קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע את פעילות תאי T ציטוטוקסיים על ידי השוואה בין גישה מבוססת עכבה (אימפדנס) באמצעות מערכת EXOGEN לבין בדיקת שחרור כרום. השלב הראשון מבוצע על ידי הפרדת תאי PBMC (תאי מונונוקלאריים של דם פריפרי) מדם מלא באמצעות fial. לאחר מכן, מוסיפים את ה-PBMC לבארות יחד עם אנטיגן פפטידי, IL-2 רקומביננטי אנושי, ו-PBMC שהוקרנו כדי ליצור תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן.

תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן נתרבטים לאחר מכן יחד עם תאי גידול בשני הבדיקות כדי לגרום למות תאי הגידול. התוצאות המתקבלות מראות את אחוז הליזיס של תאי הגידול באמצעות שיטת העכבה (impedance) ובדיקת שחרור כרומיום. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת שחרור כרומיום, הוא שהמערכת המבוססת על עכבה אוספת נתונים בזמן אמת ודורשת פחות תאים שאינם נזקקים לסימון כלשהו. עבור פרוטוקול זה, דם מתורמים בריאים נורמליים חיוביים ל-HLA A2 משמש כמקור ל-pbmc או לתאי דם פריפריים חד-גרעיניים, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

השתמשו ב-F call PA plus כדי להפריד את ה-P BMCs מהדם. לאחר מכן, העבירו לפלטות של שישה בארות כ-4 מיליון P BMCs בשני מיליליטר של מצע לכל בארה. לכל בארה הוסיפו HLAA two binding peptide לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter בתרבית.

את התאים בימים חלופיים כדי לסייע בגירוי והרחבה של T-cells. הוסף מצע טרי המועשר ב-human recombinant IL two לריכוז סופי של 50 units per milliliter. לאחר שבוע, הכן תרבית של autologous pbmc, הקרן את התאים וחשף אותם למשך שעתיים לאותם hla.

פפטיד קושר שני בריכוז 10 micrograms per milliliter יעורר מחדש את התרבית על ידי הוספת one milliliter של PBM CS אוטולוגי שהקרן לכל באר. המשך להוסיף מצע טרי מועשר ב-IL two בימים לסירוגין. לאחר שבוע נוסף, עורר מחדש את התרביות באותה הדרך פעם שנייה. לאחר שישה ימים נוספים בתרבית, התאים יהיו מוכנים לשימוש.

הכינו את תחנת מדידת העכבה האינטליגנטית לשימוש על ידי שיווי משקל בטמפרטורה של 37 °C תחת 5% carbon dioxide למשך שעה אחת לפחות. קצרו תאי גידול אנושיים בהסמיכות של 75% באמצעות 0.25% trypsin וסבב צנטריפוגה. ספרו את תאי הגידול באמצעות המוציטומטר והחזירו אותם לתמיסת RPMI.

מצע גידול בריכוז של 7,500 תאים למיקרוליטר. בשלב הבא, תוכנת הסוכן של Excel הגדירה את דף הפריסה עם פריסת הבארות. הגדירו את דף לוח הזמנים כך שייקח קריאות עכבה בכל חמש דקות למשך תקופה של 40 שעות; במהלך 18 השעות הראשונות, מערכת ה-Xceligent תבצע קריאות עכבה של תאי הגידול בלבד.

לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של מצע גידול גידולי RPMI לכל באר. בצעו מדידת רקע ב-EPLs על ידי מדידת עכבה (impedance) בהיעדר תאים. לאחר הוספת תאי הגידול, הכניסו את הפלטות לתחנה והתחילו בביצוע המדידות.

תאי הגידול יתחילו להיצמד באופן מיידי ל-EPLs. לאחר כ-18 שעות של דגירה, תאי הגידול יהיו צמודים ל-EPLs ומספרם יוכפל ל-15,000 תאי גידול לבאר. בשלב זה, יש לאסוף את תאי ה-T שהוכנו באמצעות גירוד עדין וסבב צנטריפוגה.

יש להחזיר את תאי ה-T לתמיסת RPMI עם 10% FBS ולספור אותם באמצעות המוציטומטר. לאחר קביעת צפיפות התאים, הכין סדרת דילול דו-מכפלית של תאי ה-T, כך שכאשר מוסיפים 200 µL של תאי T לתאי הגידול, הריכוז הגבוה ביותר יהיה 40 תאי T לכל תא גידול. הדילול האחרון בסדרה צריך לספק 1.25 תאי T לכל תא גידול.

השעו את תחנת ה-EXOGEN והוציאו את ה-EPL באמצעות פיפטה. רוקנו את המצע מהבארים, ולאחר מכן טענו 200 microliters של תאי T תוך שימוש בכל הריכוזים מסדרת הדילול כביקורת שלילית. השתמשו במצע טהור, החזירו את ה-EPL לתחנה והמשיכו בתוכנית בסיום הבדיקה.

נרמלו את התוצאות. הקפידו תמיד לפעול לפי נהלי הבטיחות של המוסד מפני קרינה בעבודה עם כרום 51 ותאי מטרה המסומנים בכרום 51, והשתמשו במיגון כדי להפחית את החשיפה לקרינה. התחילו על ידי דחיסת (pulsing) תאי גידול למשך שעתיים בריכוז של 1 million cells per milliliter עם 10 µL per milliliter של כרום 51 טרי.

