טכניקה פשוטה עבור

כיום אנו מדגימים טכניקה מפושטת להוצאת קרנית ורקמת רשתית מגלגל עין אנושי של תורמי גופות. הטכניקה המתוארת תסייע בהשגת רקמה באיכות גבוהה לשימוש לצורכי השתלה, ניתוחים ומחקר, מבלי לפגוע ברקמות אחרות של גלגל העין. עם ניסיון של 18 שנים ומאות השתלות קרנית מדי שנה, שמרנו על רמה גבוהה של עבודתנו על ידי פיתוח טכניקות חדשות ושיפור מיומנויותינו מדי יום.

כדי להשיג זאת, אנו מבצעים תחילה כריתה של הקרנית, ולאחר מכן הוצאה של הרשתית. הקרנית היא רקמה חסרת כלי דם המאפשרת את מעבר האור אל הרשתית, ולצורך כך, עליה לשמור תמיד על דרגה טובה של שקיפות. הקרנית מורכבת מחמש שכבות: האפיתל, שכבת באומן (Bowmans layer), הסטרומה, ממברנת דססמט (descemet membrane) והאנדותל.

אם הקרנית פגועה, ניתן להחליפה בעזרת קרנית תורם מתאימה. הכורויה היא הרקמה הבינונית בין הלובנה לרשתית, הגבולה בחלקה הפנימי על ידי ממבראת ברוס והיא האחראית על זרימת הדם בעין. השלקה נאותה של הכורויה חשובה באותה מידה כמו הסרת הרשתית.

הרשתית מסייעת בקליטת האור המגיע מהקרנית ומהעדשה וממירה אותו לאנרגיה כימית המועברת בסופו של דבר למוח. בשל העובדה שהעצב האופטי הוא שקוף ועדין, יש להוציא אותו באופן שיטתי כדי להבטיח איכות רקמה טובה. הפעל את תא הזרימה הלמינרית.

נקה את מapay הזרם הלמינרי באמצעות אלכוהול איזופרופיל 70%. לבש ביגוד מגן אישי כגון כיסוי ראש כירורגי, כפפות סטריליות ושרוולים חד-פעמיים. תוך שימוש בטכניקה אספטית, הכן את השטח הסטרילי על ידי הנחת מגבת סטרילית ומגש מכשירים שעבר סטריליזציה מראש.

פתחו בצורה אספטית את מארז המכשירים הסטריליים והפכו אותו אל השדה הסטרילי, תוך הימנעות מכל זיהום. מקמו את כל החומרים והמכשירים הסטריליים בשדה הסטרילי והניחו את צנצנות העיניים המכילות את גלובוס העין כך שיהיו רחוקות מקצה השדה הסטרילי. לנוחות השימוש, סמנו את הבקבוקים המכילים מדיום אחסון שהוכן מראש, והניחו iodine polyol pyro lid על sodium th sulfate, ומحلול phosphate buffer saline סטרילי.

מחוץ למסביבה הסטרילית, יש להמתין עד שרקמות העין והתמיסות יגיעו לטמפרטורת החדר הרגילה, שכן הן נשמרות במקררים בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. יש להימנע ממחזורי חימום או קירור חוזרים. יש להסיר את הגזים והספוגים מצנצנת העין באמצעות פינצטה סטרילית.

הניחו את גלגל העין על המכסה והסירו את התחבושות הנוספות. הרימו בזהירות את גלגל העין יחד עם העצב האופטי וטבלו את גלגל העין בנוזל סטרילי. חטאו את גלגלי העין ב-IPVP סטרילי למשך שתי דקות.

העבירו את הגלובוס לתוך תמיסת סודיום תיאוסולפט סטרילית למשך דקה אחת. העבירו את הגלובוסים לתמיסת תמיכה לתאי קו תאים בבופר פוספט סטרילי והשאירו עד למועד הביצוע. בעבודה תחת מנדף זרימה למינרית, שטפו והוציאו את גלובוס העין מה-PBS והניחו אותו תחת שדה סטרילי.

עטפו את גלגל העין בבד סטרילי, תוך השארת הקרנית וכחמישה מילימטרים של הסקלרה מהקרנית חשופים; ניתן להחזיק את גלגל העין פשוט ביד. תוך שמירה על לחץ מתאים, השתמשו במספריים סטריליים כדי להסיר את כל שאריות הלחמית, מבלי לפגוע בקרנית.

השתמש בלהב סקאלפל חד-פעמי כדי לבצע חתך בסיקלרה במרחק של שלושה עד ארבעה מילימטרים מאזור הלימבוס. לאחר מכן הרחב את החתך ב-360 מעלות, תוך הימנעות מניקוב רקמת הענבייה שמתחתיו או מגרימה לעיוות של קימור הקרנית התקין. בצע ארבעה חתכים גדולים המותירים ארבעה מרווחים קטנים, תוך מניעת דליפה של הגוף הזגוגית.

