Name: דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: חקור דינמיקת חלבונים בנוירונים היפוקמפיים בתרבית באמצעות שחזור פלואורסצנציה אחרי הבהרה. שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של אירועי אקסוציטוזה בממברנה הפלזמטית וניתוח קינטיקת תנועת חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה על האמון Wellcome ו ERC עבור תמיכה כספית. IMGG הוא עמית EMBO. KLH הוא סטודנט BBSRC במימון PhD. אנו מודים פיליפ רובין ופטריק Tidball לתמיכה בתרבות טכנית תא וד&quot;ר אנדרו דוהרטי לצורך תחזוקה וסיוע מיקרוסקופים את.

<ol><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+green+outside%3A+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li>
<li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells%3A+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li>
<li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li>
<li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li>
<li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li>
<li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אנו מתארים אסטרטגיה חדשנית לחזות את מרכיבי סחר חלבון פלזמה הממברנה. גישה קומבינטורית של photobleaching טכניקות עם חלבון ספטמבר, מתויג מאפשרת סלקטיבי הכניסה פלזמה אירועים קרום להיות מוערך. לפי הרף photobleaching את החלבונים בממברנה של איגוף אזורים במהלך ההתאוששות, שיטת &quot;FRAP כפכפי&quot; מעריך את התרומה של סחר שלפוחי להחלמה פלואורסצנטי. זו גישה חדשנית מאפשרת הקלטה ישירה של החדרת חלבון ממברנה, המאפשרת גם את מספר תת תאים שבהם ההתאוששות הוא ציין לבין המשרעת של התאוששות (ΔF) במצב יציב שייקבע. יתר על כן, השוואה של FRAP עם ובלי פליפ מאפשר שיעור ההחלמה המיוחס דיפוזיה לרוחב להיות מחושב. יתר על כן, בניסוי עם זאת, אזורים של דנדריט לא photobleached בסמוך לאזורים photobleached משני צדי יכול להיותהערכה איכותית במהלך ההתאוששות, אובדן פלואורסצנציה נצפו באזורים אלה יהיו בשל פיזור רוחבי של קולטנים photobleached אל אלה שאינם photobleached חלקי דנדריט. פרוטוקול זה photobleaching סלקטיבי יכול להיות מנוצל כדי לבחון מגוון של תהליכי הסחר תאיים כגון אפיון excocytosis בקרום פלזמה ב subareas מוגדרים (למשל, דנדריטים או עמוד שדרה) או FRAP בהערכת התרומה של הכניסה דיפוזיה לרוחב לעומת ידי ביצוע FRAP במקביל ו &#39; כפכפי &#39;פרוטוקולים לאורך דנדריטים סמוכים (איור 3). ברור, בעוד הנחיות ספציפיות הוצגו, במעבדה כל אחד צריך לייעל את הפרמטרים הדמיה על פי דגימות וציוד ספציפיים. חשוב לציין, כל הקולטנים על פני השטח של ההחזר על ההשקעה צריך להיות photobleached, עצמאית של המטוס Z-ציר מרכזי, אך ללא נזק משמעותי phototoxic או לא ספציפית photobleaching. לנוERS יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ניסיון בפרוטוקול זה ב סומה את התא, כמו אחוז גבוה של תאים pH נמוך יחסית תאיים בדרך כלל התוצאות רקע הקרינה גבוהה באזורים אלו. יתר על כן, בעוד אנו הוכיחו עד כמה טכניקה זו ניתן ליישם משתנה דרכים, לפני תחילת הניסויים photobleaching סלקטיבי חדש ספטמבר, מתויג לבנות, אנו ממליצים כי האפיון הראשוני של קולטני מתוייגים מתנהל 1, כפי שתואר על ידי אשבי ואח&#39; 2. באופן כללי, שיטה זו היא עיבוד רב עוצמה ורב לפרוטוקול FRAP סטנדרטי, המאפשר אירועים הכניסה קרום הפלזמה לעבור הערכה בזמן אמת הקרוב.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; החברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגי</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות (לא חובה)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; זכוכית coverslips 24mm</td&gt;<td&gt; VWR הבינלאומי</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פולי-L-ליזין</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml במאגר borate כדי coverslips מעיל</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal בינוני</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% בציפוי העצבית והאכלה בינוני</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פניצילין סטרפטומיצין</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1% בציפוי העצבית והאכלה בינוני</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-גלוטמין</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2 מ&quot;מ / 0.8mM בציפוי / האכלה בינוני</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סוסים סרום</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% בתקשורת ציפוי נוירונים בלבד</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 שיבוט וקטור</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; לייצור וירוס Sindbis</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 confocal מערכת META</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תמונה J תוכנה</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; גישה פתוחה התוכנה. את כל התוספים המתוארות כאן זמינים<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

