Name: נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למד לזהות ולכמת ביטוי RNA בחיידקים בודדים באמצעות שיטת LNA Flow-FISH. שיטה זו משלבת זרימה cytometry עם הכלאה פלואורסצנטית להבנת דינמיקת גנים במיקרוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המחקר של הצי הימי של ארה&quot;ב באמצעות כספים במעבדת המחקר הליבה.

<ol><li>Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+dynamics+in+human+lymphocyte+subpopulations+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry.</a> Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).</li>
<li>Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+telomere+length+of+human+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in telomere length of human chromosomes.</a> Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).</li>
<li>Pernthaler, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+of+mRNA+and+rRNA+in+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).</li>
<li>Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-FISH+analysis+and+isolation+of+clostridial+strains+in+an+anaerobic+semi-solid+bio-hydrogen+producing+system+by+hydrogenase+gene+target%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).</li>
<li>Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Viral+RNA+in+Infected+Cells+with+LNA+Flow-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH.</a> RNA. 16, 1679-1685 (2010).</li>
<li>Friedrich, U., Lenke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Enumeration+of+Lactic+Acid+Bacteria+in+Mesophilic+Dairy+Starter+Cultures+by+Using+Multiplex+Quantitative+Real-Time+PCR+and+Flow+Cytometry-Fluorescence+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).</li>
<li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11, 1745-1748 (2005).</li>
<li>Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISHing+with+locked+nucleic+acids+%28LNA%29%3A+evaulation+of+different+LNA%2FDNA+mixmers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers.</a> Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).</li>
<li>Obika, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2%27-O%2C+4%27-C-methyleneuridine+and+-cytidine.+Novel+bicyclic+nucleosides+having+a+fixed+C3%27-endo+sugar+puckering%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering.</a> Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).</li>
<li>Koshkin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA+%28locked+nucleic+acids%29%3A+synthesis+of+the+adenine%2C+cytosine%2C+guanine%2C+5-methylcytosine%2C+thymine%2C+and+uracil+bicyclonucleoside+monomers+oligomerisation%2C+and+unprecedented+nucleic+acid+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition.</a> Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).</li>
<li>Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+situ+hybridization+efficiency+with+locked-nucleic-acid-incorporated+DNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).</li>
<li>Robertson, K. L., Thach, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA+flow-FISH%3A+A+flow+cytometry-fluorescence+in+situ+hybridization+method+to+detect+messenger+RNA+using+locked+nucleic+acid+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes.</a> Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).</li>
<li>Waters, L., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136, 615-628 (2009).</li>
<li>Petersen, M., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA%3A+a+versatile+tool+for+therapeutics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics.</a> Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).</li>
<li>Corput, M. P. C. vd, Grosveld, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+Situ+Hybridization+Analysis+of+Transcript+Dynamics+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells.</a> Methods. 25, 111-118 (2001).</li>
