פילוח ומדידה של כמויות השומן מודלים השמנת יתר Murine באמצעות קרני רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות, לכמת ולהמחיש באופן לא פולשני את תכולת השומן בעכברים חיים. דבר זה מושג תחילה באמצעות ביצוע סריקת CT של העכבר בקרני X. השלב השני של ההליך הוא סגמנטציה וכימות של נפחי השומן בעכבר בהתבסס על צפיפות רדיולוגית.

השלב השלישי הוא הדמיה של נתוני ה-CT בתלת-ממד, כאשר נפחי השומן מודגשים באדום. בסופו של דבר, התוצאות מאפשרות כימות והדמיה של תכולת השומן במהלך מחקרים ארוכי טווח in vivo באמצעות albia X-ray ct, בשילוב עם חבילות התוכנה PMOD ו-vol view. אחד היתרונות המרכזיים של טכניקה זו לעומת שיטות קיימות, כגון ניתוח X vivo, הוא שהיא מאפשרת הערכה לא פולשנית וארוכת טווח של השומן במודלים של מחלות בבעלי חיים קטנים.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקלו בקשיים, כיוון שפרוטוקול הסגמנטציה וההדמיה כולל מספר שלבים שחובה להשלים בזה אחר זה. יתרה מכך, יש להשתמש בפרמטרי רנטגן אופטימליים במהלך הרכישה. כדי להשיג את הניגודיות הטובה ביותר מרקמה שומנית, התחילו בהרדמה של העכברים הנשמנים הרלוונטיים באמצעות תא השראה ולאחר מכן העבירו אותם למסכת הרדמה (nose cone).

שמרו על ההרדמה במהלך הדמיה ומיקמו את העכברים במיטה סטנדרטית לחולדה כאשר הגפיים נמצאות לצדי הגו. דבר זה מבטיח רכישת CT אחידה. הגדירו את מערכת ה-CT לסרוק מיטה באורך 115 millimeters באמצעות 600 projections.

כוון את מקור קרני ה-x ל-200 microamps ו-45 kilovolt peak והשתמש במסנן אלומיניום בעובי 0.5 millimeter כדי להקשיח את הגרורה. מינון הקרינה השקול בעומק שהעכבר יקבל בהגדרות אלו הוא בקירוב 220 milli seavers, בעוד שמינון הקרינה השקול השטחי במחשב הוא 357.4 milli seavert. בחר באלגוריתם FBP תוך שימוש בפרמטרים סטנדרטיים לשחזור התמונה.

בסופו של דבר, התמונה הסופית מורכבת מ"חורים של שועלים" (foxholes) איזוטרופיים ברזולוציה של 125 מיקרון, וניתן להשתמש בה לניתוח תמונות של בעל חיים שלם. ניתוח התמונה מבוצע באמצעות תוכנת הניתוח PMOD; ראשית, PMOD מחלק את התמונות לפי צפיפות הרקמה, ולאחר מכן מחשב את נפח השומן. לאחר טעינת התמונה, הקטינו את גודלה כדי לצמצם את הדרישות החישוביות.

עברו ללשונית התצוגה הראשית, בחרו בכלים (tools) ולאחר מכן בהפחתה (reduce). הגדירו את ערכי ההפחתה לשניים עבור X, שניים עבור Y ושניים עבור z, סמנו אישור, בחרו בהחלפה והפעילו את התהליך. תיבת הודעה תופיע כאשר התהליך יושלם.

כדי להסיר מהתמונות את אלמנטים של המצע וקונוף האף, יש למסך אותם לפני ניתוח ה-VOI. נווטו ל-planes layouts, rotations, mirror 3D markers ובחרו ב-planes and layouts. בחרו ב-show plane Z. לאחר מכן, גללו אל קונוף האף במישור Z.

בשלב הבא, בחרו את לשונית ה-VOI הראשית ובחרו ב-"draw vertices". שרטטו ROI סביב האף, תוך החרגת המיטה וקונוס האף, ובחרו ב-"copy actual ROI to each other". בצעו חיתוך עם אלמנט קונוס האף.

הדביקו את ה-ROI מהחוצץ (buffer) על האף לפי הצורך. השתמשו בפקודה לעריכת קבוצת קודקודים (edit group of vertices) כדי להתאים את ה-ROIs. כאשר קוני האף אינם נראים יותר, מחקו את ה-ROI וצרו VOI שיקיף את היקף בעל החיים.

עברו לכלי ה-VOI, ולאחר מכן למיסוך (masking) ואלגברה. הזינו 1000- בתיבת הדו-שיח המופיעה. לאחר מכן, בחרו בכפתור שכתוב עליו Mask voxels outside the selected vois.