דיפוזיה exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה fluorescence מסופקים photobleaching

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

<p class="jove_content"&gt; חלבונים ממברנה כגון קולטנים ותעלות יונים עוברים סחר פעיל נוירונים, אשר מקוטב מאוד מורכבת מורפולוגית. זה סחר בבני מכוונת היא בעלת חשיבות ראשונה במעלה לספק, לשמור או להסיר חלבונים סינפטיים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; סופר האקליפטית pHluorin (ספטמבר) היא נגזרת של ה-pH רגיש eGFP, שבו נעשה שימוש נרחב הדמיה תא חי של חלבונים פלזמה הממברנה<sup&gt; 1-2</sup&gt;. ב-pH נמוך, protonation של ספטמבר מקטין קליטת פוטון ומונע פליטת הקרינה. כאירועים הסחר תאיים ביותר מתרחשים תאים עם pH נמוך, שבו ספטמבר הקרינה היא האפילה, את האות הקרינה מן בספט &#39;מתוייגים החלבונים הוא בעיקר מן הקרום פלזמה שבו ספטמבר חשוף לסביבה pH נייטרלי תאיים. כאשר האיר על ספטמבר בעוצמה גבוהה, כמו כל צבע פלואורסצנטי, הוא photodamaged באופן בלתי הפיך (photobleached)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. חשוב לציין, כי ה-pH נמוך מרווה את קליטת פוטון, רק פני השטח לידי ביטוי ספטמבר ניתן photobleached ואילו ספטמבר תאיים אינו מושפע תאורה בעוצמה גבוהה<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (שחזור הקרינה לאחר photobleaching) של החלבונים המתויגים בספט &#39;היא טכניקה נוח ורב עוצמה להערכת הדינמיקה חלבון על קרום הפלזמה. כאשר החלבונים המתויגים fluorescently הם photobleached באזור של עניין (ROI) התאוששות הקרינה מתרחשת עקב תנועה של חלבונים ספטמבר, מתוייגים מולבן לאזור מולבן. זה יכול להתרחש באמצעות דיפוזיה לרוחב ו / או exocytosis הלא photobleached קולטנים מסופק אם על ידי<em&gt; דה נובו</em&gt; סינתזה או מיחזור (ראה איור. 1). חלק קטן של החלבון נייח ונייד ניתן לקבוע את הניידות קינטיקה של חלקיק diffusible יכול להיחקר בתנאי הבסיס, מגורה כגון יישום אגוניסט או גירויים עצביים כגון הפעלת NMDA או KCl יישום<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אנחנו מתארים טכניקות photobleaching שנועדו סלקטיבי לדמיין את ההתאוששות של הקרינה המיוחס exocytosis. בקצרה, ההחזר על ההשקעה הוא photobleached פעם עם פרוטוקולים סטנדרטיים FRAP, ואחריו, אחרי התאוששות קצרה, חוזר על עצמו על ידי הלבנת האזורים משני צדי. פרוטוקול זה &quot;FRAP-פליפ&quot;, שפותחה במעבדה שלנו, נעשה שימוש כדי לאפיין סחר AMPA הקולטן על הקוצים הדנדריטים<sup&gt; 10</sup&gt;, והוא חל על מגוון רחב של מחקרים על מנת להעריך סחר סחר exocytosis תאיים ו.</p

דו&quot;ח זה מתאר את השימוש הדמיה תא חי וטכניקות photobleach לקבוע את הבעת פני, מסלולי תחבורה קינטיקה סחר exogenously GFP-מתוייגים הביע pH רגיש, חלבונים על הממברנה של נוירונים.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

