TransFLP - שיטה גנטית לשינוי

מטרת פרוצדורה זו היא לבצע מניפולציה גנטית ל-vio cray באמצעות שיטה מהירה וחסרה זו, המבוססת על טרנספורמציה טבעית ושילוב flip. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מקור קיטין מתאים, מאחר שקיטין הוא המשרה הטבעי של הטרנספורמציה. בשלב השני, נוצר מבנה DNA באמצעות שני סבבים של PCR ומבוצעת טרנספורמציה טבעית שלהם, המאפשרת לחיידקים המכילים את הפלסמיד PBR flip לקלוט את מקטע ה-PCR ולהטמיע אותו בגנומים שלהם.

בשלב הבא, נעשה שימוש בהעלאת טמפרטורה כדי להשרות את ייצור אנזים הליפאז המקודד בפלסמיד, לצורך הסרת קסטטת העמידות לאנטיביוטיקה המוקפת על ידי אתר מטרה לרקומינציית flip (אתר FRT). בשלב הסופי, החיידקים מנקים את הפלסמיד המקודד ל-FLP. לבסוף, נעשה שימוש ב-PCR ובריצוף כדי להוכיח כי המניפולציה הגנטית הצליחה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בפלסמידי התאבדות (suicide plasmids) למניפולציה גנטית של vire, הוא ששיטה זו מהירה ויעילה מאוד. התחילו בשקילה של דגימות של 50 עד 80 mg של פתיתי קיטין בשפרויות פלסטיק סטנדרטיות בנפח 1.5 mL; לאחר מכן, כאשר מכסי השפרויות פתוחים, עקרו את הפתיתים באוטוקלאב. מיד עם סיום פעולת האוטוקלאב, סגרו את המכסים ואחסנו את ערכת פתיתי הקיטין העקוריים בטמפרטורת החדר. נדרשים לפחות שישה אוליגוניוקלאוטידים כדי להגביר באמצעות PCR את אזורי ה-DNA הרלוונטיים, וכן את קסטת האנטיביוטיקה המוקפת ב-FRT. מומלץ בנוסף לכלול זוג פריימרים אוליגוניוקלאוטידיים מחוץ למקטע ה-PCR שהוחדר.

דבר זה מאפשר בדיקה של האינטגרציה והחיתוך הנכון של קסטת העמידות לאנטיביוטיקה המוקפת באתרים FRT, תוך שימוש בזהירות באוליגונוקלאוטידים מספר שתיים, שלוש, ארבע וחמש. פריימרים 2 ו-5 צריכים להכיל לפחות 28 זוגות בסיסים כדי שיוכלו להתרחב (anneal) באופן מספיק ל-DNA הגנומי, ואילו פריימרים 3 ו-4 צריכים להיות מתוכננים באמצעות פלסמיד המכיל את אתר ה-FRT כתבנית. תכננו את פריימרים 2 ו-5 כך שיאפשרו צימוד בסיסים משלים נרחב בקצה ה-5' בין פריימרים 2 ו-3 ובין פריימרים 4 ו-5, בהתאמה.

כעת, עבור סבב ה-PCR הראשון, השתמשו באוליגונוקלאוטידים one ו-two כדי להכין את הראשונה מבין שלוש תגובות PCR סימולטניות אך בלתי תלויות, להגברה של האזור שמעלה (upstream) של אזור העניין הניסויי בבנייה המעוצבת באופן מותאם אישית. במקביל, הכינו את תגובת ה-PCR השנייה באמצעות אוליגונוקלאוטידים three ו-four כדי להגביר את קסטת האנטיביוטיקה המוקפת ב-FRT. לדוגמה, בניסוי זה, נעשה שימוש בגן A PH המקודד לעמידות לקנין.

במקביל, הגבירו את אזור ה-DNA במורד הזרם על ידי הכנת תגובת PCR שלישית באמצעות אוליגנוקלאוטידים חמש ושש ו-DNA גנומי כתבנית. לאחר מכן, התחילו את תגובת ה-PCR עבור כל שלושת הדגימות; לאחר טיהור של כל שלושת מקטעי ה-PCR, השתמשו בתערובת המכילה כמויות שוות של כל שלושת המקטעים שהתקבלו בסבב הראשון כתבנית לביצוע סבב שני של PCR. הגברה זו תהיה מזורזת על ידי אוליגנוקלאוטידים אחת ושש.

