קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence
8 באוגוסט 2012
Assay שחרור הכרום, assay משותף לאיתור פעילות תא T ציטוטוקסי, יש מספר מגבלות. השימוש באנטיגן ספציפי CD8 תאי T וקו האנושי של סרטן שד גידול, SKBR3, במאמר הנוכחי, גישה מבוססת עכבה נבדקה ליכולת של גילוי הרג תא.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע את פעילות תאי ה-T הציטוטוקסיים על ידי השוואת גישה מבוססת עכבה באמצעות מערכת EXOGEN לבדיקת שחרור הכרום. הצעד הראשון מושג על ידי הפרדת תאים חד-גרעיניים מדם היקפי מדם מלא באמצעות פיאל. לאחר מכן, ה-PBMC מתווספים לבארות יחד עם אנטיגן פפטיד, IL 2 רקומביננטי אנושי ו-PBMC מוקרן ליצירת תאי CD 8 T ספציפיים לאנטיגן.
תאי CD שמונה T הספציפיים לאנטיגן עוברים תרבית משותפת עם תאי הגידול בשתי הבדיקות על מנת לגרום למוות של תאי הגידול. מתקבלות תוצאות המראות אחוז ליזה של תאי גידול הן בשיטת העכבה והן בבדיקת שחרור הכרום. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקת שחרור כרום, הוא שהמערכת מבוססת העכבה אוספת נתונים בזמן אמת ודורשת פחות תאים שאינם זקוקים לתיוג כלשהו עבור פרוטוקול זה, דם מ-HLA בריא תקין שני תורמים חיוביים מספק מקור ל-PBMC או תאים חד-גרעיניים בדם היקפי בהתאם לפרוטוקול היצרן.
השתמש ב-F call PA plus כדי להפריד את ה-P BMCs מהדם. לאחר מכן לתוך שש לוחות באר מעמיסים כ-4 מיליון P BMCs בשני מיליליטר מדיה לבאר. לכל אחד מהם, הוסיפו היטב שני פפטידים קושרים HLAA לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם לתרבית מיליליטר.
התאים בימים לסירוגין כדי לעזור לעורר ולהרחיב תאי T. הוסף מדיה טרייה בתוספת IL רקומביננטי אנושי 2 לריכוז סופי של 50 יחידות למיליליטר. לאחר שבוע, הכינו תרבית של pbmc אוטולוגי, הקרינו את התאים ודופקו אותם במשך שעתיים עם אותו hla.
שני פפטידים קושרים ב-10 מיקרוגרם למיליליטר מעוררים מחדש את התרבית על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBM CS האוטולוגי המוקרן לכל אחד. ובכן, המשיכו להוסיף מדיה טרייה בתוספת IL 2 לסירוגין בימים לאחר שבוע נוסף, עוררו מחדש את התרבויות באותו אופן בפעם השנייה. לאחר שישה ימים נוספים בתרבית, התאים יהיו מוכנים לשימוש.
הכן את תחנת מדידת עכבת המודיעין לשימוש על ידי שיווי משקל ל-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני למשך שעה לפחות. קצור 75% תאי גידול אנושיים מתכנסים באמצעות 0.25% טריפסין וצנטריפוגה. ספרו את תאי הגידול באמצעות ציטומטר המו והרכיבו אותם מחדש ב-RPMI.
מדיה גידולית בריכוז של 7,500 תאים למיקרוליטר. התוכנית הבאה, תוכנת הסוכן של Excel הגדירה את דף הפריסה עם פריסת הבאר. הגדר את דף לוח הזמנים לביצוע קריאות עכבה כל חמש דקות למשך תקופה של 40 שעות במשך 18 השעות הראשונות, מערכת Xceligent תבצע רק קריאות עכבה של תאי הגידול.
לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיית גידול RPMI לכל באר. קח קריאת רקע על שם EPLs על ידי מדידת עכבה בהיעדר תאים. לאחר הוספת תאי הגידול, טען את הצלחות בתחנה משם והתחל לבצע קריאות.
תאי הגידול יתחילו מיד להיצמד ל-EPL. לאחר כ-18 שעות של דגירה, תאי הגידול יתחברו ל-EPLs ויוכפלו ל-15,000 תאי גידול לבאר. בשלב זה, הקציר הכין תאי T על ידי גירוד עדין וצנטריפוגת תסיסה.
תאי ה-T, מרכיבים אותם מחדש במדיה RPMI עם 10% FBS וסופרים אותם באמצעות ציטומטר המו. לאחר שצפיפות התאים ידועה, הכינו סדרת דילול כפולה של תאי T כך שכאשר מוסיפים 200 מיקרוליטר של תאי T לתאי הגידול, הריכוז הגבוה ביותר הוא 40 תאי T לתא גידול. הדילול האחרון של הסדרה אמור לספק 1.25 תאי T לכל תא גידול.
השהה את תחנת EXOGEN והסר את ה-EPL באמצעות פיפטה. הסר את המדיה בבארות, ולאחר מכן טען 200 מיקרוליטר של תאי T תוך שימוש בכל הריכוזים מסדרת הדילול כבקרה שלילית. השתמש במדיה טהורה, החזר את ה-EPL לתחנה משם והמשך את התוכנית בסוף הבדיקה.
