תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל
10 בנובמבר 2011
כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר, ועוד תסיסנית גוף הזחל רקמות קיר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לסמן מיקרו-צינורות בדנדריטים של נוירונים חושיים בזחל דרוזופילה בשלב מוקדם. זה מושג תחילה על ידי הצמדת זחל בתא דיסקציה מגנטי, ולאחר מכן ניתוחו במהירות לפילה זחל. ואז עדיין בתא המגנטי, הפילה מקובע מיד וצביעת חיסון.
השלב האחרון הוא הרכבת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי הקונפוקלי של הרקמה יכול לחשוף התפלגות מיקרו-צינורית בדנדריטים של נוירון חושי דופמינרגי שלום, שמי אול קארים. היום אדגים פרוטוקול לתיוג אימונולוגי היסטולוגי של מיקרו-צינורות בדנדריטים עצביים חושיים, קנה הנשימה ושרירים בדופן גוף הזחל.
שיטה זו נועדה לספק תובנה לגבי ארגון Myco TL בנוירונים של חיישנים היקפיים. בנוסף, ניתן ליישם אותו לחקר רשתות Myco TL וסוגי תאים ורקמות אחרות של דופן גוף הזחל לפני שמתחילים. זה קריטי להצלחת פרוטוקול זה שהקיבוע יהפוך טרי מיד לפני תחילת פרוטוקול זה.
גם הרקע הגנטי של המניה הוא קריטי. לדוגמה, כדי לבחון נוירונים של עצים דנדריטיים, בחרו חיות שמבטאות תווית בקרומים של תאי העצב האלה, כמו למשל דובדבן MCDA או MCDA, RA כתום. בעזרת לולאת שיער שטפו במהירות זחל כוכב ראשון במים ולאחר מכן העבירו אותו לתא הדיסקציה.
כעת כדי לבחון את תאי העצב של צביר הגחונים, כוונו את הצד הגבי של הזחלים כלפי מעלה ואת הצד הגחוני על הזכוכית. כדי לבחון נוירונים של אשכול גבי, הפוך את הכיוון באמצעות סיכת חרקים, אבטח את הקצה הקדמי ליד ווי הפה. הנח את הסיכה קרוב לקצה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
רשתות מיקרו, משולשות, ובמיוחד אלה ב-DDR חיישן, יתפרקו במהירות לאחר תחילת הדיסקציה. השגת דיסקציה ראשונה וקיבוע מהיר הם גורמי מפתח בהצלחת פרוטוקול זה. חותכים את הקצה האחורי מאוד של הזחל בעזרת מספריים מיקרו בעזרת מלקחיים.
תפסו את רקמת המעי הבולטת מהפתח החדש ושלפו בעדינות את כל המעי. כעת עם מספריים מיקרו, הכנס להב אחד לאותו פתח וחתוך לאורך קו האמצע הגחוני לכיוון הקדמי. כעת הצמד את הפינות האחוריות החופשיות כעת ומתח בעדינות את פילה הזחל במידת הצורך.
ניקוי מהיר של האיברים הפנימיים הנותרים. ואז המשך מיד לקיבוע. כדי לשמר את המיקרו-צינורות השבריריים.
התחל בשאיבת מאגר HL 3.1 נטול סידן באמצעות פיפטה תוך מילוי מיידי של החדר בקיבוע טרי שהוכן מראש. בעזרת פיפטה אחרת, החלף מיד את הקיבוע המדולל הזה. עם קיבוע טרי, כל שלבי הקיבוע והעמידה מתבצעים בתא הדיסקציה.
במהלך תהליך זה, היזהר לא לדפוק את סיכות החרקים המחזיקות את הלבה מכיוון ש-MEL זה לנזק לרקמות. כעת אפשר לקיבוע להמשיך ללא הפרעה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לסיים את הקיבוע. שטפו את פילה הזחל שש פעמים עם PBST למשך 10 דקות בכל שטיפה.
לפיכך, הזחלים נשטפו נקיים מקיבוע במשך שעה אחת בסך הכל בטמפרטורת החדר. תסיסה במהלך הדגירה מיותרת ועלולה לגרום לנזק לא מכוון לרקמות. כדי להתכונן לצביעה, הסר את השטיפה האחרונה של PBST וחסום את הפילה הקבוע על ידי מילוי התא בסרום עיזים 5% ב-PBST, החלף את תמיסת החסימה בנוגדנים ראשוניים מדוללים בסרום עיזים 5% ב-PBST.
