איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות ולכמת את מאגר הרעלים החודר לציטוזול. כדי להשיג זאת, הרעל נקשר תחילה לפני השטח של תא המאכסן בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן מסירים את הרעל שלא נקשר ומחממים את התאים ל-37 °C, דבר המאפשר תנועה של הרעל אל מערכת הקרומים הפנימיים ובשלב הבא אל הציטוזול של המאכסן. לאחר חדירת התאים, נעשה שימוש ב-digitonin כדי ליצור חדירות סלקטיבית של ממבנה הפלזמה.

תמציות התאים מופרדות לפракציות ממברנה וציטוזול נפרדות באמצעות סנטריפוגציה דיפרנציאלית. כשלב סופי, נעשה שימוש בתהודה של פלזמה שטחית (SPR) כדי לזהות ולכמת את כניסת הרעלן לציטוזול, באמצעות פרפוזיה של פракציית הציטוזול על גבי חיישן SPR מצופה בנוגדן לרעלן. שיטה זו תסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של רעלנים, כגון היעילות והקינטיקה של כניסת הרעלן לציטוזול, כמות הרעלן הנכנסת לציטוזול ועיכוב תרופתי אפשרי של הובלת הרעלן אל הציטוזול. לפני תחילת פרוטוקול זה, הכין תאי HeLa להרעלת תאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, לאחר דגירה לילה של תאי ה-HeLa.

החליפו את מצע התרבית ב-1 mL של DMEM המכיל 100 ng/mL של Ganglioside GM1 והדגירו למשך שעה אחת ב-37 °C. פעולה זו מגדילה את מספר אתרי הקישור עבור רעלן החולרה, שכן קולטן GM1 של הרעלן יוטמע בממברנת הפלזמה של תאים שנחשפו לתמיסת GM1.

לאחר דגירה של שעה אחת, הסירו את מצע ה-GM one ושטפו את התאים פעמיים עם DMEM. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM המכיל מיקרוגרם אחד למילליטר של רעלן כולרה (cholera toxin), והעבירו את התאים לטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות. הסירו את המצע המכיל את הרעלן ושטפו את התאים פעמיים.

לאחר מכן, דגרו את התאים ב-1 mL של DMEM בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן הרצוי. בסיום כל תקופת מרדף (chase), שטפו את התאים ב-PBS ולאחר מכן דגרו כל באר עם 250 µL של 0.5 mM EDTA ב-PBS. לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, הסירו את התאים מפלטת שש הבערים על ידי טריטורציה (Trituration) נמרצת באמצעות פלפטת P 1000.

לאחר איסוף התאים מבאר אחת, שלבו אותם עם התאים מהבאר השנייה ולאחר מכן מהבאר השלישית מאותם תנאי ניסוי. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים המשולב משלוש בארי השחזור למבחנה אחת למיקרו-צנטריפוגה. כעת, סובבו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה במיקרו-צנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות.

בכבידה של 5,000 ×g יש להשיג משקעי תאים בגודל שקול בקירוב עבור כל התנאים. יש להשליך את הנוזל העליון ולאחר מכן לסuspended את משקע התאים ב-100 µL של תמיסת עבודה 0.04% של digitonin, שהוכנה מראש וקולתה. יש להניח את תרחיף התאים על קרח למשך 10 דקות. באמצעות מיקרו-צנטריפוגה לשולחן, יש לסובב את התאים המהו permeability על ידי digitonin ב-16,000 ×g למשך 10 דקות.

העבירו את שקע העל (supinate fraction) המכיל את הציטוזול למבחנת מיקרו-צנטריפוגה נקייה ושמרו את המשקע (pellet fraction) המכיל את האורגנלות. סטנדרטים של רעלן SPR מוכנים בריכוזים של 110, 1 ו-0.1 nanograms per milliliter בבופר HCN. דגימות מוכנות על ידי דילול של שקעי העל המכילים ציטוזול בבופר HCN לנפח סופי של 1 milliliter. נדרשים נפחי דגימה של לפחות 1 milliliter כדי להבטיח שכל האוויר ינוקה מלולאת הדגימה בנפח 500 microliter לפני ההזרקה. משקעי האורגנלות מושבים לסוסיפנזיה ב-1 milliliter של בופר HCN המכיל 1% Triton X 100.