כאשר מופיעה ההודעה "פעולת נתונים בלתי הפיכה, האם ברצונך להמשיך", בחר כן. כעת נווט ל-planes layouts, rotations, mirror 3D markers, ולבסוף ל-planes and layouts. בחר ב-show all planes.

בדוק את תקינות ה-VOI. כאשר ה-VOI נראה תקין, שמור אותו כקובץ ניתוח (analyze file) ושנה את קידומת שם הקובץ. המשך לסגמנטציה של התמונה עבור נפח החיה הכולל.

התחילו בבחירת כלים וגורמים חיצוניים (tools and external). לאחר מכן, סמנו את תיבת הסימון של הפילוח (segmentation). הזינו טווח של 300- עד 3,500+ והפעילו את הפילוח.

לאחר מכן בחרו ב-VOI statistics, המציג נתונים סטטיסטיים המייצגים את הנפח הכולל. רשמו לפניכם נפח זה. כעת בצעו סגמנטציה של התמונה עבור נפח השומן, תחילה על ידי חזרה לתמונה הלא-סגמנטרית של המסה.

שנית, טענו את קובץ נתוני המסה השמור וסמנו את תיבת ה-analyze בחלון הטעינה. לאחר מכן, בחרו ב-tools ולאחר מכן ב-external. לבסוף, סמנו את תיבת הבחירה של ה-segmentation.

הזינו טווח של 200- עד 50- והפעילו את הסגמנטציה. לאחר אישור התוצאות, בחרו ב-VOI.Statistics. שימו לב, הסטטיסטיקות המדווחות מייצגות את נפח השומן.

שמרו את התוצאות בפורמט המנותח וספקו קידומת ייחודית לשם הקובץ. עם זאת, אם נותרה צפיפות של עור או רקמה פריפריאלית, השתמשו בפרוטוקול של שחיקה (erosion) והרחבה (dilation) כדי להסיר אזורים אלו לצורך ניתוח ה-VOI. לפני השמירה, ניווו ל-tools external ובחרו בתיבת הסימון morphological בתיבה החדשה.

בחרו ב-erosion ולאחר מכן ב-OK. חזרו לתיבת הסימון של morphological ובחרו ב-dilation ולאחר מכן ב-OK. ודאו שבעיית העור או הצפיפות הפריפריאלית נפתרה ושמרו את התוצאות. השתמשו בחבילת התוכנה Volvo view גרסה 3.2 כדי ליצור תצוגות ויזואליות תלת-ממדיות מרונדרות של התמונות הסגמנטליות.

התחילו בפתיחת סט נתוני ה-CT השמור בפורמט analyze. השתמשו בהגדרות ברירת המחדל בחלון הקופץ, לאחר מכן פתחו את תפריט התוספים (plugins) ובתוך תפריט utility בחרו ב-merge volumes. בטלו את הסימון של rescale components.

לחצו על assign Second input. בחרו את נתוני השומן המפולח (segmented fat data) עבור הקלט השני והשתמשו בהגדרות ברירת המחדל בחלון שנפתח. לאחר מכן, הפעילו את התוסף כדי לקבל תצוגה רחבה יותר של העכבר הנבדק.

לחץ פעמיים על חלון תצוגת הנפח. חזור ללשונית הצבע/שקיפות (color slash opacity). תיבת הבחירה של הרכיב (component) מתייחסת למערך הנתונים שנערך כעת.

שני סליידרים ממוקמים בתחתית הלשונית. הם קובעים את הבהירות היחסית של כל סט נתונים של רכיב בתוך השכבה העליונה (overlay) באמצעות ערכים בין אפס לאחד. כדי לשנות את הצבע לסולם אפור, למשל, עברו למסך מיפוי הצבעים הסקלארי.

לחץ פעמיים על אחד המכוונים וגרור אותו אל מחוץ למסגרת. הוסף מכוון שני על ידי לחיצה בכל מקום בתוך אזור המכוונים. הגדר את מכוון הצבע השמאלי לשחור ואת מכוון הצבע הימני ללבן.

בשלב הבא, עברו לתיבת מיפוי השקיפות הסקלרית (scalar opacity mapping) וצרו נקודה חדשה על ידי לחיצה בתוך התיבה. פעולה זו תניב סך של שלוש נקודות בחלון עבור הנקודה המרכזית. שנו את הערך הסקלרי לכ- 3000- ושנו את ערך השקיפות לאפס.