הנוגדנים העיקריים שבהם נעשה שימוש הם עכבר, אנטיפה, טובולין ואנטי CD 8 של חולדות, שניהם מדוללים מ-1 ל-1000 כדי למנוע את התייבשות הניסוי. הניחו את החדר במיכל פלסטיק עם רקמה לחה. דגרו את הפילה בנוגדנים למשך 16 שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, נקה את הנוגדנים הראשוניים הלא קשורים עם שש שטיפות של PBST למשך 10 דקות לכל שטיפה כפי שנעשה כדי להסיר את הקיבוע. לאחר שעה של שטיפות PBST, יש להוסיף את תמיסת הנוגדנים המשנית המדוללת בסרום עיזים 5% ב-PBST. בדוגמה זו, הנוגדנים הם LOR 4 88, IgG נגד עכבר ו-P SI שלושה IgG נגד חולדות מכסים את החדר מנקודה זו והלאה כדי למנוע הלבנת אור ארבע ואז מדגרים את הפילה במשני למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שעה בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה המשנית של הנוגדנים נקה את הנוגדנים הלא קשורים באותו לוח זמנים קפדני של שש שטיפות ב-PBST ב-10 דקות לכל שטיפה. כעת הפילה מוכן להרכבה להרכבה מהירה, טבלו את הרקמה בטיפה קטנה של 80% גליצרול באמצעות מלקחיים. אחזו בקצה הקצה הקדמי ליד ווי הפה והעבירו אותו לציפורן שקופית כלפי מטה, אטמו את דפנות החלקת הכיסוי עם לק לשיפור ניקוי הרקמות ודגימה יציבה קבועה.
הר DPX כפי שתואר קודם לכן, צביעה פלואורסצנטית גילתה כי לענפים שונים בתוך סוכת דנדריטים יש ארגון ציטו-שלד שונה בסוכת של נוירון DA מדרגה 4 מזחלי כוכב ראשון, הענפים העיקריים חיוביים לטובולין. בעוד שכמה ענפים צדדיים דקים אינם מכלול של קטעים סדרתיים באמצעות צביעה דומה של תא עצב DA מדרגה ראשונה שנעשה לסרט חושף יותר כאשר צביעה חיסונית של טובולין ברקמות הסובבות מבצעת ניתוח של ארגון מיקרו צינוריות ונוירונים. ניתן להחליף טובולין אנטי שומן קשה לעכבר באנטיכיה עכברית ספציפית לנוירון מדוללת מאחד ל-1000.
הענפים העיקריים של תאי העצב במחלקה 4 הם חיוביים ל-fch. בעוד שחלק מהענפים הצדדיים הדקים הם שליליים. מכלול של חלקים סדרתיים של שרירי דופן הגוף חשף את רשתות המיקרו-צינורות ברקמה זו.
הקרנה של מספר קטעים קונפוקליים שנחתכו דרך שרירי דופן הגוף וקנה הנשימה הראתה את רשתות המיקרו-צינורות המורכבות ברקמות אלה. בהתקרבות למכלול של חתכים סדרתיים דרך קנה הנשימה המסתיים בדופן הגוף, השריר חשף את המורכבויות של ארגון המיקרו-צינורות. אז השילוב של הליך זה עם שיטות אחרות כמו יצירת זחלים, נוירונים של חיישנים היקפיים, MXs גנטיים יכול לענות על שאלות נוספות כגון אילו מנגנונים שולטים בארגון מיקרו TL בדנדריטים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לסימון מיקרוטובוליים בדנדריטים של נוירונים תחושתיים בזבובים מסוג Drosophila בשלבי התפתחות מוקדמים של הזחל. הטכניקה כוללת דיסקציה וצביעה אימונוהיסטוכימית להדמיית ארגון המיקרוטובוליים ברקמות זחל שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מיקרוטובולים ממלאים תפקיד מכריע בפיתוח צורות תא מורכבות.
- הסתעפות דנדריטית חיונית לתפקוד נוירונלי.
- הבנת ארגון המיקרוטובולים מסייעת בחקר התפתחות נוירונלית.
- זחלי Drosophila משמשים כאורגניזם מודל למחקרי התפתחות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה חסונה לבחינת ארגון מיקרוטובולים.
- חקירת התפלגות מיקרוטובולים בדנדריטים של נוירונים תחושתיים.
