יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור נקבוביות חולפות בקרומי התאים באמצעות הדפסת הזרקת דיו. זה מושג על ידי שינוי ראשון של מדפסת הזרקת דיו סטנדרטית. השלב השני הוא לרוקן ולנקות מחסנית דיו למדפסת מלאי כדי לאפשר הכנסת דיו ביו

לאחר מכן, התאים המעניינים מושעים בתמיסה של מונומרים אקטון ו-PBS מתויגים פלואורסצנטיים כדי ליצור את תמיסת הדיו הביולוגית. השלב האחרון הוא להדפיס את הדיו הביולוגי על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות המדפסת והמחסנית ששונו. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להראות כי ארבעת מונומרים האקטין המצומדים של פלואור הופנמו על ידי התאים המודפסים דרך נקבוביות ממברנה חולפות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות טרנספקציה סטנדרטיות ומיקרו-הזרקת תאים הוא שטכניקת הדפסה זו קלה לשימוש ומניבה כדאיות תאים גבוהה. למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנה לגבי גנטיקה, ניתן ליישם אותה גם בתחומי מחקר אחרים כגון ביופיזיקה של התא והנדסת רקמות בביופיזיקה של התא. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לצפות בקלות בשלד התא במהלך נדידת התאים.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר רצינו להיות מסוגלים לדמיין שינויים בסידור השלד הציטולוגי עקב כוחות המופעלים על התאים. התחל בשחרור נעילת תפסי הפלסטיק מהבסיס התחתון של המדפסת ולאחר מכן הרם באיטיות את מארז הפלסטיק העליון. לאחר מכן נתק את לוח האור של תצוגת הכפתור מהחלק העליון של המדפסת, והשאיר אותו מחובר ללוח האם של המדפסת.

שימוש במגבוני קים ואתנול. נקה את פנים המדפסת, במיוחד את האזורים שבהם מונחת מחסנית הדיו ושבהם מתבצעת ההדפסה. לאחר מכן, אתר את הכבל המספק חשמל למנגנוני הזנת הנייר עבור HP Desk Jet 500.

הם נמצאים ממש מתחת למגש הנייר משמאל לחזית ומנתקים את הכבלים מלוח האם. כעת אתר את מנגנון זיהוי הנייר תקן לולאת חוט לידית הפלסטיק האפורה שנמצאת מעל ומאחורי מנגנון הזנת נייר ההדפסה כדי לשמש כידית ידנית, מקם כאן שלבמה. מחזיק משלוח הקצף עבור 15 צינורות צנטריפוגה משמש עם מספר שקופיות מיקרוסקופ המודבקות באזור ההדפסה מול מנגנון הזנת הנייר כדי להביא את שקופיות ההדפסה הרצויות לרמה ממש מתחת לראש ההדפסה של המחסנית.

לבסוף, כדי לשמור על טכניקה אספטית, הנח את המדפסת בתוך מכסה זרימה למינרית. התחל בהוצאת המחסנית מאריזתה, והשאיר את סרט המגן המכסה את מגעי המדפסת וראש ההדפסה. ייצב את גוף המחסנית בעזרת clamp והשאיר את החלק העליון הירוק נקי מכל מכשול באמצעות כלי חיתוך סיבובי כף יד.

חתוך את החלק העליון הירוק מהמחסנית, רוקן את כל הדיו שנותר מהמאגר ולאחר מכן הסר את סרט המגן מפלסטיק המכסה את מגעי המדפסת וראש ההדפסה. סביר להניח שהמים ידלפו מראש ההדפסה במהלך תהליך זה, אך הם לא יגרמו נזק למחסנית. כאשר המים צלולים, הניחו למחסנית להתייבש.

כדי לשמור על סביבת הדפסה נקייה, התחל בטבילה מלאה של המחסנית בכוס מלאה במים נטולי יונים, ולאחר מכן בצע סוניזציה של המחסנית למשך 15 דקות. לאחר סוניקציה, הסר את המחסנית ונער את עודפי המים. רססו 70% אתנול לתוך המחסנית כדי ליצור סביבה אספטית יותר.

