נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את הביטוי של RNA חיידקי בתאי חיידקים בודדים. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון גשוש (probe) של חומצת גרעין נעולה (LNA) עם מודיפיקציית biotin TEG בקצה ה-5'. לאחר קיבוע של תאי החיידקים, טיפול ב-dathyl, percarbonate או dsy וביצוע חדירה (permeation), ה-RNA עובר דנטורציה והגשוש מסוג LNA עובר היברידיזציה.

שלישית, התאים נשטפים, נחסמים ונצבעים. לבסוף, הפלואורסצנציה התאית נמדדת באמצעות ציטומטריה של זרימה. באופן זה, ניתן להעריך שינויים בביטוי ה-RNA לאורך זמן ובתוך אוכלוסיות.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לנוכחות ולשפע היחסי של מיני RNA בתוך תא בודד, ולמידה שבה ביטוי זה משתנה בתוך אוכלוסיות הומוגניות או הטרוגניות. למרות ששיטה זו משמשת כעת לניטור ביטוי של RNA קטן בחיידקים, תאורטית ניתן להשתמש בה לגילוי RNA פוטנציאלית בכל סוג תא. לאחר עיצוב רצף הגשושית מסוג LNA, השתמש ב-blast כדי לוודא שהגשושית ספציפית אך ורק ל-SRNA או ל-mRNA המבוקשים.

בעת הזמנת הגשש (probe), יש להוסיף מודיפיקציית biotin TEG לקצה הפריים חמישה (') של אוליגוניוקלאיד ה-LNA. תיוג הביוטין נחוץ לצביעה לאחר ההיברידיזציה באמצעות תזמיג stripped avid and di. יש לכלול בשיטה שלוש בקרות שליליות: אחת, בקרת no LNA שבה לא מתווסף גשש LNA במהלך ההיברידיזציה.

שלב שני, בקרת היעדר צבע שבה גשש ה-LNA מגיב ל-SRNA המטרה, אך אירוע ההיברידיזציה אינו מזוהה בשל היעדר הצבע הפלואורסצנטי. ושלוש, בקרת SRNA או mRNA שאינם מובעים, המשתמשת בגשש LNA המכוון ל-SRNA שאינו קיים או שאינו מובע, וזאת כדי לנטר היברידיזציה לא ספציפית. התחילו באיסוף של 1×10⁸ תאים של החיידק הרלוונטי והעבירו אותם לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 ml. לאחר מכן, השקיעו את התאים החיידקיים ב-2300 ×g למשך חמש דקות לאחר הצנטריפוגה.

הסיר את הנוזל העליון באמצעות פיפט ולא על ידי שפיכה. לאחר מכן, השהה מחדש את המשקע ב-400 µL של PBS, הוסף 400 µL של תמיסת קיבוע A PFA acetic acid PBS וערבב היטב את התאים. כעת, הדגרא את התמיס למשך 10 דקות ב-25 °C.

ביצוע ערבול (Vortexing) פעם אחת לאחר חמישה דקות, לאחר סבב צנטריפוגה נוסף של התאים. הפעם ב-4,500 ×g למשך שתי דקות. יש לשטוף את המשקע פעמיים עם 400 µL של PBS.

לבסוף, השביחו מחדש את המשקע ב-400 µL של PBS ואחסנו את התאים המקובעים כעת בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך עד שבעה ימים. התחילו בהוספה של 400 µL של תמיסת 1% dsy שהוכנה טרי לכל דגימת תאי חיידקים מקובעים, ולאחר מכן ערבבו היטב את תמיסות התאים באמצעות פיפטינג.

דגרו תערובת זו למשך 12 דקות בטמפרטורה של 25 °C, ולאחר שטיפת התאים פעמיים עם 400 µL של PBS, הוסיפו לתאים 800 µL של תמיסת ליזוזים (lysozyme) שהוכנה טרי. ערבבו היטב את תמיסת התאים והליזוזים באמצעות וורטקס (vortexing) ודגרו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 °C עם ערבוב מדי פעם. לאחר סבב של התאים (spinning down), הוסיפו 800 µL של תמיסת proteinase K שהוכנה טרי למשקע וערבבו היטב את תמיסת התאים שהוחזרה לסuspended באמצעות פיפוט.

דגרו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25 °C, תוך ביצוע ערבוב במיקסר (vortex) באמצע תקופת הדגירה. לאחר סבב של צנטריפוגה ושטיפת התאים עם 400 µL של PBS, השעו את התאים שוב ב-400 µL נוספים של PBS והעבירו 100 µL מהסוספנסיה לארבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות בנפח של 1.5 mL; לאחר מכן, השקיעו את התאים והסילו את העל-נוזלים. כעת, דגרו את ארבעת הדגימות ב-100 µL של באפר היברידיזציה לכל דגימה בטמפרטורה של 60 °C למשך 60 דקות. עם סיום ההיברידיזציה, הוסיפו 1 mL של SSC פלוס tween 20 או SSCT לתערובת ההיברידיזציה כדי לאפשר את הוצאת התאים מהתמיסה הצמיגה של ההיברידיזציה.