מימין לחלון נמצאת הנקודה השלישית; שנו את ערך הסקאלר שלה לכ-32,000 ואת העמימות (opacity) שלה ל-0.25. את הנקודה הראשונה ניתן למקם בכל מקום משמאל, כל עוד ערך העמימות מוגדר כ-0. כאשר הסקאלר מוגדר, עברו לרכיב (component) שתיים, שאמור לערוך את מראה השומן; שנו כל אחד ממסנני הצבע לאדום על ידי לחיצה כפולה והזזת מסנן הגוון H לקצה.

פעולה זו צובעת את השומן בצבע אדום (false colors). כדי ליצור סרט סיבוב בן שלושה פאנלים המציג את ה-CT של השומן והשכבה העליונה (overlay), ראשית לחצו וגררו את העכבר של הנבדק למצב זקוף כאשר הגב פונה כלפי U. שנית, תחת משקולות הרכיבים (component weights), הגדירו את הערך של רכיב שני לאפס, כך שיוצג רק סריקת ה-CT. שלישית, לחצו על review ולאחר מכן על camera ובחרו מספר פריימים עבור סרט הסיבוב. רביעי, שנו את ערך סיבוב ה-X ל-360 degrees.

בחלון הדיאלוג שנפתח, בחרו ב-Create. צרו תיקייה חדשה בשם CT ושמרו את הקובץ בפורמט TIF, מה שייצור סדרה של תמונות סיבוב. חזרו על שלבים אלה גם עבור תמונת השומן (fat image) וגם עבור תמונת השומן המוטלה על ה-CT (overlaid fat CT image), ושמרו את תמונות הסיבוב שלהם בתיקיות נפרדות. כדי להפיק סרטון סיבוב מתמונות הפלט, פתחו את ImageJ וייבאו את רצפי התמונות.

בחר את התמונה הראשונה בתיקיית ה-CT והשאר ייבחרו באופן אוטומטי. חזור על תהליך זה עבור רצפי השומן (fat) והשכבה (overlay) עם אחת מהערמות. השאר עדיין פתוחים.

פתחו את מנהל ה-ROI. הוא נמצא תחת כלי הניתוח (analyze tools), ולאחר מכן מנהל ה-ROI (ROI manager). שרטטו ROI מסביב לעכבר הנבדק באופן שמוציא פיקסלים מיותרים מהרקע. עם הסיום, לחצו על add במנהל ה-ROI.

לאחר מכן, החילו את אותו ה-ROI על כל רצף התמונות. כאשר ה-ROI מוגדר על כל הערימות, לחצו לחיצה ימנית. בתוך בחירת ה-ROI, בחרו ב-duplicate (שכפל) ובחרו את הערימה המשוכפלת.

פעולה זו מפרידה את ה-ROI משאר התמונה. כעת סגרו את ערימות התמונות הגדולות וחזרו על הליך זה עבור כל שלוש רצפי התמונות. כדי למזג את הערימות, השתמשו בפקודת combine, הנמצאת תחת תפריט stacks ולאחר מכן tools.

בחרו את ערימת ה-CT עבור ערימה אחת ואת ערימת השומן עבור ערימה שתיים. לאחר מכן חזרו על התהליך: בחרו את הערימות המשולבות החדשות עבור ערימה אחת ואת ערימת השכבה העליונה (overlay) עבור ערימה שתיים.

בכך הושלמה היצירה של ערימת סבב תמונות בעלת שלושה פנלים. ניתן לצפות בערימה על ידי בחירה ב-"play" בפינה השמאלית התחתונה של חלון התמונה. לאחר מכן, שמרו אותה כסרט AVI.

עכברי B6LEOB בעלי השמנה שימשו להדגמת ההיתכנות של מערכת ה-Alber CT. לצורך מדידות תכולת שומן מבוססות CT, הם הושוו לעכברי C57BL/6 מסוג בר (wild types). בצד שמאל מוצג נפח ה-CT הכולל של עכבר השמנ.

במרכז מופיע נפח השומן באדום, ומימין מופיעה השכבה העליונה (overlay). ניתוח דומה של בעלי חיים מסוג פרא (wild type) מראה הבדל משמעותי בתכולת השומן בהשוואה לעכבר השמנני. נפח כולל, נפח שומן ויחסי נפחים חושבו עבור כל בעל חיים.

יחס השומן הממוצע לנפח הכולל עבור קבוצת הטיפוס הפראי וקבוצת ההשמנה היה 0.09 ו-0.42 בהתאמה. ערכים אלו היו שונים באופן מובהק עם ערך P של 0.001. לאחר צפייה בסרטון זה, הלומד אמור להגיע להבנה מעמיקה של אופן סגמנטציית נפחי השומן בתוך סט נתוני CT של עכבר חי, לאחר רכישת המיומנות.

ביצוע טכניקה זו אמור לארוך פחות מ-30 דקות. תודה שצפיתם, ונפגש שוב בפעם הבאה.