Name: TransFLP - שיטה גנטית לשינוי Vibrio cholerae בהתבסס על שינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: למד שיטה מהירה להנדסה גנטית של Vibrio cholerae באמצעות טרנספורמציה טבעית ו-FLP-רקומבינציה. השיטה מאפשרת מחיקת גנים ושילוב רצפים ביעילות גבוהה לחקר פונקציות גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוני להודות אולגה דה סוזה סילבה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע שויצרי (SNSF) גרנט 31003A_127029.

שיטת TransFLP (איור 1) באה לידי ביטוי בשלוש גישות שונות: אני) את המחיקה של שני גנים סמוכים מקודדים גורמים ארסיים של V. cholerae (למשל, ΔctxAB); השני) הסרת אי פתוגניות (למשל, ΔVPI-1), ושלישי) שילוב של רצף T7 RNA פולימראז תלוי מקדם מכירות במעלה זרם של גנים של אינטרס, אשר לאחר מכן מאפשר לו ביטוי מלאכותי ברקע המתח המתאים (למשל, T7-tfoX) (איור 2). 1. הכנת פתיתי כיטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50-80 מ&quot;ג המשקל של פתיתי כיטין בצינור פלסטיק סטנדרטי 1.5 מ&quot;ל. זה יכול להיות מוכן בכמויות גדולות. פתיתי כיטין זמינות מסחרי מסיגמא (מספר קט C9213). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי את הפתיתים שומרות את המכסים של הצינורות פתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לסגור את המכסים לאחר החיטוי התקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות autoclaved פתיתי כיטיןבטמפרטורת חדר. </li></ol> 2. אופציונלי: שינוי מלאכותי של ו &#39; cholerae עם FLP recombinase קידוד פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן electrocompetent V. תאי cholerae באמצעות שיטות סטנדרטיות 11. אחסן aliquots של תאים מוסמכים ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1-2 μl של מיני הכנה רגילה של פלסמיד PBR-FLP 5 עד electrocompetent V. תאים וcholerae להעביר את התערובת לתוך electroporation קובט (0.2 רוחב פער סנטימטרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל דופק ב1.6 קילו וולט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.9 מיליליטר מדיום SOC, בעדינות להעביר לתא צינור מ&quot;ל סטנדרטי 14. דגירה הלא מרגשת עבור 2.5-3 שעות ליום 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl פלייט ו300 μl על צלחות המכילות LB 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל אמפיצילין ולדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר שיבוט אחת וחנות כמניית גליצרול לניסויי TransFLP עתידיים. </li></ol> 3. עיצוב oligonucleotide ושרשרת פולימראז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות שישה oligonucleotides נדרש להגביר אזור הדנ&quot;א (הים) של עניין, כמו גם FRT-המוקף קלטת האנטיביוטיקה באמצעות PCR (איור 3). מומלץ לכלול גם זוג יחול oligonucleotides מחוץ לבר PCR המוכנס. זה מאפשר את הבדיקה לשילוב וכריתה נכונה של קלטת עמידות לאנטיביוטיקת FRT מוקף-(לדוגמה מתוארת כפריימרים &#39;CHK מטה&#39; למעלה CHK &#39;ובתרשימי 3 עד 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצב את oligonucleotides # 2, # 3, # 4, ו# 5 עם טיפול. הם צריכים להיות מסוגלים מספיק כדי לחשל (למשל ~ 28 נ&quot;ב) ל-DNA התבנית. ה-DNA היא תבנית הדנ&quot;א הגנומי (gDNA) לפריימרים # 2 ו # 5 וFRT קאן-FRT המכיל DNA פלסמיד כגון pROD17 12 ו PBR-FRT קאן-FRT (מחקר זה) לפריימרים # 3 ו # 4 ( איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצב את פריימרים # 2 # 5 מאפשרים לבסיס שיוך נרחב בקצה 5&#39;בין # 2 / # 3 ו # 4 / # 5, בהתאמה (האיור 3A </stronז&gt; הבלעה). שני סבבים של PCR לעקוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 תגובות עצמאיות PCR כמו סיבוב 1 st של ה-PCR. הראשון יהיה להגביר את האזור במעלה הזרם של הגן / DNA-אזור של אינטרס בסיוע oligonucleotides # 1 ומס &#39;2. PCR צריך לגרום שבר של לפחות 500 נ&quot;ב באורך המאפשרים הומולוגי רקומבינציה בתוך התאים. ברים קצרים יותר (~ 250 נ&quot;ב) יכולים להיות 8 מספיק אבל לא מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל לבצע PCR השני, אשר מגביר את קלטת אנטיביוטיקת FRT המוקף-. לדוגמות שניתן כאן אנחנו