הוספת דטרגנט נחוצה כדי לשחרר את מאגר הרעלים העטוף בממברנה. כמו כן, הכינו סטים מקבילים של פראקציות ציטוזוליות ופראקציות Organ L עבור ניסוי ביקורת כדי לאשר את דיוקness הליך הפרקציונציה; השעיו שוב את הפראקציה הציטוזולית ב-20 µL של תמיסת דגימה (sample buffer) בריכוז 4x ואת פראקציית Organ L ב-120 µL של תמיסת דגימה בריכוז 1x. הפרו נפחים שוויים של כל פראקציה באמצעות SDS-PAGE (אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם נתרק סולפט) ובצעו בדיקה באמצעות Western blot כדי להדגים את חלוקת חלבון ציטוזולי בפראקציית העילום (supinat) וחלבון ER מסיס בפראקציית המשקע (pellet). להכנת שקופית ה-SPR, הכניסו תחילה למכשיר ה-SPR שקופית זכוכית מצופה זהב עם שכבה מונחית בעצמה (self-assembled monolayer).

הפעילו את שקף החיישן על ידי ביצוע פרפוזיה של תמיסת E-D-C-N-H-S מעל השקף למשך 10 דקות בקצב זרימה של 41 microliters per minute. בכל הפרפוזיות הבאות, נשתמש באותו קצב זרימה. הסירו את בופר ההפעלה E-D-C-N-H-S על ידי שטיפת הפלטה למשך חמש דקות עם PBS המכיל 0.05%2020.

הפלטה מכילה כעת קשרי MI ריאקטיביים בעקבות הסרת החסימה על ידי תמיסת E-D-C-N-H-S. לאחר מכן, הזרים נוגדן anti CTA מעל שקופית החשש המופעלת בדילול של 1 ל-20,000 ב-20 millimolar sodium acetate למשך 15 דקות. תיראה ירידה ראשונית ביחידת מדד השבירה, המקוצרת כ-RIU, עקב השינוי ב-pH.

לאחר מכן תתרחש עלייה ב-RIU בעקבות לכידת הנוגדן על ידי קשרי הקישור התגובתיים של האמידים. בשלב זה, יש להסיר מהשקף החששון את הנוגדנים שלא נקשרו באמצעות שטיפה של חמש דקות ב-PBST. אות ה-RIU הנובע מהנוגדן שנלכד יגיע לרוויה ויתייצב, ובכך יספק אות בסיס חדש.

כשלב סופי בהכנת השريחה, בצעו פירפוז (PERFUSE) של אתנולמין בריכוז מולרי אחד על שريחת החיישן למשך חמש דקות. פעולה זו חוסמת ומנטרלת רצועות קשירה (tethers) שאינן קשורות שנותרו על שريחת החיישן. כדי לבסס קריאת בסיס, אות ה-RIU יעלה כאשר תבצעו פירפוז של PBST על החיישן המצופה בנוגדנים למשך חמש דקות.

לאחר מכן, בצעו פרפוזיה של דגימה ניסויית או של סטנדרט של רעל מעל החיישן למשך 300 שניות. הסירו את הליגנד מהבופר ובצעו פרפוזיה של PBST מעל החיישן למשך 200 שניות נוספות. כל רעל שנותר קשור לחיישן יוסר באמצעות שטיפה נוספת עם PBST ב-pH 5.0.

פעולה זו תחזיר את האות לקריאת הבסיס הראשונית שלו, ובכך תאפשר עיבוד של דגימה נוספת על אותו חיישן. לפני טעינת דגימה חדשה, דחפו כמות קטנה של אוויר דרך לולאת הדגימה כדי להוציא כל שארית נוזל מהדגימה הקודמת. לאחר הרכישה.

