TransFLP - שיטה גנטית לשינוי Vibrio cholerae בהתבסס על שינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה

מטרת הליך זה היא לבצע מניפולציה גנטית של vio cray בשיטה מהירה וחסרה זו, המבוססת על טרנספורמציה טבעית ושילוב היפוך. זה מושג על ידי הכנת מקור כיטין מתאים, שכן כיטין הוא הגורם הטבעי לטרנספורמציה. במהלך השלב השני, נוצר מבנה DNA באמצעות שני סבבים של PCR ומתבצעת הטרנספורמציה הטבעית שלהם, המאפשרת לחיידקים המכילים את הפלסמיד PBR לתפוס את מקטע ה-PCR ולהשתלב בגנום שלהם.

לאחר מכן, העלאת טמפרטורה משמשת כדי לגרום לאנזים ליפאז מקודד פלסמיד להסרת יעד הרקומבינציה ההיפוך או קלטת עמידות לאנטיביוטיקה מאגפת אתר FRT. בשלב האחרון, החיידקים נרפאים מהפלסמיד המקודד FLP. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-PCR ובריצוף כדי להראות שהמניפולציה הגנטית הייתה מוצלחת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בפלסמידים מתאבדים למניפולציה גנטית של vire הוא ששיטה זו מהירה ויעילה מאוד. התחל בשקילה של 50 עד 80 מיליגרם דגימות של פתיתי כיטין בצינורות פלסטיק סטנדרטיים של 1.5 מיליליטר, לאחר מכן שמור על מכסי הצינורות פתוחים, חיטוי הפתיתים לאחר שהחיטוי קרא מיד סגור את המכסים ואחסן את ערכת החיטוי בפתיתים בטמפרטורת החדר נדרשים לפחות שישה אוליגונוקלאוטידים כדי להגביר את אזורי ה-DNA המעניינים, כמו גם קלטת האנטיביוטיקה הצמודה ל-FRT על ידי PCR. מומלץ גם לכלול זוג פריימרים אוליגונוקלאוטידים מחוץ לשבר ה-PCR שהוכנס.

זה מאפשר לבדוק אינטגרציה וכריתה נכונה של עיצוב קלטת העמידות לאנטיביוטיקה מאגפת FRT, מספר שתיים, מספר שלוש, מספר ארבע ומספר חמש, אוליגונוקלאוטידים בזהירות. פריימרים 2 ו-5 צריכים להכיל לפחות 28 זוגות בסיסים כדי להיות מסוגלים לכרוע ברך מספיק ל-DNA הגנומי והפריימרים. יש לבנות שלוש וארבע עם פחית FRT FRT המכילה פלסמיד כעיצוב תבנית, פריימרים שניים וחמישה כדי לאפשר זיווג בסיס משלים נרחב בקצה החמישי בין פריימרים שניים ושלושה ופריימרים ארבע וחמישה בהתאמה.

כעת עבור הסבב הראשון של PCR, השתמש באוליגונוקלאוטידים 1 ו-2 כדי להכין את הראשונה מבין שלוש תגובות PCR בו זמנית, אך עצמאיות להגברה של האזור במעלה הזרם של אזור הניסוי המעניין של המבנים המעוצבים בהתאמה אישית. במקביל, הכינו את תגובת ה-PCR השנייה באמצעות אוליגונוקלאוטידים שלוש וארבע כדי להגביר את קלטת האנטיביוטיקה הצמודה ל-FRT. לדוגמה, בניסוי זה נעשה שימוש בגן A PH המקודד לעמידות לכלבים.

להגביר במקביל את אזור ה-DNA במורד הזרם על ידי הכנת תגובת ה-PCR השלישית באמצעות אוליגונוקלאוטידים חמש ושש ו-DNA גנומי כתבנית. לאחר מכן התחל את תגובת ה-PCR עבור כל שלוש הדגימות לאחר טיהור כל שלושת שברי ה-PCR, השתמש בתערובת עם כמויות שוות של כל שלושת השברים שהתקבלו בסיבוב הראשון כתבנית לביצוע סיבוב שני של PCR. הגברה זו תזרז על ידי אוליגונוקלאוטידים אחד ושישה.