נרמל את התוצאות. פעל תמיד לפי נהלי בטיחות קרינה מוסדיים בעת עבודה עם תאי מטרה המסומנים כרום 51 וכרום 51 והשתמש במיגון כדי להפחית את החשיפה לקרינה. התחל בפעימת תאי גידול במשך שעתיים במיליון תאים למיליליטר עם 10 מיקרוליטר למיליליטר כרום טרי 51.
לאחר מכן, שטפו את תאי הגידול ב-10 מיליליטר של מדיה RPMI עם צנטריפוגה של 10% FBS את התאים והרכיבו אותם מחדש באותה מדיה במיליון תאים למיליליטר. ואז לצלחת תחתונה עגולה היטב 96. הוסף 100,000 תאי גידול לבאר כדי לחשב שחרור ספונטני.
אל תוסיף שום דבר אחר לשש מהבארות הללו לשש בארות אחרות. הוסף 100 מיקרוליטר טריטון X 100 כדי לצרף את התאים ומכאן לחשב שחרור מקסימלי לכל הבארות הנותרות. הוסף תאי T לצלחת באמצעות סדרת הדילול שהוכנה קודם לכן.
כעת דגרו את הצלחות למשך חמש שעות ואספו 50 דגימות מיקרוליטר של סופרנטנט מכל אחת, טענו היטב את הדגימות על צלחת לומה לאחר ייבוש הצלחות במכסה המנוע למשך הלילה בטמפרטורת החדר. מדוד את העלות לאלף הופעות שלהם באמצעות תאי T של מונה גמא ו-SKBR שלוש. תאי סרטן תורבבו על לוחות אינטליגנציה X ואינדקס התא נמדד, שהוא השתקפות של עכבת הצלחת מכיוון שתאי T אינם דורשים היצמדות כדי להתרבות.
השפעתם על העכבה הייתה זניחה בתרבית של 40 שעות. תאי סרטן שגודלו לבד הראו מדידת עכבה הולכת וגוברת. עם זאת, תוספת של תאי T ב-18 שעות משבשת מגמה זו.
אירוע זה דורש נורמליזציה של תוכנה לאחר הוספת תאי T ונחקר עוד בניסוי הבא. כאשר שלושה תאים של SK BR היו בתרבית משותפת עם ריכוזים משתנים של תאי T, ההפחתה בעכבה הייתה תלויה בבירור במינון של נתוני תאי T שנאספו כל חמש דקות במשך שלושה ניסויים בסימן 10 שעות. מדדי התאים עקבו אחר פולינום מסדר שני על פני טווח תאי ה-T, מה שמצביע על כך שתחנת אקסוגן עוקבת אחר מוות מתווך של תאי T CD שמונה של גידולי SK B שלושה בזמן אמת כירידה באינדקס התאים כדי לקבוע אם הפחתה בעכבה של SK BR 3 על ידי תאי T הייתה ספציפית לאנטיגן.
SK KBR שלושה תאים היו בתרבית משותפת עם HLA A שני תאי T ספציפיים לשפעת חיוביים שאינם מזהים את HER שני חדשים. לתאים אלה הייתה פעילות ליטית פחותה משמעותית כדי לקבוע עוד יותר אם שני תאי ה-T הספציפיים החדשים שלה הורגים בצורה ספציפית לאנטיגן, נוגדן לליגנד מהיר שולב בתרביות הקו. הנוגדן לא הפחית את הפעילות הליטית של שני תאי ה-T הספציפיים החדשים P 360 9.
עם זאת, עם תאי T שלא הופעלו באופן ספציפי עם חרוזי CD 3, CD 28, הנוגדן אכן עיכב את הליזיס כדי לקבוע אם ההרג התרחש באופן תלוי ב-HLA Class One. נוגדן נגד HLA מסוג 1 או נוגדן בקרת איזוטיפ נוספו לתרביות הקו. התוצאות תמכו מאוד בהשערה זו.
תאי T עברו תרבית משותפת עם תאי סרטן אחרים ביחס של אחד לחמישה. קו תאי הגידול השלילי HLA A BT 20 שימש כבקרה שלילית. התוצאות מראות כי השיטה שימושית עבור תאי גידול נצמדים מרובים.
תרביות משותפות של שני תאי T ספציפיים חדשים P 360 9 נוספו לתאי המטרה המסומנים בכרום 51, ואחריהם ניתוח CRA. בדיקת המודיעין נראית רגישה יותר לניתוח עקביות. שונות תוך מבחן חושבה כמקדם השונות באחוז השונות ביחס תאים בין אחד ל-40 ואחד לחמש.
זה נמדד מתחת ל-15% ביחסי התאים הנמוכים ביותר. עם זאת, אחוז קורות החיים היה גבוה או בלתי צפוי. בנוסף, נבדקה השונות של SK BR שלושה ליזה של תאי T על ידי תרבית משותפת עם קווי תאי T ספציפיים שונים של P 360 9.