ניתן לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת scrubber two, וניתן להשתמש בתוכנת Igor להכנת האיורים. Pertussis toxin הוא רעלן מסוג AB שנע מפני השטח של התא אל ה-ER לפני ששרשרת ה-a שלו, PTs one, חודרת לציטוזול.

בדיקת התעברה מבוססת SPR הצליחה לזהות PTs בציטוזול של תאי CHO מורעלים. לא נוצר אות מהציטוזול של תאים שאינם מורעלים, דבר שאישש כי הנוגדן נגד PTs אינו מגיב בצלב עם רכיב כלשהו בציטוזול של תא המאחס.

פראקציית הציטוזול מתאים שהורעלו בנוכחות felden. גם במקרה זה לא התקבל אות חיובי; BFA מונע את הובלת הרעלין לאתר התעתוק של ה-ER, ובכך מונע את העברת שרשרת H אל הציטוזול. Chole toin הוא רעלין נוסף מסוג AB המתעתק דרך ה-ER.

CTA1 זוהה בfrakציה הציטוזולית מתאי helo שטופלו ב-CT. הדבר הדגיש כי המתודולוגיה עובדת עם סוגי תאים מרובים וניתנת ליישום עבור כל רעלן שקיים עבורו נוגדן לשרשרת האנטי. לא זוהה אות כאשר הפרקציה הציטוזולית מתאים שטופלו ב-CT הזרמה מעל חיישן SPR מצופה בנוגדן anti-CTB, ובכך הוכח כי בניגוד ליחידה CT A1, הפנטמר CTB הקושר לתא אינו חודר לציטוזול.

בעקבות הפרפה על חיישן SPR מצופה בנוגדן anti CTA. האות מהפרקציית האברונים הוא מחוץ לסקאלה בהשוואה לאות החלש יותר מהפרקציית הציטוזול. תוצאה זו עקבית עם חוסר היעילות הידוע של הובלת CT לאתר התעתוק של ה-ER, אשר בתורו מגביל את כמות הרעלן שיכולה להגיע לציטוזול.

ניתן גם לנטר את הצטברותו התלויה בזמן של רעלן ציטוזולי שהועבר פנימה. לאחר חשיפת תאים ל-CT בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, לא זוהה רעלן בציטוזול 15 דקות לאחר חימום ל-37 מעלות צלזיוס.

מאגר קטן של רעלן ציטוסולי זוהה לאחר 30 דקות ב-37 °C, וכמויות גדולות יותר של רעלן ציטוסולי זוהו בהדרגה לאחר פרקי מרדף של 45 ו-60 דקות. דבר זה מדגים הובלה מתמשכת וארוכת טווח של רעלן המשויך לתא אל הציטוסול המארח. הבדיקה יכולה לזהות גם את עיכוב התעתוק של הרעלן אל הציטוסול; תאים שטופלו ב-10% DMSO הראו רמות נמוכות של CT 1 דמוי ציטוסול בהשוואה לתאי ביקורת מורעלים שלא טופלו, דבר המעיד על עיכוב פריסת הרעלן.

שרשרת היא תנאי מוקדם עבור טרנסלוקציה לציטזול, ולכן ייצוב של CT A1 המושרה על ידי DMSO מנע בהתאם את תנועתו מה-ER לציטזול. כדי לכמת את חסימת טרנסלוקציית הרעל המושרה על ידי DMSO, נעשה שימוש בעקומה סטנדרטית שהופקה מריכוזים ידועים של רעל כדי לחשב ריכוז ציטוזולי של CT A1 של 0.3 nanograms per milliliter עבור תאים לא מטופלים, ו-0.1 nanograms per milliliter עבור תאים שטופלו ב-DMSO. עיכוב פתיחת המבנה (unfolding) של CT A1 על ידי DMSO גרם אפוא להפחתה פי שלושה בטרנסלוקציה של CT A1 מה-ER לציטזול.

בעקבות פרוצדורה זו, נוכל להשתמש בטכניקות אחרות, כגון בדיקות רעילות (intoxication assays), כדי לבסס קשר ישיר בין כמות הרעלן הנוכחת בציטוזול לבין פעילות הרעלן.