מקטע ה-PCR שיתקבל ישמש כ-DNA המשתנה בניסויי הטרנספורמציה הטבעית. לאחר גידול תאי כולרה v, מדיום מועשר אירובי ב -30 מעלות צלזיוס. קצרו את החיידקים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו את תרבית החיידקים לעפיפון בפתיתים ודגרו על תרחיף התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ערבבו בזהירות לפחות 200 ננוגרם של שברי ה-PCR שמקורם בסיבוב השני לתוך תרחיף תאי החיידקים. הקפידו לא לנתק את החיידקים באופן נרחב ממשטחי הכיטין, ואז דגרו על תמיסה זו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ללא תנועה למשך יום נוסף.

כעת מערבולת, התרבית נמרצת במשך 30 שניות לפחות עבור חיידקים המכילים את הפלסמיד ההפוך PBR מפזר 100 עד 300 מיקרוליטר מתמיסת התא על צלחות סלקטיביות כפולות המכילות אמפיצילין. בנוסף לאנטיביוטיקה האחרת בצלחות, דגרו על תרביות תאי החיידקים ב-30 מעלות צלזיוס עד שהמושבות נראות לעין. לאחר מכן בודד את השנאים הבודדים מהלוחות הסלקטיביים.

התחל שלב זה על ידי גידול החיידקים על צלחות אגר LB המכילות אמפיצילין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות. כצעד אופציונלי, שנה את הטמפרטורה למשך שעתיים-שלוש ל-40 מעלות צלזיוס כאשר ביטוי ההיפוך מפלסמיד ה-PBR מדוכא בטמפרטורות גבוהות יותר. לאחר שמונה שעות דגירה נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, העבירו את החיידקים לצלחות טריות.

כעת הגבילו את השיבוטים במקביל על צלחות אגר המכילות אנטיביוטיקה ונטולות אנטיביוטיקה כדי לבדוק רגישות לאנטיביוטיקה ולאחר מכן בודדו מושבה רגישה לאנטיביוטיקה אחת. התחל שלב זה בגידול התרבית בן לילה בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, מדיום מעשיר ללא אנטיביוטיקה. למחרת בבוקר לגדל תרבית חדשה במשך שלוש עד שש שעות על ידי דילול תרבית הלילה ביחס של 1 ל-100 במדיום טרי נטול אנטיביוטיקה בפס אחר הצהריים או דילול הצלחת של התרבית על צלחות אגר LB רגילות, ולאחר מכן דגירה על הצלחות למשך שמונה עד 16 שעות נוספות ב-30 מעלות צלזיוס עד שהמושבות נראות לעין.

בניסוי ראשון זה נועד למחוק את הגנים השכנים CTXA ו-CTXB. האוליגונוקלאוטידים לשיטת הטרנס פליפ נוצרו כפי שהודגם זה עתה הזן ההורי, זן הביניים המכיל את קלטת העמידות לאנטיביוטיקה מאגף FRT במקום לוקוס ה-DNA המקורי של C-T-X-A-B והזן הסופי שנמחק עבור C-T-X-A-B ושוחרר מקלטת ההתנגדות נבדקו כולם עבור הגנוטיפ שלהם PCR סיטונאי בוצע לניסוי זה באמצעות פריימרים שלא כרעו ברך למקטע ה-PCR המשתנה, אלא רק ל-DNA הכרומוזומלי. שברי ה-PCR הופרדו על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של אירוג'ל כדי לקבוע את גודלם.

בנתיב הראשון, זן הכולרה העולמי מסוג B אותר בגודל השבר הצפוי של 3,143 זוגות בסיסים. בנתיב השני, שבר ה-PCR שמקורו בזן דלתא C-T-X-A-B-F-R-T יכול. FRT היה ממוקם ב-3,162 זוגות בסיסים.