חלבוני ממбраנה, כגון רצפטורים ותעלות יונים, עוברים תעתוע (trafficking) פעיל בנוירונים, שהם מקוטבים מאוד ומורכבים מבחינה מורפולוגית. זה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדמיות של השתבלבות חלבונים עצביים בממברנת הפלזמה. דבר זה מושג תחילה על ידי הדבקת נוירונים של היפוקמפוס בתרבית עם וירוס סינוס (sinus virus) כדי לבטא את החלבון הנחקר, המסומן ב-super ecliptic, Florin או sep. לאחר מכן, אזור עניין (ROI) עובר פוטו-بلیצ'ינג (photo bleaching).לאחר מכן, מקטעים סמוכים עוברים הבהרה פוטוכימית (photo bleaching) חוזרת, בעוד שהאזור המקורי הנבחר (region of interest) מורשה להתאושש פלואורסצנטית. לבסוף, מנותחת התאוששות הפלואורסצנציה באזור הנבחר. בסופו של דבר, התאמה זו לניסויי frap קונבנציונליים משמשת להצגת דפוס אירועי האקסוציטוזה של חלבון המטרה בממברנת הפלזמה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביו-טונינג של פני השטח (surface bio tonation) או הזנה בנוגדנים, הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה של הדינמיקה של אירועי השחלה לממברנה. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנושא תעתוע חלבונים, ובמיוחד היכן וכיצד מתרחשים אירועי אקסוציטוזה. הרעיון לשיטה זו עלה במוחי כאשר חיפשתי חלופה להזנה בנוגדנים כדי להיות מסוגל לחקור אירועי אקסוציטוזה בקוצים (spines) בניסויי תאים חיים. ראשית, יש לתרבית נוירונים מהיפוקמפוס בצפיפות גבוהה מגורים מהיום העוברי ה-18, על לוחות זכוכית מצופים ב-poly-L-lysine למשך 14 עד 25 ימים במעבדה (in vitro), 6 עד 24 שעות לפני הניסוי בתאים חיים.בצע טרנסדוקציה לתאים באמצעות נגיף סימביס המקודד לחלבון הממברנה הרלוונטי, המסומן ב-SUP ecliptic fluorine osep. הוסף את הפסאודו-וירִיון, המכיל מצע, ישירות אל לביבת הזכוכית (cover slip) המכילה 1 ml של מצע מותנה, והחזר את התאים לאינקובטור התרביות. לצורך דימוי התאים, הפעל מיקרוסקופ קונפוקאלי zes axia vert LSM five 10 meta עם פלט לייזר של 100% למשך 20 דקות לפחות לפני הדימוי.כדי למזער תנודות במתח החשמלי במהלך ההדמיה ולחמם מראש את הבמה. כאשר המיקרוסקופ מוכן, בחרו בעדשה פי 63, לאחר מכן העבירו את כיסוי הזכוכית לתא ההדמיה, והחליפו באופן מיידי את מצע התרבית. עם תמיסה לרישום חוץ-תאי שחוממה מראש.הניחו את התא על במיסגרת המיקרוסקופ שחוממה מראש. ההיבט המאתגר ביותר של הליך זה הוא הבטחת בריאות התאים כך שלא תיפגע במהלך תהליך ההקלטה. מכיוון שפרוטוקול זה דורש הבהרה פוטוכימית (photo bleaching) נרחבת כדי להבטיח הצלחה, ודאו שכל פרמטרי הדימוג אופטימליים לפני תחילת ניסויים בהיקף רחב, והעדיפו רכישה מהירה של נתונים על פני איכות תמונה גבוהה.כדי להגדיר את פרמטרי לכידת הדימות, זהו נוירון המבטא חלבון רקומביננטי רצוי, והבאו אותו למשקוף (focus). סרקו את התא כולו באמצעות לייזר 488 nanometer בעוצמה נמוכה, כדי למזער פוטו-בליצ'ינג (photobleaching).השתמשו במהירות נומינלית גבוהה וברזולוציית פיקסלים נמוכה, תוך שמירה על מהירות סריקה כוללת של פחות משנייה אחת. בחרו חלק מהדנדריט להדמיה והשתמשו בזום אופטי של 1.5 עד 2.5.צלם פריים המכיל את אזור העניין כדי לקבוע אם מתרחש הבהרה פוטוכימית (photo bleaching) לא ספציפית. השתדל לוודא ששדה הראייה מכיל מספר שלבנים (processes) כך שניתן יהיה להפיק מדידות מדנדריטים של ייחוס. באמצעות פלטת מחוון טווח, כוון את פרמטרי הדמיון כדי לאפשר פלואורסצנציה מקסימלית מעוררות לייזר מינימלית, אך עם רוויה מוגבלת.