הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים את השימוש בטכנולוגיית image stream לכימות מנגנונים תאיים של תאי חיסון ראשוניים מקבוצות חולים מוגדרות היטב. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאי דם פריפריים חד-גרעיניים או pbmc מדגימות דם שנלקחו מחולים או ממתנדבים בריאים. לאחר הבידוד, התאים מופעלים ולאחר מכן מסומנים פלואורסצנטית.

בשלב הבא, התאים עוברים מיקוד הידרודינמי, עוררים באמצעות אור לייזר ומצולמים בשיטת time delay integration. מצלמת CCD. לבסוף, התמונות נרכשות באמצעות ה-image stream cytometer ומתבצעת כמותיות של NF kappa b.

ביצוע טרנסלוקציה בכל תמונה תאית נעשה באמצעות תוכנת ideas. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את ההבדלים בין כל קבוצת נבדקים באמצעות ניתוח של תרשימי פיזור (dot plots), היסטוגרמות ותמונות של תאים. היתרון של זרימת התמונות הוא השילוב בין עובדות לבין אימונופלואורסצנציה.

אנו יכולים לבחון מסלולי איתות תאיים באופן ספציפי לשושלת תאים, בין אם בתא בודד ובין אם באוכלוסייה, וזאת תוך התחלה עם מדגם דם קטן בלבד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח מדעיים באמצעות מיקום וכמתית של מתווכי איתות. לדוגמה, ניתן להשתמש בה כדי לחקור translocation גרעינית של גורמים שקופים המתווכת על ידי פעולה, או כדי לבחון את השפעות ההזדקנות על ביולוגיה של התא.

חוקר ראשון מהמעבדה שלי ידגים את הטכניקה לאחר בידוד תאים חד גרעיים של דם פריפרי (PBMCs) שהושגו ממתנדבים אנושיים. השהו מחדש את ה-p BMCs שהופקו בריכוז של 3×10⁶ תאים ל-0.6 milliliters של מצע, ולאחר מכן העבירו את תרחיף התאים למבחנות של 1.5 milliliter. לאחר מכן, גרו חלק מהתאים באמצעות חומר מפעיל כגון TLR8 LA R 8 4 8 המוצג כאן, ואז דגרו את כל התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 60 דקות באינקובטור עם 5% carbon dioxide.

לאחר תקופת הדגירה, יש להשקיע את התאים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-500 ×g בטמפרטורת החדר, להסיר את העלייה, ולסמן את התאים עם תערובת של נוגדנים פני השטח הספציפיים לשושלות של מונוציטים או DC למשך 20 דקות ב-4 °C, כולל מבחנות של תאים המסומנים בקונוגטים של צבע בודד שישמשו כביקורות פיצוי (compensation controls). לאחר מכן, יש לקבע את התאים ב-4% PFA ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה של התאים למשך 10 דקות ב-500 ×g בטמפרטורת החדר, יש לערבב מחדש את ה-pbmc בבפר קירור ולאחסן את התאים ב-80- °C עד ליום הניתוח של הבדיקה.

הפשיר את התאים במהירות באמבט מים של 37 °C, ולאחר סבב צנטריפוגה להסרת בופר ההקפאה, בצע פרמיאביליזציה באמצעות 100 µL של BD perm wash buffer. לאחר מכן, סמן את התאים באמצעות נוגדנים לרכיבי סיגנלינג תוך-תאיים, כגון נוגדי NF kappa BP 65 המוצגים כאן, למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השקעת התאים, השהה אותם מחדש ב-100 µL של BD perm wash buffer המכיל goat anti rabbit IgG.

Alexa 6 47 והדגרו את ה-pbmc למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. מיד לפני הדימוג, בצעו צביעה נגדית לתאים באמצעות צבע גרעיני; התחילו בהפעלת ה-image stream ולאחר מכן הפעילו את תוכנת ה-inspire. לאחר מכן, לחצו על load default template ובחרו ב-initialize fluidics.

לאחר מכן, לחצו על תפריט גלריית התמונות ובחרו ב-"בחר הכל" (select all). כעת לחצו על "הפעל הגדרה" (run set up) כדי להתחיל את הדמיית החרוצים, ולאחר מכן בחרו בערוץ השדה המואר (bright field channel). ברגע שחרוצי המהירות (speed beads) פועלים, לחצו על "הפעל הכל" (start all) תחת לשונית הסיוע (assist) כדי לכייל ולבדוק את המכשיר.