ארבעת הפערים נגזרים, תוך הבטחה שאין הסרה של רקמה אחרת כלשהי. נוכחותם של פלאקים סקלרליים קטנים עלולה להפריע לגזירה, לכן יש לוודא את השלמת הכריתה הסקלרלית באמצעות מספרי מיקרו-כירורגיה. פעולה זו צריכה להתבצע ללא פגיעה בכורואיד, ברשתית ובגוף הזגוגית.

בדקו את החתך כדי לוודא שהוא הושלם. אם החתך בוצע כראוי, השוליים הסקלרליים של הקרנית נצמדים לגוף הציליארי רק בנקודה המתאימה לקרנית; הניחו את גלגל העין במרכז השדה הסטרילי. השלימו את הסרת הקרנית באמצעות פינצטה סטרילית.

החזק את שולי הלובן (sclera) ללא תזוזה והסר את שולי הקרנית והלובן הרחק מהזוהר העיני. הפר בעדינות את כל השאריות הסמוכות מכפתור הקרנית והלובן. אין למתוח את שולי הקרנית והלובן באופן שעלול לגרום למתח חוצה-קרניתי, ואין לאפשר להם לצנוח חזרה אל תוך התא הקדמי.

את צפיפות התאיים האנדותליים של הקרנית בודקים באמצעות תמיסה היפוטונית, ואת תמותת התאים באמצעות צביעת trip and blue למשך כדקה אחת. מסירים את צבע ה-trip and blue באמצעות גזה סטרילית ממתכת ושוטפים את הקרנית ב-PBS סטרילי. מעבירים אותה לצלחת פטרי סטרילית מלאה בתמיסת סוכרוז.

תמיסה זו מסייעת ביצירת סביבה היפוטונית ובזיהוי ויזואלי של התאים. לאחר מכן סופרים את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה של 100x ומודדים אותם כמספר תאים לממ"ר. בדרך כלל בוחנים את התאים לצורך הערכת צפיפות תאית ומאפיינים מורפולוגיים כגון גבולות בין-תאיים, פולימורפיזם, דגנרציה, דיסטרופיה ותמותת תאים.

עובי הקרנית הוא מאפיין חשוב נוסף עבור השתלה, לצד דרגת שקיפות טובה של הקרנית שהוצאה. משתמשים ב-CLO קרנית סטרילי כדי לקבע את הקרנית לשולי הסקלרה, מכופפים את ה-CLO של הקרנית כדי להבטיח שפתיחת החור מספיקה לנעילת שולי הסקלרה, ומעבירים את שולי הסקלרה של הקרנית באמצעות corneal clove לתוך תווך אחסון קרנית שהוכן מראש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשמור את הקרנית ב-31 degree SIUs במהלך תקופת השימור של הקרנית הנמשכת ארבעה שבועות.

תוכנית האחסון עוברת מספר בדיקות מיקרוביולוגיות באמצעות מכשיר B 9 2 4 0. מאחר שבמהלך האחסון, הקרנית הופכת לעבה יותר מגודלה הרגיל הנדרש להשתלה, בנקי קרניות משתמשים בחומרי נפיחות כדי להפחית את העובי; 6%Dextron T 500 משמש להחזרת הקרנית לגודלה הנורמלי ולתווך ההובלה.

נקה את המכשירים הסטריליים באמצעות RNA app כדי ליצור סביבה נקייה מ-RA לפני חיתוך הרשתית. הכן את השטח הסטרילי וודא שגלגל העין שלם וכי רק הקרנית ושולי הסקלרה הוסרו. אם גוף הזכוכית דולף החוצה, הסרת רקמת הרשתית הופכת לקשה יותר.

אם התורד מתחת לגיל 65, הלובן (sclera) נשמר ב-70% alcohol למטרות ניתוחיות לאחר בדיקות סרולוגיות. במקרים אלו, לא חותכים את הלובן, אלא מסירים רק את הגוף הזגוגית ושומרים את כל הלובן לצורך כריתת רשתית. התחילו בחתך קטן ליד הצד הקרנאלי של הלובן, והתקדמו לכיוון העצב האופטי באמצעות פינצטה ומספריים סטריליים.

החזיקו את חלק הלובן (sclera) באמצעות פינצטה סטרילית וגזרו במספריים בקו ישר לכיוון העצב האופטי, חלק אחר חלק, תוך הימנעות מפגיעה בגוף הזגוגית (vitreous body). יש להפריד את פקקי הכורואיד מהלובן כיוון שהם דבוקים זה לזה. גזרו את כל הלובן כדי לחשוף את רקמת הכורואיד.מה?

לאחר שהסקלרה נחתכה לחלוטין, הפרידו אותה מהרקמות הנותרות על ידי חיתוך ליד העצב האופטי; כעת תהיה גלויה שכבה שלמה של הכורואיד המכסה את הגוף הזגוגית. מלאו מבחנות סטריליות נטולות RNA ב-2 ml של תמיסת RL באמצעות שתי פינצטות סטריליות. הסירו בעדינות את שכבת הכורואיד על ידי תפיסת העצב האופטי עם זוג פינצטות אחד והסרת הכורואיד עם הזוג השני.

