Name: איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למדו לאתר ולכמת רעלנים בציטוזול תאי בעזרת תהודת פלזמון משטח. שיטה זו מאפשרת ניטור רגיש של כניסת רעלנים ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R01 AI073783 כדי Teter ק. אנו מודים לד&quot;ר שיין מאסי לסיוע בפיתוח של חלוקה פרוטוקול subcellular והלן Burress לקריאה ביקורתית של כתב היד.

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השוואה המתודולוגיה הקיימת Assay SPR מבוססי שלנו טרנסלוקציה מייצג שיטה מהירה, רגיש, כמותי כדי לזהות משלוח רעלן לתוך cytosol המארח. הטכניקה אינה דורשת radiolabeling או שינויים אחרים הרעלן, וזה יכול להיות מיושם על כל רעלן עבורו אנטי רעלן נוגדנים שרשרת זמין. השיטות הקיימות כדי לפקח על המעבר רעלן לתוך cytosol גם לסמוך על פרוטוקול חלוקה subcellular לתא תמציות לתוך cytosol מחיצה נפרדת שברים קרום 11, 23, 27, 28....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> סיגמא </td><td> D141 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> סיגמא </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> סיגמא </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> רשימה </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> לנקב </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> סיGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA נוגדן </td><td> סנטה קרוז ביוטק </td><td> SC-80747 </td></tr><tr><td> נוגדן Anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 נוגדן </td><td> סנטה קרוז ביוטק </td><td> SC-57639 </td></tr><tr><td> Refractometer </td><td> רייכרט </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR חיישן שקופיות </td><td> רייכרט </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> מזרק משאבה </td><td> קול פאלמר </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

רעלים AB מורכב האנזימטית למקטע ו למקטע תא מחייב B 1. רעלנים אלה מופרשים אל הסביבה תאיים, אבל הם פועלים על מטרות בתוך cytosol האיקריוטים. יש רעלים א.ב. לנסוע נושאות שלפוחית ​​מפני השטח של התא אל reticulum endoplasmic (ER) לפני הכניסה cytosol 2-4. ב ER, קטליטי שרשרת מנתק משאר הרעלן ועובר דרך ערוץ חלבון מנהלת להגיע ליעד cytosolic שלה 5. Translocated, cytosolic שרשרת קשה לזהות כי סחר רעלן לחדר המיון הוא תהליך יעיל ביותר: רעלן הפנימו ביותר מנותבת אל lysosomes של השפלה, ולכן רק חלק קטן של רעלן פני הנכנס מגיע מנגנון Golgi ו - ER 6 -12. כדי לפקח על טרנסלוקציה רעלן מ ER כדי cytosol של תאים בתרבית, ששילבנו פרוטוקול חלוקה subcellular עם highly שיטה לגילוי רגיש של plasmon משטח תהודה (SPR) 13-15. קרום הפלזמה של תאים שטופלו הוא רעלן permeabilized סלקטיבי עם digitonin, המאפשר איסוף של שבריר cytosolic אשר perfused לאחר מכן על החיישן SPR מצופה רעלן אנטי נוגדנים שרשרת. החיישן נוגדן מצופה יכולים ללכוד לזהות pg / mL כמויות של רעלן cytosolic. באמצעות פרוטוקול זה, אפשר לעקוב אחר קינטיקה של כניסה רעלן לתוך cytosol ו לאפיין תופעות מעכבות על האירוע טרנסלוקציה. ריכוז של טוקסין cytosolic ניתן גם לחשב עקומת סטנדרט שנוצר עם כמויות ידוע של סטנדרטים בשרשרת כי כבר perfused על החיישן. השיטה שלנו מייצג מערכת מהירה, זיהוי רגיש, כמותי שאינו מחייב radiolabeling או שינויים אחרים רעלן היעד.