מקטע ה-PCR שהתקבל ישמש כ-DNA למעבר גנים (transforming DNA) בניסויי הטרנספורמציה הטבעית. לאחר גידול של תאי v cholera במצע מועשר אירובי ב-30 °C, יש לקצור את החיידקים באמצעות סרכזפוגה בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, העבירו את תרבית החיידקים אל ה-kite in flakes והדגירו את תרחיף התאים למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C. לאחר מכן, ערבבו בזהירות לפחות 200 ng של מקטעים שהופקו מ-PCR של סבב שני לתוך תרחיף תאי החיידקים. תוך הקפדה שלא לנתק את החיידקים באופן נרחב ממשטחי הקיטין, הדגירו תמיסה זו בטמפרטורה של 30 °C ללא תנועה למשך יום נוסף.

כעת יש לערבב את התרבית במערבל (vortex) בעוצמה למשך 30 שניות לפחות. עבור חיידקים הנושאים את פלסמיד ה-PBR flip, יש לפרוס 100 עד 300 µL של תמיסת התאים על פלטות ברירה כפולה המכילות ampicillin בנוסף לאנטיביוטיקה השנייה שבפלטות. דגרו את תרביות התאים החיידקיים בטמפרטורה של 30 °C עד להופעת מושבות. לאחר מכן, בודדו את הטרנספורמנטים הבודדים מפלטות הברירה.

התחילו שלב זה על ידי גידול החיידקים על מצעי LB agar המכילים ampicillin בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 עד 24 שעות. כשלב אופציונלי, שנו את הטמפרטורה ל-40 °C למשך שעתיים עד שלוש, שכן הביטוי של flip מתוך פלסמיד PBR flip משתחרר מעכבה בטמפרטורות גבוהות יותר. לאחר שמונה שעות נוספות של דגירה ב-37 °C, העבירו את החיידקים למצעים טריים.

כעת הגבילו את השכפולים במקביל על צלחות אגר המכילות אנטיביוטיקה ועל צלחות אגר ללא אנטיביוטיקה כדי לבחון רגישות לאנטיביוטיקה, ולאחר מכן בודדו מושבה בודדת רגישה לאנטיביוטיקה מהתוצאה. התחילו שלב זה על ידי גידול התרבית למשך לילה בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 30 °C, במצע העשרה ללא אנטיביוטיקה. למחרת בבוקר, גדלו תרבית חדשה למשך שלוש עד שש שעות על ידי דילול התרבית מהלילה ביחס של 1:100 במצע טרי ללא אנטיביוטיקה. בשעות אחר הצהריים, זרעו או פזרו את הדילול של התרבית על צלחות LB אגר רגילות, ולאחר מכן דגרו את הצלחות למשך 8 עד 16 שעות נוספות בטמפרטורה של 30 °C עד להופעת המושבות.

בניסוי ראשון זה, שמטרתו הייתה למחוק את הגנים השכנים CTXA ו-CTXB, נוצרו האוליגונוקלאוטידים עבור שיטת ה-trans flip כפי שהודגם זה עתה. נבדק הגנוטיפ של זן ההורה, הזן הביניים הנושא את קסטת העמידות לאנטיביוטיקה המוקפת על ידי אתרי FRT במקום הלוקוס המקורי של ה-DNA של C-T-X-A-B, והזן הסופי שבו נמחקו C-T-X-A-B והוסרה קסטת העמידות. לצורך ניסוי זה בוצע PCR כולל באמצעות פריימרים שלא נבטחו למקטע ה-PCR של הטרנספורמציה, אלא רק ל-DNA הכרומוזומלי. מקטעי ה-PCR הופרדו באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל אגרוז כדי לקבוע את גודלם.

בנתיב אחד, זן הכולרה מסוג B מהעולם מוקם בגודל הפסגות הצפוי של 3, 143 base pairs. בנתיב שתיים, מקטע ה-PCR שהופק מזן delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT מוקם ב-3, 162 base pairs.