בעיקר משמשים APH (קאן R). oligonucleotides שימוש # 3 ומס &#39;4 לתגובה זו (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, מגביר את אזור מורד DNA באמצעות PCR (מדגם שלישי). בר PCR צריך להיות גם לפחות 500 נ&quot;ב באורך. לבצע PCR עם gDNA כתבנית וoligonucleotides # ​​5 ו # 6 (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיהור של כל השלושה PCRברים, לבצע סיבוב 2 nd של ה-PCR. השתמש בתערובת שווה של כל שלושת שהברים שהושגו בסיבוב הראשון כתבנית. ההגברה מזורזת על ידי oligonucleotides # 1 # 6. בר PCR שהתקבל (איור 3 ב &#39;) משמש כהפיכת ה-DNA בניסוי השינוי הטבעי (איור 1). </li></ol> 4. שינוי טבעי כיטין מושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול V. תאי cholerae האירובי במדיום עשיר ב30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים צפיפות אופטית ב 600 ננומטר של כ -0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את החיידקים על ידי צנטריפוגה. שטוף את הכדור פעם אחת במצע מלאכותי מוגדר (6 DASW) לפני resuspending התאים ב2 כרכים של DASW. הוסף 1 מ&quot;ל של תרבות ל50-80 מ&quot;ג פתיתי כיטין סטרילי (הסביר בנקודת 1). אם חיידקי הנמל פלסמיד PBR-FLP (נקודה 2 אופציונליים), תוספת אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתרבות. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות ללא תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף &amp; Gדואר; 200 ננוגרם של 2 nd הבר בסיבוב PCR-derived (הסביר בנקודה 3). מערבב בזהירות בלי להרים את החיידקים בהרחבה ממשטחי כיטין. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ללא תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת התרבות נרחבת ל≥ 30 שניות. מורח 100-300 μl על צלחות בינוניות LB סלקטיבית (צלחות LB גנטמיצין המכיל למשל kanamycin או לדוגמאות המסופקות כאן). השתמש בצלחות כפולות סלקטיבית אם חיידק נמל PBR-FLP פלסמיד ידי הוספת אמפיצילין במקביל לאנטיביוטיקה האחרת. דגירת צלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות או עד מושבות גלויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד transformants הבודד מצלחות סלקטיבית. transformants כאלה החליף את לוקוס הכרומוזומים המקורי על ידי בר PCR בשל אירוע מוצלב כפול. זנים אלה יכולים לשמש ישירות לניסויים נוספים במקרה של הסרת קלטת האנטיביוטיקה אינה הכרחית. </li></ol> 5. הסרת קלטת סלקטיבי (הים) על ידי FLP-רקומבינציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאכותי להפוך transformants עם PBR-FLP פלסמיד כאמור בשלב 2, אם לא עשה לפני assay השינוי הטבעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את החיידקים על צלחות אגרו LB המכילים אמפיצילין על 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות. אפשרויות: לשנות את הטמפרטורה בין 2-3 שעות לעד 40 מעלות צלזיוס כביטוי של FLP מפלסמיד PBR-FLP הוא דה מודחקת-5,10 בטמפרטורות הגבוהה; חיידקי העברה לצלחות רעננים אחרי כ. 8 שעות של דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן לרגישות לאנטיביוטיקה (הדגים כאן לkanamycin; איור 1) על ידי restreaking את השיבוטים במקביל על צלחות אגרו המכילות אנטיביוטיקה ואנטיביוטיקה חופשיות. מבודד מושבות רגישות בודדות. הקפא שיבוט אמפיצילין עמיד כמניית גליצרול אם אתה מתכוון לשנות את המאמץ במחיקה / הכנסה באמצעות TransFLP אחרות נוסף. </li></ol> 6. אשפרה פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות לילה בתנאים אירוביים ויום 30 ° C. השתמש במדיום עשיר ללא תוספת של כל אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: לגדול תרבות טריה עבור 3-6 שעות על ידי דילול 1:100 תרבות הלילה במדיום טרי אנטיביוטיקה חופשיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול צלחת או פס (הים) של תרבות על צלחת אגר LB הרגילה (הים) ו דגירה של 30 ° C עבור 8-16 שעות (עד מושבות גלויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן לאמפיצילין רגישות של השיבוטים ידי restreaking את השיבוטים במקביל על צלחות אגרו המכילות אנטיביוטיקה ואנטיביוטיקה חופשיות (איור 1). הקפא מתח אמפיצילין רגיש כמניית גליצרול. </li></ol>