בדו&quot;ח זה, אנו מתארים כיצד plasmon משטח תהודה משמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך cytosol המארח. שיטה זו רגישה מאוד יכול לספק נתונים כמותיים על כמות הרעלן cytosolic, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלים.

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

רעלני AB מורכבים מיחידה A אנזימטית וממיחידה B נקשרת לתא1. רעלנים אלו מופרשים לסביבה החוץ-תאית, אך הם פועלים על...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות ולכמת את מאגר הרעל שנכנס לציטוזול. כדי להשיג זאת, הרעל נקשר תחילה לפני השטח של התא המארח בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן מסירים את הרעל שאינו קשור ומחממים את התאים ל-37 °C, דבר המאפשר תנועה של הרעל אל תוך מערכת הממברנות הפנימית, ובהמשך אל ציטוזול התא המארח. לאחר חדירת הרעל לתאים, נעשה שימוש בדיגיטונין כדי להגמיש באופן סלקטיבי את ממברנת הפלזמה.תמריתי התאים מופרדים לfracciones ממברנה וציטוזול נפרדות באמצעות צנטריפוגציה דיפרנציאלית. כשלב סופי, משתמשים בresonans פלזמה שטחית (SPR) כדי לזהות ולכמת את כניסת הרעל לציטוזול, באמצעות פרפוזיה של פראקציית הציטוזול מעל חיישן SPR המצופה בנוגדן נגד הרעל. שיטה זו תסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של רעלים, כגון היעילות והקינטיקה של כניסת הרעל לציטוזול, כמות הרעל שנכנסת לציטוזול, ועיכוב תרופתי אפשרי של תעתוע הרעל אל הציטוזול. לפני תחילת פרוטוקול זה, הכינו תאי HeLa להרעלת תאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, לאחר דגירה של תאי ה-HeLa למשך לילה.החליפו את מצע התרבית ב-1 mL של DMEM המכיל 100 ng/mL של Ganglioside GM1 והדגרימו למשך שעה אחת ב-37 °C. פעולה זו מגדילה את מספר אתרי הקשירה עבור רעלן החולרה, שכן קולטן ה-GM1 של הרעלן ישולב בממברנת הפלסמה של תאים שנחשפו לתמיסת GM1.לאחר דגירה של שעה אחת, הסיר את המדיום המכיל GM one ושטוף את התאים פעמיים עם DMEM. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DMEM המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר של cholera toxin, והנח את התאים בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות. הסר את המדיום המכיל את הרעלן ושטוף את התאים פעמיים.לאחר מכן, דגרו את התאים ב-1 ml של DMEM בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן הרצוי. בסיום כל תקופת מרדף (chase period), שטפו את התאים ב-PBS ולאחר מכן דגרו כל באר עם 250 µL של EDTA בריכוז 0.5 mM ב-PBS. לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, הסירו את התאים מהפלטה בעלת שישה בארות על ידי TRI נמרץ באמצעות פיפטמן P1000.לאחר איסוף התאים מבאר אחת, שלבו אותם עם התאים מהבאר השנייה ולאחר מכן מהבאר השלישית מאותו תנאי. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים המשולב משלוש בארי החזרים לפ menutupל מיקרוצנטריפוגה אחת. כעת, סובבו את נבובת המיקרוצנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות.ב-5,000 ×g יש להפיק משקעי תאים בגודל שווה בקירוב עבור כל התנאים. יש להסיר את הנוזל העליון ולאחר מכן לסבב מחדש את משקע התאים ב-100 µL של תמיסת עבודה 0.04% של digitonin, שהוכנה מראש וקולתה. יש להניח את תרחיף התאים על קרח למשך 10 דקות. באמצעות מיקרו-צנטריפוגה שולחנית, יש לסובב את התאים המאווררים על ידי digitonin ב-16,000 ×g למשך 10 דקות.העבירו את חלק התסנין (supernatant) המכיל את הציטוזול למבחנה חדשה למיקרו-צנטריפוגה ושמרו את חלק המשקע המכיל את האברונים. תמיסות סטנדרט של רעלן SPR הוכנו בריכוזים של 110, 1 ו-0.1 ng/mL בבופר HCN. דגימות הוכנו על ידי דילול של חלקי התסנין המכילים ציטוזול בבופר HCN לנפח סופי של 1 mL. נפחי דגימה של לפחות 1 mL נחוצים כדי להבטיח שכל האוויר יסולק מלולאת הדגימה בנפח 500 µL לפני ההזרקה. חלקי המשקע המכילים אברונים הושחאו מחדש ב-1 mL של בופר HCN המכיל 1% Triton X 100.הוספת דטרגנט הכרחית לשחרור מאגר הרעלים העטוף בממברנה. כמו כן, הכין סטים מקבילים של פראקציות ציטוזוליות ופראקציות של organ L עבור ניסוי ביקורת כדי לאשר את מהימנות הליך הפרקציונציה; השעה מחדש את הפראקציה הציטוזולית ב-20 µL של sample buffer בריכוז four x ואת פראקציית ה-organ L ב-120 µL של sample buffer בריכוז one x. הפר נפחים שוויים של כל פראקציה באמצעות sodium ESAL sulfate, poly acrylamide gel electrophoresis ובצע זיהוי באמצעות Western blood analysis כדי להדגים את חלוקתם של חלבון ציטוזולי בפראקציית העילאית (supine fraction) וחלבון ER ממיס בפראקציית המשקע (pellet fraction). להכנת שקף ה-SPR, הגדר תחילה שקף זכוכית מצופה זהב עם מונושכבה המרכיבה את עצמה (self-assembled monolayer) במכשיר ה-SPR.הפעילו את שקופית החיישן על ידי הזרמת תמיסת E-D-C-N-H-S מעל השקופית למשך 10 דקות בקצב זרימה של 41 µL לדקה. בכל ההזרמות הבאות, נשתמש באותו קצב זרימה. הסירו את בופר ההפעלה E-D-C-N-H-S על ידי שטיפת הפלטה למשך חמש דקות עם PBS המכיל 0.05% 2020.הפלטה מכילה כעת קשרי MI רהאיביים בעקבות הסרת החסימה על ידי תמיסת E-D-C-N-H-S. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה של נוגדן anti CTA מעל שקופית החיישן הפעילה בדילול של 1 ל-20,000 ב-20 millimolar sodium acetate למשך 15 דקות. תיראה ירידה ראשונית ביחידת מדד השבירה, המקוצרת כ-RIU, עקב השינוי ב-pH.לאחר מכן תהיה עלייה ב-RIU ככל שנוגדנים יילכדו על ידי הקשרי האמידם התגובתיים. בשטח החיישן, הסר את הנוגדנים שלא נקשרו באמצעות שטיפה של חמש דקות ב-PBST. אות ה-RIU הנוצר על ידי הנוגדנים שנלכדו יגיע למישור ויstбилиזציה, ובכך יספק אות בסיס חדש.כשלב סופי בהכנת השקף, בצעו PERFUSE של ethanolamine בריכוז one molar על גבי שקף החיישן למשך חמש דקות. פעולה זו חוסמת ומנטרלת כל קשרי קישור (tethers) שאינם קשורים שנותרו על שקף החיישן. אות ה-RIU יעלה כדי לבסס קריאת baseline; בצעו perfuse של PBST על גבי החיישן המצופה בנוגדנים למשך חמש דקות.לאחר מכן, ביצועו פרפוזיה של דגימה ניסויית או סטנדרט של רעלן מעל החיישן למשך 300 שניות. הסר את הליגנד מהבופר ובצע פרפוזיה של PBST מעל החיישן למשך 200 שניות נוספות. כל רעלן שנותר קשור לחיישן מוסר על ידי שטיפה נוספת עם PBST ב-pH 5.0.