<li>Silveira, A. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-coding+RNAs+in+environmental+vibrios%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios.</a> Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה זרימה FISH LNA המוצג כאן נעשה שימוש כדי לאתר את הביטוי של sRNA מן גראם שליליים ימיים החיידק Vibrio campbellii אשר הביטוי כבר בעבר אישרו דרך פרופיל microarray המבוסס על הביטוי שעתוק לאחור polymerase תגובת שרשרת 16. עד כה השתמשנו בשיטה זו כדי לעקוב אחר הביטוי של מגוון רחב של RNAs (למשל טרנס מקודד sRNA, sRNA כי לווסת את פעילות החלבון, riboswitches, ו-mRNA). ככזה, אנו בטוחים כי השיטה ניתנת להתאמה והוא יכול לשמש כדי לזהות כל יעד sRNA או mRNA והוא יכול להיות שונה לשימוש בכל מיני חיידקים או סוג תא. אם שינוי של פרוטוקול זה הוא הכרחי עבור סוגי תאים אחרים, המשתנה החשוב ביותר לשקול מניפולציה היא הצעד permeabilization. לדוגמה, כאשר שינוי תנאי permeabilization המתואר כאן, שינויים בריכוזים של ליזוזים ו proteinase K צריך להיבדק. מצאנו כי הכפלת אושילש את כמות ליזוזים ו proteinase K הביא שינויים משמעותיים הזרימה-FISH תוצאות LNA. יתר על כן, כאשר בדיקות permeabilization תנאים נוספים, התאים יש לנתח עבור clumping, אובדן התא האות השגה הטוב ביותר יחס רקע פלואורסצנטי. היקף clumping התא יכול להיבדק על ידי מיקרוסקופיה / או cytometry הזרימה. עד cytometry זרימה, גושים תא קיימים כמו זנבות של קדימה לעומת פיזור נקודה בצד העלילה ואת שיטת permeabilization הנכון יהיה למזער את האפקט הזה עוקב. שיטה זו היא גם מקובל זיהוי זמנית sRNA בלי שינויים גדולים לפרוטוקול כמתואר בדיקות נוספות LNA שכותרתו עם haptens אחרים כגון digoxigenin ניתן להוסיף במהלך שלב הכלאה ו זוהה אז עם נוגדן אנטי digoxigenin ו המצומד משני נוגדנים fluorophore. נכון לעכשיו, המגבלה היחידה שאנו נתקלים בשיטה זו היא חוסר יכולתה ליצור אות מספקת מצד לשעבר חלושותמינים sRNA נלחץ מאמצים נערכים כדי לקבוע את סף זיהוי (מספר העתק מוחלט לכל תא). בסך הכל, את שיטת תזרים LNA-FISH מספקת את ההזדמנות כדי למדוד sRNA חיידקי או ביטוי mRNA ברמת תא בודד באופן תפוקה גבוהה, כדי לספק תובנות על נוכחות השפע היחסי של מינים sRNA ואת מידת הביטוי שלו משתנה באוכלוסייה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פוספט 10X שנאגרו מלוחים (PBS), pH 7.4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease ללא מים </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (לא DEPC מטופלים) </td></tr><tr><td> 32% paraformaldehyde </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> RT 15714 </td><td> אתנול חינם </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> Acros אורגניקס </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> D5758 </td><tד&gt; שמור מיובש </td></tr><tr><td> ליזוזים </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> לפוראמיד </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Aliquot Deionized, ולהקפיא </td></tr><tr><td> Dextran סולפט MW&gt; 500.000 </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> D8906 </td><td> Aliquot פתרון 60% ולהקפיא </td></tr><tr><td> 50X פתרון Denhardt נתרכז </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> D2532 </td><td> Aliquot ולהקפיא </td></tr><tr><td> סודיום ציטרט חיץ 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; זרע DNA סלמון (טעון) 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Aliquot ולהקפיא </td></tr><tr><td> שמרים tRNA (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Aliquot ולהקפיא </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5X בפתרון הכלאה באתרו חסימת </td><td> וקטור מעבדות </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidin </td><td> וקטור מעבדות </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated אנטי streptavidin </td><td> וקטור מעבדות </td><td> BA-0500 </td><td> Aliquot ולהקפיא </td></tr></tbody></table>

נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו</emהכלאה> (lna זרימה fish): שיטה לגילוי חיידקי rna קטנים

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

הקרינה הכלאה באתרו (FISH) היא טכניקה רבת עוצמה המשמש לזהות בתרגום ספציפי רצפי חומצות גרעין בסביבה הסלולרית. על מנת להגדיל את התפוקה, דגים ניתן לשלב עם cytometry זרימה (flow-FISH) כדי לאפשר את זיהוי ממוקד של רצפי חומצות גרעין אלפי תאים בודדים. כתוצאה מכך, תזרים-FISH מציעה יתרון בולט על פני lysate / אנסמבל מבוססי חומצת גרעין לזיהוי שיטות כי כל תא היא כאל תצפית עצמאית, ובכך לאפשר ניתוח סטטיסטי ושונות חזק. תכונות אלה גרמו שימוש בשיטות דגים זרימה דגים במספר יישומים שונים בכלי של שיטות אלה הודגמה בהצלחה בזיהוי הטלומרים קביעת אורך, 1,2 הסלולר ביטוי גנים 3,4, ניטור כפל ויראלי תאים נגועים 5, וניתוח הקהילה ספירת חיידקים6. באופן מסורתי, סגוליות של שיטות דגים זרימה דגים כבר הנחילה ידי בדיקות דנ&quot;א oligonucleotide. ואולם, החלפת oligonucleotide בדיקות DNA עם אנלוגים של חומצות גרעין כמו בדיקות דגים זרימה FISH גדל הן רגישות וספציפיות של טכניקה זו בשל הטמפרטורות היתוך גבוהה (T מ &#39;) של אנלוגים אלו חומצות גרעין טבעי 7,8 . חומצות גרעין נעול (LNA) בדיקות הן סוג של חומצות גרעין אנלוגי המכילים נוקלאוטידים LNA זינק לאורך רצף ה-DNA או RNA 9,10. בשילוב עם דגים זרימה, בדיקות LNA בעבר הוכח להכות בדיקות דנ&quot;א קונבנציונלי 7,11 ו כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות mRNA אוקריוטים 12 ו-RNA נגיפי בתאי יונקים 5. כאן אנו להרחיב את יכולת לתאר שיטה זרימה FISH LNA אשר מאפשר זיהוי ספציפי של RNA בתא החיידקs (איור 1). באופן ספציפי, אנו מעוניינים זיהוי של קטן ללא קידוד הרגולציה RNA (sRNA) אשר משכו עניין רב בשנים האחרונות כפי שהם נמצאו לשמש גורמים רגולטוריים מרכזיים רבים תהליכים תאיים קריטי 13. עם זאת, יש כלים מוגבלים ללמוד sRNAs ואת האתגרים של גילוי sRNA בתאי החיידקים נובע בחלקו לגודל קטן יחסית (בדרך כלל 5-30 נוקלאוטידים אורך) ושפע נמוך של מולקולות sRNA כמו גם את הקושי הכללי בעבודה עם תאים ביולוגיים קטנים יותר עם משתנים ממברנות התאים. בשיטה זו, אנו מתארים קיבעון ו permeabilzation התנאים לשמר את המבנה של תאים חיידקיים ולאפשר את חדירת בדיקות LNA, כמו גם הגברה אות צעדים המאפשרים זיהוי ספציפי של שפע sRNA נמוך (איור 2).

שיטה חדשנית תפוקה גבוהה מתואר המאפשר איתור quantitation היחסי של RNA קטנים ביטוי mRNA של תאים חיידקיים יחיד באמצעות נעול בדיקות חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה<em&gt; באתרו</emהכלאה&gt;.

נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו</emהכלאה> (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים

היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH) היא טכניקה עוצמתית המשמשת לזיהוי ואיתור של רצפי חומצות גרעין ספציפיים בתוך התא...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את הביטוי של RNA חיידקי בתאי חיידקים בודדים. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון גשוש (probe) של חומצת גרעין נעולה (LNA) עם מודיפיקציית biotin TEG בקצה ה-5'. לאחר קיבוע של תאי החיידקים, טיפול ב-dathyl, percarbonate או dsy וביצוע חדירה (permeation), ה-RNA עובר דנטורציה והגשוש מסוג LNA עובר היברידיזציה.שלישית, התאים נשטפים, נחסמים ונצבעים. לבסוף, הפלואורסצנציה התאית נמדדת באמצעות ציטומטריה של זרימה. באופן זה, ניתן להעריך שינויים בביטוי ה-RNA לאורך זמן ובתוך אוכלוסיות.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לנוכחות ולשפע היחסי של מיני RNA בתוך תא בודד, ולמידה שבה ביטוי זה משתנה בתוך אוכלוסיות הומוגניות או הטרוגניות. למרות ששיטה זו משמשת כעת לניטור ביטוי של RNA קטן בחיידקים, תאורטית ניתן להשתמש בה לגילוי RNA פוטנציאלית בכל סוג תא. לאחר עיצוב רצף הגשושית מסוג LNA, השתמש ב-blast כדי לוודא שהגשושית ספציפית אך ורק ל-SRNA או ל-mRNA המבוקשים.בעת הזמנת הגשש (probe), יש להוסיף מודיפיקציית biotin TEG לקצה הפריים חמישה (') של אוליגוניוקלאיד ה-LNA. תיוג הביוטין נחוץ לצביעה לאחר ההיברידיזציה באמצעות תזמיג stripped avid and di. יש לכלול בשיטה שלוש בקרות שליליות: אחת, בקרת no LNA שבה לא מתווסף גשש LNA במהלך ההיברידיזציה.שלב שני, בקרת היעדר צבע שבה גשש ה-LNA מגיב ל-SRNA המטרה, אך אירוע ההיברידיזציה אינו מזוהה בשל היעדר הצבע הפלואורסצנטי. ושלוש, בקרת SRNA או mRNA שאינם מובעים, המשתמשת בגשש LNA המכוון ל-SRNA שאינו קיים או שאינו מובע, וזאת כדי לנטר היברידיזציה לא ספציפית. התחילו באיסוף של 1×10⁸ תאים של החיידק הרלוונטי והעבירו אותם לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 ml. לאחר מכן, השקיעו את התאים החיידקיים ב-2300 ×g למשך חמש דקות לאחר הצנטריפוגה.הסיר את הנוזל העליון באמצעות פיפט ולא על ידי שפיכה. לאחר מכן, השהה מחדש את המשקע ב-400 µL של PBS, הוסף 400 µL של תמיסת קיבוע A PFA acetic acid PBS וערבב היטב את התאים. כעת, הדגרא את התמיס למשך 10 דקות ב-25 °C.ביצוע ערבול (Vortexing) פעם אחת לאחר חמישה דקות, לאחר סבב צנטריפוגה נוסף של התאים. הפעם ב-4,500 ×g למשך שתי דקות. יש לשטוף את המשקע פעמיים עם 400 µL של PBS.לבסוף, השביחו מחדש את המשקע ב-400 µL של PBS ואחסנו את התאים המקובעים כעת בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך עד שבעה ימים. התחילו בהוספה של 400 µL של תמיסת 1% dsy שהוכנה טרי לכל דגימת תאי חיידקים מקובעים, ולאחר מכן ערבבו היטב את תמיסות התאים באמצעות פיפטינג.דגרו תערובת זו למשך 12 דקות בטמפרטורה של 25 °C, ולאחר שטיפת התאים פעמיים עם 400 µL של PBS, הוסיפו לתאים 800 µL של תמיסת ליזוזים (lysozyme) שהוכנה טרי. ערבבו היטב את תמיסת התאים והליזוזים באמצעות וורטקס (vortexing) ודגרו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 °C עם ערבוב מדי פעם. לאחר סבב של התאים (spinning down), הוסיפו 800 µL של תמיסת proteinase K שהוכנה טרי למשקע וערבבו היטב את תמיסת התאים שהוחזרה לסuspended באמצעות פיפוט.דגרו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25 °C, תוך ביצוע ערבוב במיקסר (vortex) באמצע תקופת הדגירה. לאחר סבב של צנטריפוגה ושטיפת התאים עם 400 µL של PBS, השעו את התאים שוב ב-400 µL נוספים של PBS והעבירו 100 µL מהסוספנסיה לארבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות בנפח של 1.5 mL; לאחר מכן, השקיעו את התאים והסילו את העל-נוזלים. כעת, דגרו את ארבעת הדגימות ב-100 µL של באפר היברידיזציה לכל דגימה בטמפרטורה של 60 °C למשך 60 דקות. עם סיום ההיברידיזציה, הוסיפו 1 mL של SSC פלוס tween 20 או SSCT לתערובת ההיברידיזציה כדי לאפשר את הוצאת התאים מהתמיסה הצמיגה של ההיברידיזציה.לאחר השקיעה, הוסיפו 200 µL של תמיסת form amide SSCT למשקעים וערבבו היטב. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 65 °C בבלוק חימום. כעת הוסיפו 1 mL של SSCT לתערובת ולאחר שקיעה נוספת של התאים, השעיו שוב את התאים ב-500 µL של SSCT ודגרו את תמיסת התאים למשך 40 דקות בבלוק החימום.לאחר סבב של סבב צנטריפוגה (pelleting), הוסיפו למשקעי התאים שהועברו היברידיזציה 200 µL של תמיסת חסום (blocking buffer), ולאחר מכן גרעו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 °C. לאחר סבב צנטריפוגה נוסף, הוסיפו למשקעי התאים 50 µL של תמיסת צבע ואבידין מופשט (stripped avid) וערבבו את התאים היטב עבור בקרת חסר-צבע (no dye control). הוסיפו 50 µL של תמיסת חסום.דגרו את כל הדגימות למשך 12 דקות נוספות ב-25 °C עם ערבוב קבוע ב-thermo mixer, תוך הגנה על המבחנות מפני אור באמצעות נייר אלומיניום. לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם 500 µL של באפר SSCT ופעם אחת עם 400 µL של PBS בתוספת tween 20 או PBST. לאחר הסרת העל-נוזלים (supernatants), הוסיפו 100 µL של biotinylated antis, strippin ו-PBS למשך 30 דקות ב-25 °C עם ערבוב מדי פעם; נוגדן זה יקשר ל-strippin DI conjugate שהוכנס בשלב הקודם.לאחר מכן, לאחר השקעה ושטיפה של התאים פעמיים עם 400 µL של PBST, צבעו פעם שנייה על ידי הוספה של 50 µL של תמיסת ה-avid והצבע המופשטים לתאים וערבבו היטב. שלב זה מגביר את עוצמת האות עבור כל גשושית LNA שהשלימה היברידציה עבור בקרת ה-no dye. שוב, הוסיפו 50 µL של באפר חסימה בלבד, ולאחר מכן דגרו את כל המבחנות למשך 12 דקות ב-25 °C עם ערבוב קבוע ב-thermo mixer.לאחר הדגרה עם תמיסת הצבע, שטפו את התאים פעם נוספת עם 500 µL של בופר SSCT, ולאחר השטיפה השנייה, שטפו פעם אחת עם 400 µL של PBST. השעיקו מחדש את המשקע ב-200 µL של PBST ואחסנו את התאים בטמפרטורה של 4 °C עד למועד ניתוח הציטומטריה הזורמת. עבור תאים בקטריאליים קטנים יותר, הגדירו את קצב הזרימה בציטומטר הזורם למהירות איטית כדי להקטין את גודל הליבה. בנוסף, עבור ציטומטרים זורמים עם ספי השמטה של פיזור קדמי (forward scatter threshold cutoffs), הגדירו את הסף לנמוך ככל האפשר כדי להבטיח זיהוי של התאים הבקטריאליים הקטנים.דוגמה לתאים שקיובו וחלחלו ביעילות מוצגת כאן בתרשים פיזור (dot plot) של ציטומטריה זרימה, כאשר נעשה שימוש בתנאים שתוארו acabado. עבור החלחול, אוכלוסיית התאים קטנה והומוגנית, מה שמעיד על מעט אגרגטים של תאים. עם זאת, כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים יותר של ליזוזים, גדלה הסבירות להיווצרות אגרגטים של תאים ולהצגת ערכי פיזור קדמי (forward scatter) מוגברים המעידים על חלקיקים גדולים יותר, כפי שניתן לראות בתרשים פיזור זה.כאן מוצגת דוגמה לנתוני ציטומטריה של זרימה מניסוי LNA flow fish מוצלח. ההיסטוגרמה מדגימה זיהוי ספציפי של SRNA מטרה לצד שלוש בקרות שליליות. הבקרה השלילית ללא צבע (no die) בסגול מפיקה את רמת הפלואורסצנציה הנמוכה ביותר, ואחריה הבקרות השליליות ללא LNA ו-SRNA שאינו מבוטא, בכחול ובאדום בהתאמה.לבסוף, הדגימה עם גשש ה-LNA הספציפי ל-SRNA מייצרת את הפלואורסצנציה הגבוהה ביותר בשחור. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בערך בשישה שעות אם היא מבוצעת בצורה נכונה. בנוסף, טכניקה זו מספקת מידע רב יותר ויעילה יותר מבחינה כלכלית מאשר R-T-P-C-R.בעקבות הליך זה, ניתן לסמן גשים נוספים עם HAPS אחרים ולהוסיפם במהלך שלב ההכלה (hybridization) כדי לאפשר זיהוי RNA מרובה (multiplex).

locked-nucleic-acid-flow-cytometry-fluorescence-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

הקמנו ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו לצורך זיהוי של גנום נגיף ה-DNA מתמשך בתוך סעיפי רקמות של מודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מאפשר לימוד תהליך זיהום על ידי codetection של הגנום הנגיפי, מוצרי RNA שלו, וחלבונים נגיפיים או סלולריים בתוך תאים בודדים.

איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA כדי למקם את lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למד לזהות ולכמת ביטוי RNA בחיידקים בודדים באמצעות שיטת LNA Flow-FISH. שיטה זו משלבת זרימה cytometry עם הכלאה פלואורסצנטית להבנת דינמיקת גנים במיקרוביולוגיה.

נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים

גלה סרטונים נוספים