<ol><li>Miller, V. L., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+suicide+vector+and+its+use+in+construction+of+insertion+mutations%3A+osmoregulation+of+outer+membrane+proteins+and+virulence+determinants+in+Vibrio+cholerae+requires+toxR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR.</a> J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).</li>
<li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).</li>
<li>Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+disrupting+genes+in+the+Escherichia+coli+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).</li>
<li>Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+eae+deletion+mutant+of+enteropathogenic+Escherichia+coli+by+using+a+positive-selection+suicide+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector.</a> Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).</li>
<li>De Souza Silva, O., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Vibrio+cholerae+by+combining+natural+transformation+with+FLP+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination.</a> Plasmid. 64, 186-195 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310, 1824-1827 (2005).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).</li>
<li>Marvig, R. L., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+cholerae+as+a+tool-optimizing+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure.</a> BMC Microbiol. 10, 155(2010).</li>
<li>Blokesch, M., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serogroup+Conversion+of+Vibrio+cholerae+in+Aquatic+Reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs.</a> PLoS Pathog. 3, e81(2007).</li>
<li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+in+Escherichia+coli%3A+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158, 9-14 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: A laboratory manual</a>. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133, 90-102 (2008).</li>
<li>Karaolis, D. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vibrio+cholerae+pathogenicity+island+associated+with+epidemic+and+pandemic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).</li>
<li>Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+promoter+contacts+essential+for+promoter+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).</li>
<li>Pan, S. H., Malcolm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+background+expression+and+improved+plasmid+stability+with+pET+vectors+in+BL21+%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3).</a> Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).</li>
<li>Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+diverse+toxin-coregulated+pilus-positive+Vibrio+cholerae+strains+fails+to+demonstrate+evidence+for+Vibrio+pathogenicity+island+phage%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage.</a> Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).</li>
<li>Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+diversity+of+quorum-sensing+systems+in+clinical+and+environmental+isolates+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae.</a> Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).</li>
<li>Heidelberg, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+of+both+chromosomes+of+the+cholera+pathogen+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.</a> Nature. 406, 477-483 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת TransFLP שתוארה לעיל ובמקומות אחרים 5 כבר נעשה שימוש נרחב במעבדה שלנו. הסוג של מניפולציות גנטיות שישימות כולל בין שאר: מחיקה של גנים בודדים ואשכולות גנים, מחיקה של איים גנומיים (למשל, VPI-1), החדרה של רצפים במעלה זרם של גן של עניין (למשל, רצפי פרומוטר) והחדרה של רצפים בסוף הגן ספציפי (למשל, תגי זיקת קידוד). תנאי מוקדם ליבוא TransFLP הוא שV. המתאים לחץ הוא טבעי <...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פתיתי כיטין </td><td> סיגמא </td><td> C9213 </td><td> מעוקר נדרש </td></tr><tr><td> אופציונלי: Micropulser (במקרה קלטת אנטיביוטיקה צריכה להיות מצונזרת על ידי recombinase FLP מקודד על PBR-FLP) </td><td> Biorad </td><td> 165-2100 </td><td> או electroporators דומה </td></tr></tbody></table>

transflp - שיטה גנטית לשינוי<em&gt; vibrio cholerae</em&gt; בהתבסס על שינוי הטבעי וflp-רקומבינציה

