של עכבר דורשת מיקום עדין של האלקטרודות בסגנון ההנעה על הרחם.

בדוגמה זו, הציסטה האוטית השמאלית התמלאה בפלסמיד ביטוי והרחם הושקה טרי עם טבעות חלביות. הקתודה ממוקמת לרוחב ביחס לציסטה האוטית המלאה והאודה ממוקמת באופן מדיאלי בתחילת רצף ההנעה, הציסטה האוטית מרוכזת בשדה ההנעה. הרחם נדחס בעדינות ורכבת הדופק של הגל המרובע מופעלת באמצעות מתג דוושת רגל.

באופן אידיאלי 60 עד מאה מיליאמפר של זרם מועבר לכל דופק. לאחר מכן הרחם משוחרר ומושקה מיד. הרחם הטרי שהושקה מוחזר לחלל הבטן בלחץ עדין עם מלקחיים הטבעתיים.

לאחר הפנמת הרחם, חלל הבטן נשטף בכארבעה מיל של טבעות חלב ומשאיר כמיל אחד של טבעות חלב בחלל הבטן כדי לסייע בשמירה על הידרציה של הסכר שישתה פחות מים מהרגיל מיד לאחר ניתוח בטן. דופן הבטן ולאחר מכן העור נסגרים בתפר נספג באמצעות נהג מחט. לנהג המחט שלנו יש מספריים מובנים שמפשטים את הסגירה.

אנו מעדיפים תפר רץ הן לדופן הבטן והן לעור. אנו נועלים כל תפר שני כדי לספק תמיכה נוספת במקום החתך. אנו נותנים תרופה נוגדת דלקת לא סטרואידית תת עורית לפני הנחת הסכר בכלוב ההתאוששות.

התייעץ עם הצוות הווטרינרי שלך לגבי משככי כאבים מונעים המועדפים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הסכר שוכן בתוך וילון סטרילי ומונח על רצפת כלוב ההתאוששות המחומם. כלוב ההתאוששות מכיל חומר קינון, צינור אדום לכיסוי, צ'או מעבדה ובקבוק מים.

הכלוב מורכב מחדש עם מכסה מנוע פילטר למעלה בבוקר שלאחר הניתוח. הסכר מטופח להפליא, אמבולטורי ומסוגל לאזן את גפיו האחוריות כדי לשאול על החלק העליון של הכלוב הפתוח. קו התפרים בבטן נקי, יבש ואינו מראה עדות להיפרדות, אדמומיות או נפיחות.

צירפנו מסמך הדן בפיתוח פרוטוקול טיפול בבעלי חיים להעברת גנים ברחם. המסמך מכיל שפה שעשויה להיות שימושית בעת עיצוב פרוטוקול ספציפי למוסד בהתייעצות עם הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים שלך. חלק רביעי, תוצאות מייצגות.

פאנלים מייצגים של תוצאות A ו-B מראים שבלול מייצג מגור יום שישי לאחר הלידה שאוטיס שלו הוזרק עם פלסמיד ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ביום העוברי 11.5 ולאחר מכן אלקטרו. דופן השבלול הצדדית הוסרה מאמצע הטווח ומהקודקוד. רק ביטוי GFP קיים מהבסיס לאמצע הטווח של השבלול ועוקב אחר התפלגות סמן תאי השיער מיוזין 7 A המוצג בפאנל B.פאנל C מראה הקרנה קונפוקלית בהגדלה נמוכה של היום העוברי.

18.5 איבר עכבר של קורד אימונולוגי צבוע במיוזין שבעה תאים שעברו טרנספטציה של נוגדן A מפוזרים בכל איבר הקורד. לוח D מציג הקרנה קונפוקלית בהגדלה גבוהה של היום העוברי. 18.5 איבר עכבר של קורד מוכתם בסינט. שבע.

ביטוי GFP מזוהה בתאי שיער פנימיים וחיצוניים, תאים בין-פלנגאליים, תאי עמוד ותאי TER. אלקטרופורציה תיווכה העברת גנים לאוטיס ביום העוברי 11.5 אבות טרנספקט המולידים את כל סוגי התאים המרכיבים בתוך איבר הקורד.