לאחר קצירת התאים המעניינים, צנטריפוגה את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום טרי בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר למשך חמש דקות ב-250 פעמים G בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את המדיום ולאחר מכן השעו מחדש את התאים בבת אחת 10 עד חמישית תאים למיליליטר בתמיסת מלאי אקטין G פלואורסצנטית שהוכנה לאחרונה כדי ליצור דיו ביו, שימו לב ש-250 מיקרוליטר של דיו ביו מדפיסים שלוש החלקות כיסוי עם דפוס הקו המוצג כאן. לאחר הפעלת המדפסת וחימוםה, הנח כאן את משטח ההדפסה הרצוי, נעשה שימוש בתלושי כיסוי בגודל 22 מילימטר על 22 מילימטר במרכז הבמה שהורכבה בעבר.

לאחר מכן, פתח תוכנת ציור ובחר את התבנית הרצויה. כעת פיפטה כ -100 עד 120 מיקרוליטר של מתלה התא לבאר העגולה הקטנה בתחתית תא המחסנית. הדפס את file כשהמדפסת מתחממת שוב, המחסנית תעבור למצב מוכן.

כאשר המחסנית נעה מעט שמאלה לדיו, טפטפו היטב ונשארו שם. משוך כלפי מעלה את מנגנון הזנת הנייר, החוט וההדפסה יתחילו. המדפסת תדפיס על פתק הכיסוי הממוקם במרכז שלב ההדפסה באמצעות מדפסת HP Desk Jet 500 עם דיו ביו המורכב מתרחיף תא פיברובלסט בתמיסת מונומר G actin.

בתוך סדרת HP 26, תאי מחסנית דיו הודפסו על פתקי כיסוי מיקרוסקופ זכוכית. איור זה ממחיש תוצאה מייצגת של תאי פיברובלסטים מודפסים המציגים מונומרים משולבים של אקטין פלואורסצנטי. דפוס זה שימש באיור הקודם ליצירת קו רציף של תמיסת ההדפסה על פני רוב שקופית המיקרוסקופ.

באיור זה מוצג הקו הישר שבו הקישור הביולוגי והתאים הופקדו הדדית. שימו לב שמיד לאחר ההדפסה, יש עלייה בקרינה ברקע מכיוון שתמיסת ה-biolink שבה התאים תלויים מכילה עודף מונומרים אקטין פלואורסצנטיים חופשיים הדוגרים על התאים במשך כ-10 דקות לאחר ההדפסה מקלים על ההדבקה לשקופית, ומאפשרים לשטוף את תמיסת המונומר העודפת מהמצע עם מצע גידול טרי המפחית משמעותית את הקרינה ברקע. כאן, תמונה מייצגת של שלושה T שלושה פיברובלסטים מודפסים באזור הדפסה מקומי, כפי שמוצג מיקרוגרף צילום במיקרוסקופיה פלואורסצנטית זו של תא שצולם 15 דקות לאחר ההדפסה מראה ג'ין בירוק, הגרעין בכחול ושכבת העל של אקטין GI וצבע גרעיני.

שתי התמונות הבאות מציגות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שני פיברובלסטים בתבנית קו שלוש שעות לאחר ההדפסה. תמונה ראשונה זו מציגה מונומרים אקטין עם תווית פלואורסצנטית בתוך תאים. תמונה שנייה זו היא שכבת-על של הערוץ הפלואורסצנטי עם תמונת הרקע כדי להראות שלמרות שייתכן שיש פסולת מסוימת על השקופית בפינה השמאלית התחתונה, היא אינה זוהרת.

לבסוף, קבוצת ביקורת של תאים שאינם מודפסים שהודגרו במשך שלוש שעות עם מונומרים מתויגים פלואורסצנטיים מוצגת כאן כדי להדגים כי מונומרים אינם יכולים לחדור לקרום התא ללא חדירת ממברנה על ידי הדפסת תאים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לנקות מספר מחסניות ומוכנות לשימוש שכן סתימת מדפסת היא אחת הבעיות שמאטות טכניקה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להמיר מדפסת שולחנית רגילה להדפסת תאים חיים, מה שעוזר ליצור כוח ממברנה חולף.