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

מספר שיטות זמינות כדי לתפעל כרומוזומים חיידקים 1-3. רוב הפרוטוקולים הללו מסתמכים על ההחדרה של פלסמידים replicative מותנה (למשל חסת replicons תלוי-PIR או רגיש לטמפרטורת 1,2). פלסמידים אלה משולבים לתוך הכרומוזומים חיידקים המבוססים על רקומבינציה הומולוגיה בתיווך. מוטנטים insertional כאלה לעתים קרובות להשתמש ישירות בהגדרות ניסיוניות. לחלופין, בחירה לכריתת פלסמיד ואחרי ההפסד שלה ניתן לבצע, אשר לחיידקים גראם שליליים, לעתים קרובות מסתמכת על אנזים sucrase נגד בחירת levan מקודד על ידי גן sacB 4. הכריתה יכולה לשחזר את הגנוטיפ טרום כניסה או תוצאה בחילופים בין כרומוזום והעתק פלסמיד המקודד של הגן השונה. חסרון בשיטה זו הוא שזה זמן רב. פלסמיד יש המשובט ראשון, זה דורש העברה אופקית לV. cholerae (ביותר n<html> otably ידי הזדווגות עם E. זן חיידק תורם) או שינוי מלאכותי של האחרון, והכריתה של פלסמיד הוא אקראי וגם תוכל לשחזר את הגנוטיפ הראשוני או ליצור שינוי הרצוי, אם אין ברירה חיובית הוא הפעיל. כאן, אנו מציגים שיטה למניפולציה מהירה של V. כרומוזום cholerae (הים) 5 (איור 1). שיטת TransFLP זה מבוסס על האינדוקציה גילתה לאחרונה כיטין בתיווך של כישורים טבעיים באורגניזם 6 והשני נציג זה של Vibrio הסוג כמו V. 7 fischeri. יכולת הטבעית מאפשרת את הספיגה של דנ&quot;א בחינם כולל שברי DNA PCR שנוצר. ברגע שמתחיל לעלות ומשלב מחדש את ה-DNA בכרומוזום נתון הנוכחות מינימאלית של 250-500 נקודתי בסיס של איגוף האזור 8 הומולוגיים. כולל סמן בחירה שבין אזורי איגוף אלה מאפשר זיהוי קל של transformants לעתים קרובות המתרחש. t &quot;&gt; שיטה זו יכולה לשמש למניפולציות גנטיות שונות של V. cholerae וחיידקים באופן טבעי מוסמכים פוטנציאלי גם אחרים. אנו מספקים שלוש דוגמאות רומן על מה שניתן להשיג בשיטה זו בנוסף למחקר שלנו שפורסם בעבר על מחיקות גן יחידות ו תוספת של רצפי זיקת תג 5. צעדי ייעול כמה נוגעים לפרוטוקול הראשוני של שינוי כיטין המושרה טבעי 6 תשולבנה בפרוטוקול TransFLP זה. אלה כוללים בין השאיר את ההחלפה של רסיסי פגז סרטנים ידי כיטין פתיתים זמינות מסחרי 8, התרומה של ה-PCR דנ&quot;א המופק כהפיכת חומר 9, ותוספת של אתרי יעד FLP-רקומבינציה (FRT) 5. אתרי FRT לאפשר כריתת אתר ביים של סמן הבחירה מתווך על ידי FLP recombinase 10.

תוצאות מייצגות של השלוש הדוגמות מוצגות באיורים 4 עד 6. הגישה הראשונה שמטרתו למחוק את הגנים השכנים ctxA וctxB. יחד הם לקודד גורם הארסיות המרכזית של ו &#39; cholerae, רעל כולרה. אנו מעוצבים oligonucleotides לשיטת TransFLP כפי שתואר לעיל ובהתאם לאיור 3. הלחץ של ההורים, מתח ביניים מחסה קלטת עמידות לאנטיביוטיקת FRT מוקף-במוקד המקורי DNA של ctxAB והמתח הסופי נמחק לctxAB ושחרר את הקלטת של ההתנגדות היה כל נבדק ...

שיטה מהירה כדי לשנות את הגנום של<em&gt; V. cholerae</em&gt; הוא תאר. שינויים אלה כוללים מחיקה של גנים בודדים, אשכולות גנים ואיים הגנומי כמו גם האינטגרציה של רצפים קצרים (למשל אלמנטים של פרומוטר או רצפי זיקת תג). השיטה מבוססת על השינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה.

TransFLP - שיטה גנטית לשינוי<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; בהתבסס על שינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה

קיימות מספר שיטות למניפולציה של כרומוזומים חיידקיים1-3. מרבית פרוטוקולים אלו מסתמכים על הכנסה של פלסמידים בעלי רפליקציה מותנית...