ובנתיב שלושה, פרגמנט ה-delta ctx A B FFR TP CR נמצא ב-1,769 base pairs בהשוואה לסולם ה-1 KB. בדוגמה השנייה שבה הוסר אי genomic island שלם, נבחר Vibrio Pathogenicity island one או VPI one כמטרה לניסוי זה. שיטת ה-trans flip שונתה בשני שלבים.

ראשית, האינטגרציה של הגן לעמידות לקנמיצין בוצעה באמצעות אתר FRT יחיד בתחילת PI 1. לאחר מכן בוצע סבב שני של טרנספורמציה טבעית, שאפשר את הכנסת סמן עמידות לאנטיביוטיקה נוסף, דהיינו עמידות לגנטמיצין, ואחריו אתר FRT שני בסוף האי של הפתוגניות. זוגות הפריימרים המתאימים מצוינים מעל לכל תמונת ג'ל, ושיטת ה-trans FLP המשיכה כפי שהודגם זה עתה.

הזנים ההוריים, הביניים והסופיים אומתו כולם באמצעות PCR של ה-DNA הגנומי המטוהר במסלול אחד. מקטע ה-PCR של זן ה-V cholera מסוג הטיפוס הורץ במסלול שתיים. מקטע ה-PCR שהתקבל מזן VPI one FRT can GM FRT הורץ.

ובנתיב שלוש, נותח תוצר PCR שהופק מזן delta VPI one FRT. זוגות הפריימרים מצוינים מעל כל תמונת ג'ל. בשבט הסופי חסר ה-VPI one כולו.

בדוגמה שלישית זו, רצף פרומוטור תלוי T7 RNA polymerase שולב במעלה הזרם של הגן Tfox, רגולטור מרכזי של טרנספורמציה טבעית, באמצעות שיטת trans flip עם שינוי קל מהפרוטוקול הסטנדרטי. רצף הקונסנזוס של הפרומוטור התלוי ב-T7 RNA polymerase נכלל כבליטות (overhangs) באוליגונוקלאוטידים מספר 4 ומספר 5, כך שרצף DNA זה נשמר בתוך הכרומוזום. גם לאחר שהוצאה קסרת העמידות לאנטיביוטיקה, השולב הוטמע לאחר מכן במאֱמב V colorized המכיל T7 RNA polymerase.

בזן זה, הביטוי של הגן של T7 RNA polymerase הונע על ידי הקידום LAC UV5 כדי לבחון את הביטוי של T-Fox התלוי ב-T7 RNA polymerase. בדיקות טרנספורמציה טבעית בוצעו במצע LB. הזן ההורה, שחסר את הקידום התלוי ב-T7 לפני הגן T-Fox, אינו ניתן לטרנספורמציה טבעית בתנאים אלו בשל היעדר תמלול של T-Fox במצע עשיר ובהיעדרו של המשרה הטבעי שלו, קיטין. פנוטיפ זה היה בלתי תלוי בשאלה אם T7 RNA polymerase השרה באופן מלאכותי על ידי IPTG או לא.

עם זאת, זן ה-trans flip שהופק, המכיל את הפרומוטור התלוי ב-T7 RNA polymerase במעלה הזרם של הגן למסוגלות T Fox, היה אכן בעל יכולת טרנספורמציה טבעית במצע מועשר עקב דליפה של פרומוטור ה-LAC UV five במצע LB. T7 RNA polymerase שהופק ביצע שעתוק של T FOX מהפרומוטור התלוי ב-T7 RNA polymerase ללא אינדוקציה על ידי IPTG. תהליך זה הניע מסוגלות טבעית וטרנספורמציה, ובכך אישר את התפקוד של רצף הפרומוטור התלוי ב-T7 RNA polymerase שהוטמע.

פנוטיפ זה הוגבר באופן משמעותי על ידי השראה מלאה של T7 RNA polymerase כתוצאה מהוספה של IPTG, המשרה של קידומת ה-lac UV5. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע מניפולציה גנטית של V. cholerae באמצעות שילוב של טרנספורמציה טבעית מושראת על ידי קיטין ורקומבינציית flip. לאחר השליטה בטכניקה זו, תוכלו למחוק גנים או איים גנומיים, וכן להטמיע רצפי DNA באופן מכוון לאתר ספציפי בתוך מספר ימים בלבד.