מומלץ להשתמש בקוטר חור סיכה (pinhole) גדול כדי למקסם את איסוף הפוטונים. הגבר הגילוי (detector gain) צריך להיות חזק מספיק כדי לזהות עליות פלואורסצנציה קטנות, כך שהתמונות הראשונות ממש לפני הפוטובליצ'ינג (photobleaching) לא יעברו את 10% מהפיקסלים הרוויים. כוון את המיקוד כדי להבטיח הגעה למישור המוקד המרכזי.לאחר הגדרת התצורה, שמרו אותה לשימוש בשלבי ההתאוששות שלפני ואחרי הניסוי. לאחר מכן, הגדירו את אזורי ה-photo bleach. בצעו זאת על ידי בחירת אזור עניין (ROI) עבור ה-photo bleach הראשוני ואזורים צדדיים עבור שלב ה-photobleaching החזרתי העוקב.עבור הפיטובלייץ' (photo bleach) הראשוני, both תחומי העניין (ROIs) המרכזיים והצדדיים יעברו פיטובלייץ'. לעומת זאת, עבור הפיטובלייץ' החוזר, ייבחרו רק תחומי העניין הצדדיים. ודאו שהאזורים הצדדיים רחבים מספיק כדי למנוע התאוששות באמצעות דיפוזיה בין הסריקות.כווננו את פרמטרי ההלבנה עבור שני ה-ROIs להלבנה פוטוכימית (photobleach). ההלבנה הראשונית צריכה להיות מהירה ולדרוש בין אחת לחמש חזרות, בהתאם לזום האופטי ולנפח ה-ROI. עבור האזורים השוליים, יש לכוון את עירור הלייזר כדי להבטיח הלבנה פוטוכימית רציפה, אך ללא נזק פוטוטוקסי. לאחר הגדרת הפרמטרים, בצעו ניסוי FRA flip כרצף תמונות time-lapse עם זמן משתנה, על ידי רכישת שלוש עד 10 תמונות בסיס (preble baseline) בהספק לייזר נמוך וללא השהיית זמן.בשלב הבא, בצעו פוטובליצ'ינג (photobleaching) של ה-ROI המרכזי בעוצמת לייזר מלאה למשך אחת עד חמש חזרות. לאחר מכן, רכשו שלוש עד 10 תמונות התאוששות לאחר הבליצ'ינג. בצעו פוטובליצ'ינג חוזר של האזורים השכנים בעוצמת לייזר בינונית, עם לכידת תמונות במרווחי זמן טיפוסיים של אחת עד חמש שניות, בהתאם לקצב ההתאוששות של החלבון הנחקר.לבסוף, כדי להשקיט את הפלואורסצנציה, החליפו את תמיסת ההקלטה החוץ-תאית בתמיסת הקלטה עם בופר ב-pH 6, או כדי לחשוף את החלבון במאגרים תוך-תאיים ב-pH נמוך, השתמשו בבופר המועשר ב-50 millimolar ammonium chloride. אספו לפחות 10 עד 20 סדרות נתונים עבור כל חלבון רקומביננטי כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי ולמנוע תוצאות מוטות, והבטיחו שתנאי הדימוג נשמרים לאורך כל החזרות. כדי לנתח את התמונות, פתחו אותן.באמצעות תוכנת Image J, יישרו את הערימות (stacks) כדי לפצות על תנודות קטנות במישור XY שעשויות היו להתרחש לאורך סדרת הזמנים. עבור תמונות שצולמו במיקרוסקופ confocal של zeiss, השתמשו בתוסף stack reg, והשתמשו בתוסף LSM toolbox כדי להפיק את ערכי הזמן כקובץ טקסט; ייבאו ערכים אלו לגיליון ניתוח נתונים לצורך מדידת תנודות הפלואורסצנציה. במהלך ניסוי FRA flip, חלקו את מקטע ההלבנה הפוטוכימית (photo bleach) לאזורי פיקסלים בודדים באמצעות כלי ניתוח ה-ROI manager של התמונה לבחירת מספר ROIs.בשלב הבא, השתמש בפקודת plot Z axis profile כדי למדוד את הממוצע של הפלואורסצנציה לכל פיקסל בכל נקודת זמן. חזור על התהליך כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של אזור רקע שאינו פלואורסצנטי. נרמל את עוצמת הפלואורסצנציה בכל נקודת זמן על ידי חיסור ערכי הרקע כדי להסיר רעש ניסויי, וחלק את כל הערכים במדידת קו הבסיס הממוצעת לפני ההלבנה או בערך המיידי לאחר ההלבנה.