פעולה זו תחזיר את האות לקריאת הבסיס הראשונית שלו, ובכך תאפשר עיבוד של דגימה נוספת באותו חיישן. לפני טעינת דגימה חדשה, דחפו כמות קטנה של אוויר דרך לולאת הדגימה כדי להוציא כל שארית נוזל מהדגימה הקודמת. לאחר הרכישה.ניתן לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת scrubber two, וניתן להשתמש בתוכנת Igor להכנת איורים. רעלן הפרטוסיס הוא רעלן מסוג AB הנע מפני השטח של התא אל הרשת האנדופלזמית (ER) לפני ששרשרת ה-a של PTs one חודרת לציטוזול.בדיקת התעתוק המבוססת על SPR הצליחה לזהות PTs בציטוזול של תאי CHO מורעלים. לא נוצר אות מהציטוזול של תאים שאינם מורעלים, מה שאישש כי הנוגדן למסייעי PT לא הגיב באופן צולב עם רכיב בציטוזול של המארח.פרוקציית הציטוזול מתאים שהורעלו בנוכחות felden. גם A נכשל ביצירת אות חיובי, BFA מונע את הובלת הרעל לאתר התעבורה של ה-ER, ובכך מונע את העברת שרשרת H לציטוזול. Chole toin הוא רעל נוסף מסוג AB המועבר דרך ה-ER.CTA one זוהתה בפרקציה הציטוזולית מתאי helo שטופלו ב-CT. דבר זה הדגיש כי המתודולוגיה עובדת עם סוגי תאים מרובים וניתן להחילה אותה על כל רעלן שעבורו זמין נוגדן נגד שרשרת. לא זוהה אות כאשר הפרקציה הציטוזולית מתאים שטופלו ב-CT הועברה מעל חיישן SPR מצופה בנוגדן anti CTB, ובכך הוכח כי בניגוד לתת-היחידה CT A one, הפנטמר CTB הנקשר לתא אינו חודר לציטוזול.בעקבות הזרמה על חיישן SPR המצופה בנוגדן anti CTA. האות מחלקון האבניקים (organelle fraction) הוא מחוץ לקנה המידה בהשוואה לאות החלש יותר מחלקון הצייטוסול. ממצא זה עולה בקנה אחד עם חוסר היעילות המוכר של הובלת CT לאתר התעבורה של ה-ER, אשר בתורו מגביל את כמות הרעלן שיכולה להגיע לצייטוסול.ניתן גם לנטר את הצבירה התלויה בזמן של רעלן ציטוזולי שהועבר. לאחר חשיפת התאים ל-CT בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, לא זוהה רעלן בציטוזול 15 דקות לאחר חימום ל-37 מעלות צלזיוס.מאגר קטן של רעלן ציטוזולי זוהה לאחר 30 דקות ב-37 °C, וכמויות גדולות יותר של רעלן ציטוזולי זוהו לאחר פרקי מרדף של 45 ו-60 דקות. הדבר מעיד על הובלה מתמשכת וארוכת טווח של רעלן הקשור לתא אל הציטוזול המארח. הבדיקה יכולה לזהות גם את עיכוב העברת הרעלן אל הציטוזול; תאים שטופלו ב-10% DMSO הראו רמות נמוכות של רעלן דמוי ציטוזול CT1 בהשוואה לתאי ביקורת מורעלים שלא טופלו, דבר המעיד על עיכוב של פריסת הרעלן.שרשרת היא תנאי מוקדם לתעתוק אל הציטוזול, ולכן ייצוב של CT A1 המושרה על ידי DMSO מנע בהתאם את תנועתו מה-ER אל הציטוזול. כדי לכמת את חסימת התעתוק של הרעלן המושרית על ידי DMSO, נעשה שימוש בעקומת סטנדרט שנוצרה מריכוזים ידועים של הרעלן כדי לחשב ריכוז ציטוזולי של CT A1 של 0.3 nanograms per milliliter עבור תאים לא מטופלים, ו-0.1 nanograms per milliliter עבור תאים שטופלו ב-DMSO. עיכוב פתיחת המבנה של CT A1 על ידי DMSO הוביל, לפיכך, להפחתה פי שלושה בתעתוק של CT A1 מה-ER אל הציטוזול.בעקבות הליך זה, נוכל להשתמש בטכניקות אחרות, כגון בדיקות רעילות, כדי לבסס קשר ישיר בין כמות הרעל שנמצא בציטוזול לבין פעילות הרעל.