הפרידו את הכורואיד באופן חלקי וגזרו אותו כדי להקל על הסרתו. ניתן לגזור את שכבת הכורואיד בעזרת מספריים תוך הימנעות מגרימת נזק לרשתית. הניחו את שכבת הכורואיד שהוסרה בתוך תמיסת RNA later ושמרו אותה בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך 24 שעות.

הסר את כל שאריות הכורויה כדי לחשוף את רקמת הרשתית. לאחר הסרת שכבת הכורויה כולה, תיראה שכבת רשתית שקופה. ניכר כי לשכבת הכורויה יש ממברנה ברוס פנימית, אותה ניתן להסיר גם כן, אך קשה לזהותה בעין בלתי מזוינת.

בדומה לכך, השתמש בשתי פינצטות כדי להסיר את שכבת הרשתית. קל לבודד כמות גדולה של רשתית אם הכריתה מבוצעת בקרבת העצב האופטי. כעת ניתן לראות את כל שכבות העין.

הניחו את הרשתית החתוכה בתוך תמיסת RNA later ושמרו אותה בטמפרטורה של 4 °C למשך 24 שעות. נקו את אזור העבודה באמצעות אלכוהול איזופרופיל 70%. ניתן לצפות בתאי אנדותל שנצבעו באמצעות trypan blue תחת הגדלה של 100x של מיקרוסקופ הפוך.

קרנית מתאימה עם יותר מ-200 תאים לממ"ר נשמרת בדרך כלל לשימוש עתידי. דירוגן של הקרניות, מאיכות סבירה ועד מצוינת, יסייע במחקרים השוואתיים. בדרך כלל, ברגע שהקרנית מוכנה להשתלה, נרשמים העובי והשקיפות, וקרנית מתאימה משמשת להשתלת קרנית חודרת (penetrating keratoplasty) שבה מושתלת הקרנית כולה.

תמותת תאים נבדקת על ידי תצפית על תאים שנצבעו בכחול ומדורגת כאחוז התאים המתים. תמותת תאים כללית של יותר מ-2% נחשבת כבלתי מתאימה במהלך השימור. אם צפיפות התאים נמוכה מ-2200 תאים לממ"ר או שיש נזק עקב תמותה, ניתן להשתמש בקרנית לקרסטיה למינרית קדמית (anterior laminar keratoplasty).

אם החלק הקדמי פגום והקרנית בעלת צפיפות תאי אנדותל טובה, ניתן להשתמש בקרנית לקרסטופלסטיה למינרית אחורית. עובי הקרנית גדל בדרך כלל במהלך תרבית איברים. תווך ההובלה מסייע להשיב לה את צורתה ומבנהה הנורמליים.

בנוסף, תרבית איברים מסייעת לאפיתליזציה מחדש של הקרנית, ובשל תקופת האחסון הממושכת שלה, היא מסייעת בבחירת תורם מתאימה. בדיקות מיקרוביולוגיות וסרולוגיות. היא מעניקה מספיק זמן לארגון הניתוח ומסייעת בבדיקת צפיפות ומורפולוגיה של תאי האנדותל כאשר הדבר אינו אפשרי עקב זמן ממושך לאחר המוות.

לפיכך, אם פועלים לפי הפרוצדורה המתוארת, ניתן להוציא את הקרניות ללא כל נזק לרקמות אחרות. במידה והקרנית אינה מתאימה להשתלה, ניתן להשתמש בה למטרות מחקר כדי לפתח מצעים ותנאי שימור חדשים לבחינת מחלות של פני השטח של העין, לבידוד תאי גזע לימבליים ולבחינת השפעת תרופות על הקרנית. עבור הרשתית, ניתן למנוע זיהום צולב של דגימות RNA עם רקמות סמוכות ולשמור על שלמות ה-RNA, דבר שהוא בעל חשיבות יסודית.

רקמות אלו, החיוניות למטרות מחקר, נועדו לאפיון הטרנסקריפטום של רקמות העין, בידוד תאי גזע עבור פרויקטים של רפואה רגנרטיבית, והערכת הבדלים היסטולוגיים בין רקמות מנבדקים בריאים לנבדקים חולים. לאחר הסרת רקמת הרשתית, ניתן להשתמש בה למטרות שונות, ולכן השלבים הבאים והתנאים המשמשים לשימור עשויים להשתנות בהתאם. לדוגמה, ניתן להניח את רקמת הרשתית במבחנות המכילות ריאגנטים לייצוב RNA כגון r nator או thisis buffer לצורך מיצוי RNA או DNA, או ב-displaced או trypsin לצורך בידוד תאים.

קיבוע של תמיסות לפני הטמעת רקמות בפרפין או ב-OCT עבור אימונוהיסטוכימיה. תודה שצפיתם בסרטון זה ובהצלחה במחקריכם.