הנתונים הופקו בהפרש של 30 יום. הבדיקות בוצעו בשלוש פעמים והתוצאות היו דומות מאוד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע פעילות תאי T ציטוטוקסיים באמצעות תאי CD שמונה T ספציפיים לאנטיגן ותאי גידול תוך שימוש בגישה מבוססת עכבה.
סקירה כללית
מאמר זה בוחן גישה מבוססת עכבה לזיהוי פעילות של תאי T ציטוטוקסיים, בהשוואה לתור הזהב של שחרור כרום. המחקר משתמש בתאי CD8 ספציפיים לאנטיגן ותאי סרטן שד אנושיים כדי להעריך את האפקטיביות של השיטה החדשה הזו.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של סרטן
- בדיקות תאים
רקע
- תאי T ציטוטוקסיים ממלאים תפקיד חיוני במיקוון תאי סרטן.
- לתור הזהב של שחרור כרום יש מגבלות בזיהוי פעילות תאי T.
- שיטות מבוססות עכבה מציעות איסוף נתונים בזמן אמת.
- מחקר זה נועד לשפר את טכניקות הזיהוי עבור ציטוטוקסיות מתווכת על ידי תאי T.
מטרת המחקר
- להשוות גישה מבוססת עכבה עם תור הזהב של שחרור כרום.
- להעריך את האפקטיביות של תאי CD8 ספציפיים לאנטיגן בהריגת תאי גידול.
- להדגים את היתרונות של ניטור בזמן אמת בבדיקות פעילות תאי T.
שיטות ששימשו
- בידוד תאי דם חד-גרעיניים מפריפריה (PBMC) מתורמים בריאים.
- תרבית משותפת של PBMC עם תאי גידול ואנטיגנים פפטידיים.
- שימוש במערכת EXOGEN למדידות עכבה.
- השוואת תוצאות עם תור הזהב של שחרור כרום.
תוצאות עיקריות
- מדידות עכבה הצביעו על מוות של תאי גידול על ידי תאי T.
- נתונים בזמן אמת הראו קורלציה ברורה בין ריכוז תאי T ולסיס תאי גידול.
- השיטה מבוססת העכבה דרשה פחות תאים וללא תיוג.
- התוצאות הדגימו את הפוטנציאל של מערכת EXOGEN לניטור פעילות תאי T.
מסקנות
- הגישה מבוססת העכבה היא אלטרנטיבה קיימא לבדיקות מסורתיות.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של אינטראקציות תאי T עם תאי גידול.
- מחקרים עתידיים עשויים לאמת ולייעל עוד יותר את הטכניקה הזו.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of antigen-specific CD8 T cell cytotoxicity is critical for immuno-oncology target validation and preclinical candidate triage. The comparison of impedance-based real-time cytotoxicity measurement to the Chromium Release Assay (CRA) addresses key bottlenecks in assay sensitivity, reproducibility, and operational safety. Adoption of label-free, scalable cytotoxicity assays enhances predictive confidence and supports risk-adjusted advancement in cell therapy and immunotherapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of T cell-mediated tumor cell killing in antigen-specific contexts.
- Supports mechanistic de-risking by confirming HLA class I dependence and antigen specificity.
- Improves predictive confidence for immunotherapy targets by providing quantitative, real-time cytotoxicity data.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of standardized, reproducible cytotoxicity assays for high-throughput screening.
- Reduces cell input requirements and eliminates radioactive labeling, streamlining assay workflows.
- Enables real-time monitoring and quantitative comparison of compound or cell therapy efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cytotoxicity readouts with disease-relevant tumor models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery-stage validation to preclinical efficacy assessment in immuno-oncology programs.
- Supports risk-adjusted decision-making for advancing cell-based therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This impedance-based cytotoxicity assay bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by providing a scalable, quantitative platform for functional immune cell assessment.
- Discovery Biology: Quantifies antigen-specific T cell killing, supporting hypothesis testing and pathway de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, label-free cytotoxicity data suitable for assay standardization and platform reuse.
- Analytics: Provides real-time, quantitative readouts for comparing T cell potency and specificity across conditions.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro cytotoxicity with disease-relevant tumor models for biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a non-radioactive, scalable assay adaptable to diverse tumor cell lines and immune cell sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell function assays.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and safety by eliminating radioactive materials and reducing cell requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling sensitive, quantitative cytotoxicity assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immune cell isolation, expansion, and co-culture techniques.
- Needs access to impedance-based analytical platforms and compatible software infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup, normalization, and data interpretation.
- Adaptable to various adherent tumor cell lines, but suitability must be empirically confirmed.
- Practical limitations include the need for disease-relevant antigen specificity and HLA compatibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
1:16
Generation of Short-term Human Antigen-specific CD8 T Cell Lines
2:55
Preparation of Breast Cancer Cells
4:19
Co-culture of Tumor with CD8 T Cells
5:45
Chromium Release Assay (CRA)
7:21
HER-2/neu p369-specific T Cell / SKBR3 Breast Cancer Cells Co-cultures
11:09
Conclusion
0:05
Title