- שיפור ההבנה של התפתחות נוירונלית ב-Drosophila.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע פשעי Drosophila בתא דיסקציה מגנטי.
- ביצוע דיסקציה לפשעים ליצירת פילאט (filet).
- קיבוע וצביעה אימונוהיסטוכימית של הרקמה.
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית של פלואורסצנציה אימונית לצורך ויזואליזציה.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של מיקרוטובוליים בדנדריטים של נוירונים תחושתיים.
- ויזואליזציה של התפלגות המיקרוטובוליים ברקמות זחליות שונות.
- הדגמת יעילות השיטה לחקר מבנים נוירונליים.
- תרומה להבנת תפקידם של המיקרוטובוליים בהתפתחות נוירונלית.
מסקנות
- השיטה המתוארת היא גישה מהימנה לחקר ארגון המיקרוטובוליים.
- התובנות שירכשו עשויות להנחות מחקרים עתידיים על התפתחות נוירונלית.
- ניתן להחיל טכניקה זו על רקמות אחרות בפשפשי Drosophila.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה מדויקת של ארגון המיקרוטובולים בצורות תא מורכבות תומכת בתיקוף מטרות במודלים של מחלות התפתחותיות-נוירולוגיות ומחלות של השלד התאי. שיטה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור דינמיקת השלד התאי לתוצאות פנוטיפיות במערכת שניתן לביצוע מניפולציות גנטיות בה. היא מספקת מערכת רלוונטית למחלה עבור סריקת גילוי מוקדמת של תרכובות המשפיעות על מורפולוגיה נוירונלית ומורפוגנזה של רקמות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקושרות בין ארגון מיקרוטובולי לבין הסתעפות דנדריטית ומורפולוגיה של נוירונים.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקול צביעה אימונוהיסטוכימית חסון לאישוש תפקודי של מטרות במודלים של נוירונים תחושתיים.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון בניבוי על ידי קורלציה בין שינויים בשלד התא לבין פנוטיפים מבניים בדנדריטים, בקנה הנשימה (tracheae) ובשרירים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר סימון סטנדרטי וניתן לשחזור של מיקרוטובולים לצורך דימות כמותי ברקמות זחלים מקובעות.
- יכולת הרחבה: תואם למיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח מקבילי של מספר רקמות.
- תמיכה בסינון: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סינון תרכובות המשפיעות על שלמות השלד התאי וצורת התא.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מודל לבחינת מנגנונים הקשורים למיקרוטובוליים בניוורו-דגנרציה ובהפרעות התפתחותיות.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ארגון השלד התאי ב-Drosophila לנתיבים שמורים בהתפתחות נוירונלית של יונקים.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר הערכה מוקדמת של השפעות תרכובות על רשתות מיקרוטובוליים כדי לתעדף מועמדים בעלי סיכון ביולוגי נמוך יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזה של מטרה ועד לסריקה פנוטיפית ותיקוף פרה-קליני, במיוחד עבור מטרות של השלד התאי וההתפתחות העצבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות ויזואליזציה של התפלגות מיקרוטובוליים בתגובה להפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות למורפולוגיה נורונית ומבנה רקמה.
- אנליזה: מאפשר השוואה של עוצמת המיקרוטובוליים, דפוסי התבסעות ושלמות הרשת בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם מאמצים לגילוי ביומרקרים הקושרים דינמיקה של מיקרוטובוליים לדגנרציה ולהתחדשות נורונית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לצביעה אימונוהיסטוכימית עבור רקמות זחליות רבות ורקעים גנטיים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות במנגנון השלד התאי.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והשחזרות בין מעבדות באמצעות פרמטרים קבועים של דיסקציה וצביעה אימונוהיסטוכימית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים מוקדמים על השפעות של תרכובות ברקמות שלמות.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות המווסתות מסלולי שלד תאי בהתפתחות עצבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, בטכניקות של דיסקציה ובצביעה אימונוהיסטוכימית.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית ובתיקוף של נוגדנים עבור איזופורמים ספציפיים של tubulin.
- מחייב סטנדרטיזציה של עיתוי הקיבוע ותנאי הבאפר כדי לשמר את שלמות המיקרוטובוליים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לשלבי התפתחות אחרים או לרקעים מוטנטיים.
- מוגבל על ידי הצורך בדיסקציה ובקיבוע מהירים למניעת פירוק של מיקרוטובוליים ברקמות רגישות.