מטרת פרוצדורה זו היא לבצע מניפולציה גנטית ל-vio cray באמצעות שיטה מהירה וחסרה זו, המבוססת על טרנספורמציה טבעית ושילוב flip. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מקור קיטין מתאים, מאחר שקיטין הוא המשרה הטבעי של הטרנספורמציה. בשלב השני, נוצר מבנה DNA באמצעות שני סבבים של PCR ומבוצעת טרנספורמציה טבעית שלהם, המאפשרת לחיידקים המכילים את הפלסמיד PBR flip לקלוט את מקטע ה-PCR ולהטמיע אותו בגנומים שלהם.בשלב הבא, נעשה שימוש בהעלאת טמפרטורה כדי להשרות את ייצור אנזים הליפאז המקודד בפלסמיד, לצורך הסרת קסטטת העמידות לאנטיביוטיקה המוקפת על ידי אתר מטרה לרקומינציית flip (אתר FRT). בשלב הסופי, החיידקים מנקים את הפלסמיד המקודד ל-FLP. לבסוף, נעשה שימוש ב-PCR ובריצוף כדי להוכיח כי המניפולציה הגנטית הצליחה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בפלסמידי התאבדות (suicide plasmids) למניפולציה גנטית של vire, הוא ששיטה זו מהירה ויעילה מאוד. התחילו בשקילה של דגימות של 50 עד 80 mg של פתיתי קיטין בשפרויות פלסטיק סטנדרטיות בנפח 1.5 mL; לאחר מכן, כאשר מכסי השפרויות פתוחים, עקרו את הפתיתים באוטוקלאב. מיד עם סיום פעולת האוטוקלאב, סגרו את המכסים ואחסנו את ערכת פתיתי הקיטין העקוריים בטמפרטורת החדר. נדרשים לפחות שישה אוליגוניוקלאוטידים כדי להגביר באמצעות PCR את אזורי ה-DNA הרלוונטיים, וכן את קסטת האנטיב

transflp-method-to-genetically-modify-vibrio-cholerae-based-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ"א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

מקור: Erdogan, F., et al., מבחני הזדווגות מצומדים לניתוח ספציפי לרצף של חלבוני העברה המעורבים בצימוד חיידקים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההליך להעברת פלסמיד F מתאי E. coli מתורם לנמען באמצעות פלסמיד הצלה ובחירת טרנסקונג'וגנטים באמצעות עמידות כפולה לאנטיביוטיקה. התהליך כולל ערבוב תרביות חיידקים, דגירה ללא טלטול, שיבוש זוגות הזדווגות וציפוי על מדיה סלקטיבית כדי לאשר העברת פלסמיד מוצלחת.

העברת פלסמיד F ובחירת אנטיביוטיקה כפולה ב- E. coli

Electroporation הוא שיטה הנפוצה מועסק להחדרת DNA לחיידקים בתהליך המכונה טרנספורמציה. פרוטוקולים מסורתיים להכנת תאי electrocompetent הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. מאמר זה מתאר חלופי, מהיר, ושיטה יעילה להכנת תאי electrocompetent מועסקים כיום על ידי כמה מעבדות.

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

ביולוגיה סינתטית מאפשר ההנדסה של חלבונים עם מאפיינים חסרת תקדים באמצעות החדרת חומצות אמינו קאנונית co-translational. . הנה, הצגנו איך spectrally אדום-העביר גרסה של fluorophore GFP-סוג עם מאפייני ספקטרוסקופיות הרומן פלורסצנטיות, הנקרא חלבון פלואורסצנטי "זהב" (GdFP), מופק ב e. coli באמצעות הלחץ הסלקטיבי ההתאגדות (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

אנו מתארים כאן פרוטוקול לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בין שני חלבונים מבוטאים בצורה שונה מאוד ב- Pseudomonas aeruginosa חי באמצעות מדידות FLIM-FRET. הפרוטוקול כולל מבני זני חיידקים, קיבוע חיידקים, הדמיה ושגרת ניתוח נתונים לאחר הדמיה.

מדידות FLIM-FRET של אינטראקציות חלבון-חלבון בחיידקים חיים.

השיטה מתארת ​​את התהליך שבאמצעותו דיונון הוואי...

קולוניזציה של Euprymna scolopes קלמארי על ידי Vibrio fischeri</em

טפיל הצלה והמהפך assay עם THP1 תאים...

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

למד שיטה מהירה להנדסה גנטית של Vibrio cholerae באמצעות טרנספורמציה טבעית ו-FLP-רקומבינציה. השיטה מאפשרת מחיקת גנים ושילוב רצפים ביעילות גבוהה לחקר פונקציות גנים.

TransFLP - שיטה גנטית לשינוי

גלה סרטונים נוספים