לאחר כיול מערכת ה-ImageStream, לחץ על flush, lock and load כדי להטעין את הדגימה הבהירה ביותר למכונה. לאחר מכן, הגדר את עוצמת הלייזר כך שכל florachrome יציג ערך פיקסל מקסימלי שבין 104,000 counts, כפי שנמדד ב-dot plots. לבסוף, הגדר את הקריטריונים לסיווג התאים.

כעת לחצו על run, acquire כדי לאסוף ולשמור את קובץ נתוני הניסוי. כדי לנתח את קובצי הנתונים, פתחו תחילה את תוכנת הניתוח. צרו קובצי תמונה מפוצים (compensated) ולאחר מכן בצעו gating לאירועים בעלי עוצמת צבע גרעיני נורמלית ויחס גובה-רוחב (aspect ratio) גבוה של הצבע הגרעיני. כדי להבדיל תאים בודדים ב-gate R1 משאריות (debris) או מאירועים רב-תאיים, מונוציטים נמצאים ב-gate של תאים חיוביים ל-CD14, בעוד שתאים דנדריטיים מיאלואידיים, המאופיינים בביטוי גבוה של CD11C וביטוי נמוך של CD4 וסמני lin1, נמצאים ב-gate R3.

לבסוף, השתמש בתוכנת ideas כדי לקבוע את הקולוקליזציה (colocalization) של גורם השעתוק הציטופלזמי NF kappa B עם הצבע הגרעיני. מתאם גבוה בין NF kappa B לצבע הגרעיני, המעיד על קולוקליזציה של שני הסמנים, בא לידי ביטוי בציון דמיון גבוה ומצביע על דרגת ההפעלה של התא. ניתן להשוות את אחוז אירועי הדמיון הגבוה בין קבוצות טיפול שונות או אוכלוסיות חולים כדי להעריך את היעילות התפקודית היחסית של התאים ב-idea.

ניתן להשתמש בתוכנה כדי להציג תמונות של תאים מפסקים מרכזיים של היסטוגרמות אוכלוסייה. ImageStream מאפשר ביצוע gating של תתי-אוכלוסיות תאים ישירות מ-pbmc ודימוי של תגובות תאים מאוכלוסיות תאים שעברו gating אך לא מיון. כאן, נמדדה בנקודת הבסיס השפעת סיגנל TLR על לוקליזציה גרעינית של NF kappa BP 65 ב-myeloid dcs שהם lin one, negative CD four, dim CD 11 C positive.

נצפה אחוז גבוה של תאים לא מעוררים שבהם גורם השעתוק NF kappa BP 65 נמצא בציטופלזמה. לאחר עיגור, נקבע כי לתאים המטופלים יש ציון דמיון גבוה משמעותית של NF Kappa BP 65 עם הצביעה הגרעינית PI, מה שמעיד על כך ש-NF Kappa BP 65 עבר לגרעין התא לאחר העיגור. תמונות דיגיטליות שנאספו בו-זמנית מאוכלוסיות תאים לא מטופלות ומאוכלוסיות תאים שעוררו באמצעות R 8 48 מראות תאים מייצגים ואת עוצמת ה-NF kappa B שעבר לגרעין התא. שימו לב לעוצמה הגבוהה יותר של צביעת NF Kappa B ו-PI בקבוצה שעוררה באמצעות R 8 48 בהשוואה לתאים הבלתי מטופלים.

השתמשנו בטכניקה זו על תאים מתורמים בגילאים שונים והראינו הבדלים במסלולי הפעלת NF kappa B המתווכים על ידי TLR. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך יום אחד, בתוספת זמן לניתוח תמונות, מה שמאפשר הן מספר תמונות לוקליזציה והן סטטיסטיקה של אוכלוסיית תאים. בנוסף, אנו יכולים לדגום תגובות ישירות ממספר אוכלוסיות תאים ללא הפרדה פיזית. ניתן להחיל את Image stream באופן נרחב על מספר מנגנונים תאיים, והיא צפויה להיות בעלת ערך רב במחקר תרגומי.