בחן את עקומת ההתאוששות עבור כל ROI ששורטטה אל מול הזמן כדי לחשב אם התרחשה התאוששות משמעותית. עבור ROI, חשב את delta F על ידי חיסור הממוצע של חמש עד 10 המדידות הראשונות של רצף ההתאוששות מהפוטובליץ' (photobleach recovery) מהממוצע של חמש עד 10 המדידות האחרונות. לאחר מכן, קבע את המובהקות הסטטיסטית של ה-delta F ואפיין את ה-ROIs שהתאוששו ואת אלו שלא, כדי להעריך את דפוס האקסוציטוזה.אלו הן נקודות חמות של אקסוציטוזה, או התאוששות של קוץ לעומת גזע. סרטון זה מציג תוצאה מייצגת של ניסוי frap flip טיפוסי באמצעות דבק SERP. שני.אזור של דנדריט עובר פוטו-bleaching חד-פעמי, ולאחריו תקופת התאוששות של דקה אחת. לאחר מכן מתחיל פוטו-bleaching חוזר של האזורים הצמודים, כפי שמוצג על ידי החיצים הכחולים. החיץ האדום מדגיש אזור עניין קטן שבו נצפה התאוששות של פלואורסצנציה, המוצגת בהגדלה בפאנל הימני של המסך.ההתאוששות מנוטרת בגרף להלן, כאשר עלייה כללית בפלואורסצנציה מסומנת כ-delta F. ניתן לייחס את העלייה בפלואורסצנציה שנצפתה ברצף זה להחדרה של glue A two לתוך הגזע הדנדריטי. השינויים הגדולים בעוצמת הפלואורסצנציה בסוף הניסוי מראים את ההשפעה של ה-pH הנמוך ושל השטיפות ב-pH 7.4 בתוספת ammonium chloride על אות הפלואורסצנציה של ה-sep. בדוגמה זו, הנוירונים הוחדרו ב-SEP glue K two.כאן, ROI גדול עם מספר דנדריטים בשדה הראייה עבר פוטובליצ'ינג, ולאחריו פוטובליצ'ינג חוזר וסלקטיבי של דנדריט אחד בלבד. נוירונים אלו טופלו ב-cyclo heide למשך שעתיים לפני הדימות כדי לחסום את סינתזת החלבונים. כתוצאה מכך, התאוששות הפלואורסצנציה ב-ROIs הנמדדים חושפת את שיעור ההתאוששות הנובע מדיפוזיה לטרלית וממיחזור בדנדריט ה-frap הסטנדרטי, לעומת מיחזור בלבד בדנדריטים שהוכפפו לפרוטוקול frap flip.על ידי השוואת ערכי ה-delta F מעקומות ההתאוששות של frap לעומת frap flip, ניתן להסיק את התרומות היחסיות של מיחזור לעומת דיפוזיה לטראלית, וזאת בשל עיכוב של סינתזת חלבונים. ההתאוששות מראה ירידה עוקבת בעוצמת האות ככל שמאגר הרצפטורים הזמין מתדלדל. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להקים, לבצע ולנתח ניסויי דימוי מוצלחים בנוירונים.באמצעות שילוב זה של טכניקות פוטובליצ'ינג (photobleaching), ניתן לבחון ראיות להחדרה לממברנה של החלבון הנחקר.

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית ​​יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית ​​שכותרתו עם צבע אדום ניאון FM 4-64 למדוד את קצב שחרור שלפוחית ​​presynaptic בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

FRAP נעשה שימוש כדי לכמת את הניידות של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתויג חלבונים בתאים בתרבית. בדקנו את השברים הנייד / נייח של ה-GFP על ידי ניתוח שחזור אחוז הקרינה לאחר photobleaching. במחקר זה, FRAP בוצעה על עמוד השדרה של נוירונים בהיפוקמפוס.

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

מחקרים עדכניים רבים זיהו מוטציות חלבונים סינפטיים הקשורים פתולוגיות במוח. ראשי נוירונים בקליפת המוח בתרבית להציע גמישות רבה לבחון את ההשפעות של מחלות אלה הקשורים חלבונים על מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

חקור דינמיקת חלבונים בנוירונים היפוקמפיים בתרבית באמצעות שחזור פלואורסצנציה אחרי הבהרה. שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של אירועי אקסוציטוזה בממברנה הפלזמטית וניתוח קינטיקת תנועת חלבונים.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching (וידאו) | JoVE Journal

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

גלה סרטונים נוספים