לאחר השקיעה, הוסיפו 200 µL של תמיסת form amide SSCT למשקעים וערבבו היטב. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 65 °C בבלוק חימום. כעת הוסיפו 1 mL של SSCT לתערובת ולאחר שקיעה נוספת של התאים, השעיו שוב את התאים ב-500 µL של SSCT ודגרו את תמיסת התאים למשך 40 דקות בבלוק החימום.

לאחר סבב של סבב צנטריפוגה (pelleting), הוסיפו למשקעי התאים שהועברו היברידיזציה 200 µL של תמיסת חסום (blocking buffer), ולאחר מכן גרעו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 °C. לאחר סבב צנטריפוגה נוסף, הוסיפו למשקעי התאים 50 µL של תמיסת צבע ואבידין מופשט (stripped avid) וערבבו את התאים היטב עבור בקרת חסר-צבע (no dye control). הוסיפו 50 µL של תמיסת חסום.

דגרו את כל הדגימות למשך 12 דקות נוספות ב-25 °C עם ערבוב קבוע ב-thermo mixer, תוך הגנה על המבחנות מפני אור באמצעות נייר אלומיניום. לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם 500 µL של באפר SSCT ופעם אחת עם 400 µL של PBS בתוספת tween 20 או PBST. לאחר הסרת העל-נוזלים (supernatants), הוסיפו 100 µL של biotinylated antis, strippin ו-PBS למשך 30 דקות ב-25 °C עם ערבוב מדי פעם; נוגדן זה יקשר ל-strippin DI conjugate שהוכנס בשלב הקודם.

לאחר מכן, לאחר השקעה ושטיפה של התאים פעמיים עם 400 µL של PBST, צבעו פעם שנייה על ידי הוספה של 50 µL של תמיסת ה-avid והצבע המופשטים לתאים וערבבו היטב. שלב זה מגביר את עוצמת האות עבור כל גשושית LNA שהשלימה היברידציה עבור בקרת ה-no dye. שוב, הוסיפו 50 µL של באפר חסימה בלבד, ולאחר מכן דגרו את כל המבחנות למשך 12 דקות ב-25 °C עם ערבוב קבוע ב-thermo mixer.

לאחר הדגרה עם תמיסת הצבע, שטפו את התאים פעם נוספת עם 500 µL של בופר SSCT, ולאחר השטיפה השנייה, שטפו פעם אחת עם 400 µL של PBST. השעיקו מחדש את המשקע ב-200 µL של PBST ואחסנו את התאים בטמפרטורה של 4 °C עד למועד ניתוח הציטומטריה הזורמת. עבור תאים בקטריאליים קטנים יותר, הגדירו את קצב הזרימה בציטומטר הזורם למהירות איטית כדי להקטין את גודל הליבה. בנוסף, עבור ציטומטרים זורמים עם ספי השמטה של פיזור קדמי (forward scatter threshold cutoffs), הגדירו את הסף לנמוך ככל האפשר כדי להבטיח זיהוי של התאים הבקטריאליים הקטנים.

דוגמה לתאים שקיובו וחלחלו ביעילות מוצגת כאן בתרשים פיזור (dot plot) של ציטומטריה זרימה, כאשר נעשה שימוש בתנאים שתוארו acabado. עבור החלחול, אוכלוסיית התאים קטנה והומוגנית, מה שמעיד על מעט אגרגטים של תאים. עם זאת, כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים יותר של ליזוזים, גדלה הסבירות להיווצרות אגרגטים של תאים ולהצגת ערכי פיזור קדמי (forward scatter) מוגברים המעידים על חלקיקים גדולים יותר, כפי שניתן לראות בתרשים פיזור זה.

כאן מוצגת דוגמה לנתוני ציטומטריה של זרימה מניסוי LNA flow fish מוצלח. ההיסטוגרמה מדגימה זיהוי ספציפי של SRNA מטרה לצד שלוש בקרות שליליות. הבקרה השלילית ללא צבע (no die) בסגול מפיקה את רמת הפלואורסצנציה הנמוכה ביותר, ואחריה הבקרות השליליות ללא LNA ו-SRNA שאינו מבוטא, בכחול ובאדום בהתאמה.

לבסוף, הדגימה עם גשש ה-LNA הספציפי ל-SRNA מייצרת את הפלואורסצנציה הגבוהה ביותר בשחור. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בערך בשישה שעות אם היא מבוצעת בצורה נכונה. בנוסף, טכניקה זו מספקת מידע רב יותר ויעילה יותר מבחינה כלכלית מאשר R-T-P-C-R.

בעקבות הליך זה, ניתן לסמן גשים נוספים עם HAPS אחרים ולהוסיפם במהלך שלב ההכלה (hybridization) כדי לאפשר זיהוי RNA מרובה (multiplex).