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר את טכניקת תהודת פלסמון פני השטח, או SPR, לחקר האינטראקציה בין שתי מולקולות באמצעות שבב חיישן. השינוי בזווית התהודה ובעוצמת האור המוחזר מזוהים כפונקציה של אסוציאציה ודיסוציאציה של שתי מולקולות, וזה מספק מידע על יחסי הגומלין בין שתי המולקולות.

תהודה פלסמונית פני השטח לחקר אינטראקציות ביומולקולריות באמצעות שבב חיישן

סרטון זה מדגים הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח כדי לזהות הפרשות חלבונים מתא יחיד. באמצעות מערך מיקרופלואידי ושבב ננו-מבנה פלסמוני הקשור לפפטידים, שינויים בעוצמת האור המוחזר בזווית התהודה חושפים אינטראקציות עם חלבונים המופרשים מתא יחיד.

הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח לאיתור הפרשות חלבונים מתא בודד

Biosensor אופטי ללא תווית לזיהוי חיידקים מהירים הוא הציג. Biosensor מבוסס על Si הנקבובי nanostructured, שנועד ללכוד באופן ישיר את תאי חיידקי היעד על פני השטח שלו. אנו משתמשים בנוגדנים חד שבטיים, משותקים על המתמר הנקבובי, כמו הבדיקות ללכוד. המחקרים שלנו מראים את הישימות של biosensors אלה לצורך זיהוי של ריכוזי חיידקים נמוכים תוך דקות ללא עיבוד לפני מדגם (כגון תמוגה תא).

זיהוי אופטי של א coli חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

מתוארת גישה חדשה לבניית לשון אלקטרונית (eT), המפשטת מאוד את התכנון והייצור של חומרי חישה, ומאפשרת ל-eT ליצור פרופילי אבולוציה רציפה ונופים עבור דגימות בנוזל. ה-eT המתקבל יעיל לניתוח חלבונים נפוץ כגון אפליה.

לשון אלקטרונית יצירת דפוסי הכרה רציפה לניתוח חלבון

משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

טרנסלוקציה של אפקטור לתאי מארח באמצעות מערכת הפרשה מסוג III היא אסטרטגיית אלימות נפוצה בקרב חיידקים גרם שליליים. יושם מבחן מבוסס היתוך אפקטור בטא-לקטמאז לניתוח כמותי של טרנסלוקציה. בתאים נגועים בירסיניה, ההמרה של מדווח FRET על ידי הבטא-לקטמאז מנוטרת באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

פינצטה פלזמונית משתמשת בתהודה פלזמונית מקומית על פני השטח בננו-מבני זהב כדי ללכוד ננו-חלקיקים בודדים, כולל חלבונים, בתוך שדה אופטי בקנה מידה ננומטרי. שינויים באות המפוזר חושפים נוכחות חלבון ודינמיקה קונפורמטיבית, ומאפשרים ניטור ללא שינויים בפלואורופור או קשירת פני השטח.

ניטור דינמיקת קונפורמציה של חלבונים בודדים לא מותאמים באמצעות פינצטה פלזמונית

אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

למדו לאתר ולכמת רעלנים בציטוזול תאי בעזרת תהודת פלזמון משטח. שיטה זו מאפשרת ניטור רגיש של כניסת רעלנים ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

גלה סרטונים נוספים