בשלב הבא, שטפו את תאי הגידול ב-10 milliliters של מצע RPMI עם 10%FBS, סובבו את התאים בצנטריפוגה והמיסו אותם מחדש באותו מצע בריכוז של 1 million cells per milliliter. לאחר מכן, בלוח של 96 בארות בעלות תחתית עגולה, הוסיפו 100,000 תאי גידול לכל בארה כדי לחשב שחרור ספונטני.

אל תוסיפו דבר לשש מבארים אלו ולשש בארות אחרות. הוסיפו 100 microliters של Triton X 100 לכל שאר הבארות כדי ללוטץ (lyse) את התאים ובכך לחשב את השחרור המקסימלי. הוסיפו תאי T לפלטה תוך שימוש בסדרת המיהולים שהוכנה קודם לכן.

כעת הדגרי את הפלטות למשך חמש שעות ואספי דגימות של 50 µL מהנוזל העליון (supernatant) מכל אחת; טעני את הדגימות לפלטת luma לאחר ייבוש הפלטות במנדף למשך הלילה בטמפרטורת החדר. מדדי את ה-CPM שלהן באמצעות מונה גמא. תאי T ותאי סרטן SKBR3 תורחשו על פלטות X intelligence ונמדד מדד התאים (cell index), המהווה ביטוי לעכבה (impedance) של הפלטה, מכיוון שתאי T אינם זקוקים להיצמדות כדי להתרבות.

השפעתם על העכבה הייתה זניחה לאורך תרבית של 40 שעות. תאי סרטן שגודלו לבדם הראו עלייה במדידת העכבה. עם זאת, הוספת תאי T לאחר 18 שעות קוטעת מגמה זו.

אירוע זה דורש נרמול תוכנתי לאחר הוספת תאי T ונחקר בהרחבה בניסוי הבא. כאשר תאי SK BR 3 תורבדו יחד עם ריכוזים משתנים של תאי T, נצפתה ירידה בעכבה (impedance) שהייתה תלויה בבירור במינון תאי ה-T; נתונים נאספו מדי חמש דקות לאורך שלושה ניסויים בנקודת הזמן של 10 שעות. מדדי התאים (cell indices) עקבו אחר פולינום מסדר שני בטווח ריכוזי תאי ה-T, מה שמעיד על כך שתחנת ה-Exogen מנטרת בזמן אמת מוות של גידולי SK BR 3 המתווך על ידי תאי CD 8, כביטוי של ירידה במדד התאים, וזאת כדי לקבוע אם הירידה בעכבה של תאי SK BR 3 על ידי תאי ה-T הייתה ספציפית לאנטיגן.

שלושה תאי SK KBR לטירפלו בקו-קולטורה עם תאי T ספציפיים ל-FLU חיוביים ל-HLA A 2 אשר אינם מזהים את HER 2 neu. תאים אלו הפגינו פעילות ליטית נמוכה משמעותית. כדי לקבוע עוד אם תאי T ספציפיים ל-HER 2 neu הורגים באופן ספציפי לאנטיגן, הוסף נוגדן ל-Fas ligand לקו-קולטורות. הנוגדן לא הפחית את הפעילות הליטית של תאי T הספציפיים ל-HER 2 neu P 360 9.

עם זאת, בתאי T שהופעלו באופן לא ספציפי באמצעות חרוזי anti CD three ו-CD 28, הנוגדן עיכב את הליזיס; זאת כדי לקבוע אם ההריגה התרחשה באופן תלוי HLA class one. תרביות משותפות קיבלו תוספת של נוגדן anti HLA class one או נוגדן ביקורת איזוטיפ. התוצאות תמכו בחוזקה בהשערה זו.

בשלב הבא, תאי T גודלו בתרבית משותפת עם תאי סרטן אחרים ביחס של אחד לחמישה. שורת תאי הגידול BT 20, שהיא שלילית ל-HLA A 2, שימשה כביקורת שלילית. התוצאות מראות כי השיטה יעילה עבור תאי גידול נצמדים ממספר יעדים שונים.

תרביות מעורבות של שני תאי T ספציפיים ל-P 360 9 של HER הוספו לתאי מטרה המסומנים ב-chromium 51, ולאחר מכן בוצע ניתוח CRA. נראה כי הבדיקה האינטליגנטית רגישה יותר לניתוח עקביות. השונות התוך-בדיקתית חושבה כמקדם השונות באחוזים עבור כל יחס תאים שבין 1:40 ל-1:5.

ערך זה נמדד מתחת ל-15% ביחסי התאים הנמוכים ביותר. עם זאת, אחוז ה-CV היה גבוה או לא ניתן לחיזוי. בנוסף, נבחנה השונות של ליזיס תאי SK BR 3 על ידי תרבית משותפת עם קווי תאי T שונים הספציפייםים ל-P 360 9.

הנתונים הופקו במרווחים של 30 ימים. הבדיקות בוצעו בשלישייה והתוצאות היו דומות מאוד. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לקבוע פעילות של תאי T ציטוטוקסיים באמצעות תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן ותאי גידול, תוך שימוש בגישה מבוססת עכבה (impedance).