ובנתיב השלישי, שבר הדלתא ctx A B FFR TP CR היה ממוקם ב-1,769 זוגות בסיסים בהשוואה לסולם KB אחד. בדוגמה השנייה שבה הוסר אי גנומי שלם, האי Vibrio Pathogenicity אחד או VPI אחד נבחר כמטרה לניסוי זה. שיטת הטרנס היפוך שונתה בשני שלבים.

ראשית, האינטגרציה של גן העמידות לקנמיצין בוצעה על ידי אתר FRT יחיד בתחילת PI 1. לאחר מכן בוצע סבב שני של טרנספורמציה טבעית, המאפשר הכנסת סמן עמידות נוסף לאנטיביוטיקה, כלומר עמידות לגנטמיצין ואחריו אתר FRT שני בקצה אי הפתוגניות. זוגות הפריימר המתאימים מצוינים מעל כל תמונת ג'ל ושיטת הטרנס FLP המשיכה כפי שהודגם זה עתה.

הזנים ההוריים, הבינוניים והסופיים אומתו כולם על ידי PCR של ה-DNA הגנומי המטוהר בנתיב הראשון. שבר ה-PCR של זן הכולרה הפראי מסוג V הופעל בנתיב השני. שבר ה-PCR הנובע מזן VPI אחד FRT יכול GM FRT הופעל.

ובנתיב השלישי, נותח תוצר ה-PCR של הזן דלתא VPI אחד שמקורו ב-FRT. זוגות פריימר מצוינים מעל כל תמונת ג'ל. הזן האחרון חסר את כל ה-VPI.

בדוגמה השלישית הזו, רצף מקדם תלוי RNA שבעה RNA פולימראז שולב במעלה הזרם עם שועל Gene T, מווסת עיקרי של טרנספורמציה טבעית בשיטת טרנס פליפ עם שינוי קל מהפרוטוקול הסטנדרטי. רצף הקונצנזוס של מקדם ה-RNA התלוי ב-T 7 נכלל כתלייה לאוליגונוקלאוטידים מספר ארבע ומספר חמש, כך שרצף DNA זה נשמר בתוך הכרומוזום. גם לאחר כריתת קלטת העמידות לאנטיביוטיקה, המבנה שולב בפולימראז T 7 RNA המכיל זן בצבע V.

בזן זה, הביטוי של הגן T 7 RNA פולימראז הונע על ידי מקדם LAC UV 5 כדי לבדוק את הביטוי התלוי ב-T 7 RNA פולימראז של T Fox מבחני טרנספורמציה טבעית בוצעו במדיום LB. הזן ההורי חסר את המקדם התלוי ב-T 7 לפני ה-Gene T Fox אינו ניתן לשינוי טבעי בתנאים אלה בשל היעדר שעתוק T FOX במדיום עשיר ובהיעדר הגורם הטבעי שלו כיטין. פנוטיפ זה לא היה תלוי בשאלה אם ה-T 7 RNA פולימראז הושרה באופן מלאכותי על ידי IPTG או לא.

עם זאת, הזן שנוצר על ידי טרנס, המכיל את המקדם התלוי ב-T 7 RNA פולימראז במעלה הזרם של היכולת Gene T Fox, אכן היה מדיום מעשיר הניתן לשינוי טבעי עקב דליפת מקדם ה-LAC UV 5 במדיום LB. ה-T 7 RNA פולימראז המיוצר כבר העתיק את T FOX מהמקדם התלוי ב-T 7 RNA פולימראז ללא אינדוקציה על ידי IPTG. זה התחיל יכולת טבעית וטרנספורמציה המאשרת את הפונקציונליות של רצף המקדם המשולב התלוי ב-T 7 RNA פולימראז.

פנוטיפ זה שופר משמעותית על ידי אינדוקציה מלאה של T 7 RNA פולימראז עקב הוספת המשרה של מקדם LAC UV 5 IPTG. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתמרן גנטית כולרה VI באמצעות שילוב של טרנספורמציה טבעית המושרה על ידי כיטין ורקומבינציה הפוכה. לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת לך למחוק גנים או איים גנומיים, כמו גם לשלב רצפי DNA באופן מכוון אתר תוך מספר ימים בלבד.