Name: טכניקה פשוטה עבור באתרו כריתת של הקרנית ואת הוצאת הקרביים של רקמת רשתית מ גלוב Ocular האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: למד טכניקה פשוטה לכריתת קרנית והוצאת רשתית מגלוב עיניים אנושי לשימוש בהשתלות ומחקר. השיטה שומרת על איכות הרקמות ומונעת נזק למבנים סמוכים לאחר 18 שנות ניסיון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות מענקים של ונטו Regione (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 ו Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). המחברים מודים לד&quot;ר ג Griffoni עבור הנתונים 2009/2010 סיכום על השימוש גלובס עיניים אנושיות.

<ol><li>Fay, A. Diseases of the visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFay%2C+A+%22Cecil+Medicine%22">Cecil Medicine</a>. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).</li>
<li>Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+in+Limbal+Stem+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents in Limbal Stem Cell Biology.</a> Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).</li>
<li>Pharm, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Eye%3A+The+physiology+of+human+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Britannica+educational+publishing%22%5BJournal%5D)">The Eye: The physiology of human perception.</a> Britannica educational publishing. 36, 19-27 (2011).</li>
<li>Lang, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLang%2C+G+%22Ophthalmology%3A+A+pocket+textbook+atlas%22">Ophthalmology: A pocket textbook atlas</a>. , 2nd Edition, 115-117 Forthcoming.</li>
<li>Liesbeth, P. els <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+Culture%3A+The+method+of+choice+for+preservation+of+human+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Organ Culture: The method of choice for preservation of human donor corneas.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 523-525 (1997).</li>
<li>Meyer, J. S., Howden, S. E., Wallace, K. A., Verhoeven, A. D., Wright, L. S., Capowski, E. E., Pinilla, I., Martin, J. M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Trifunovic, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+RNA+expression+atlas+of+retinitis+pigmentosa+genes+in+human+and+mouse+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2330-2336 (2008).</li>
<li>Mora, P., Montanini, L., Ferrari, S. Retina. 30, 1555(2010).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+Mouse+Eye+for+a+Whole+Mount+of+the+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (48), e2563(2011).</li>
<li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evisceration+of+Mouse+Vitreous+and+Retina+for+Proteomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses.</a> J. Vis. Exp. (50), e2795(2011).</li>
</ol>

החוקרים אין ניגוד עניינים.

שניהם, כריתה נכונה ושמירה נכונה של רקמות הקרנית הרשתית הם קריטיים כמו פגמים קלים כגון נזק האנדותל או מספר גבוה של קפלים של descemet יכול להוביל לכישלון השתל של הקרנית ואילו שינויים בטמפרטורה או טיפולו הכושל יכול להתפשר על שלמות רקמות הרשתית. מטרת מאמר זה היא להראות כיצד רקמות הקרנית ברשתית יכול להיות מבודד באופן אופטימלי, ללא גרימת נזקים או שינויים, אשר עלול לסכן את השימוש בהם להשתלה או למטרות מחקר. המינימום הנדרש תא צפיפות (&lt;2200 תאים / מ&quot;מ 2), מורפולוגיה טובה ...

חומרים כריתה של הקרנית ואת הרשתית. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תאור המוצר </td><td> מידות </td><td> החברה / המוסד </td></tr><tr><td> שמרו הפנויה אזמל </td><td> Blade בגודל 15 </td><td> סוואן, מורטון </td></tr><tr><td> תחבושות סטריליות </td><td> 5 ס&quot;מ על 5 ס&quot;מ, 8 שכבות, 5 יח&#39; </td><td> Artsana </td></tr><tr><td> מגבת סטרילית רפואי חד פעמי </td><td> 35 X 50 ס&quot;מ </td><td> U.Jet </td></tr><tr><td> עקרות מספריים </td><td> להבים 24 מ&quot;מ / אורכו הכולל. 95 מ&quot;מ מעוגלת, בוטה </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> סטרילית מלקחיים </td><td> נירוסטה -100 מ&quot;מ 11 X 2 הנשלט על ידי השיניים 0.70 מ&quot;מ </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> טופר הקרנית - מכשיר רפואי חד פעמי </td><td></td><td> NIIOS (Hippocratech) </td></tr&gt; <tr><td></td><td> ההכנות </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 100 מ&quot;ל PBS [10x] ב 900 (מים מזוקקים) מ&quot;ל ד / ל </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Na-thiosulphate </td><td> 1 גרם Na-thiosulphate ב 1 ליטר של PBS [1x] </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> I-PVP </td><td> 5 גרם I-PvP ב 1 ליטר ד / ל </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הטבלה מתארת ​​את החומרים המשמשים כריתה של הקרנית ואת הרשתית לבין החברה הם מתקבלים. חומרים עבור אמצעי אחסון (2000 מ&quot;ל). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבי </td><td> ספק </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ריכוז </td><td> כמות </td></tr><tr><td> MEM(1X) נוזלי </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1900 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נתרן פירובט </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1 מ&quot;מ (10 מ&quot;ל / ל &#39;) </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2 מ&quot;מ (10 מ&quot;ל / ל &#39;) </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה / antimycotic </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5955-20ML </td><td> 10 מ&quot;ל / ליטר </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סובך של יילוד בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 מ&quot;ל / ל &#39;) </td><td> 40 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 3. חומרים בינוני האחסון. הכנת אמצעי אחסון להוסיף את כל החומרים באמצעות ריכוזים ספציפיים שניתנו לעיל בצנצנת ומערבבים היטב. לסנן אותםבאמצעות גודל הנקבוביות של 0.2 מיקרון המסנן (Millipore, מילאנו, איטליה) עם עזרה של המשאבה peristaltic. לשמר את המדיום בבקבוקים ב RT. חומרים בינוני הובלה (2000 מ&quot;ל). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבי </td><td> ספק </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ריכוז </td><td> כמות </td></tr><tr><td> MEM (1X) נוזלי </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1800 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> נתרן פירובט </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1 מ&quot;מ (10 מ&quot;ל / ל &#39;) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2 מ&quot;מ (10 מ&quot;ל / ל &#39;) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> סובך של יילוד בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 מ&quot;ל / ל &#39;) </tד&gt; <td> 40 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Dextran T500 </td><td> Pharmacosmos </td><td> 551005004007 </td><td> 6% (60 גרם / ליטר) </td><td> 120 גר &#39;/ ל </td></tr></tbody></table> לוח 4. חומר בינוני התחבורה. הכנת אמצעי התחבורה הוסף dextran 6% ב 1.5 ליטר ~ של MEM ולהשאיר אותה בן לילה. מוסיפים את יתר החומרים בכלי התקשורת ולסנן באמצעות 0.2 מיקרון המסנן (Millipore, מילאנו, איטליה) באמצעות משאבת ואקום. לשמר את המדיום בבקבוקים ב RT.

טכניקה פשוטה עבור<em&gt; באתרו</em&gt; כריתת של הקרנית ואת הוצאת הקרביים של רקמת רשתית מ גלוב ocular האדם

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

אנוקלציה (Enucleation) היא התהליך של הוצאת גלגל העין מתורם גופה תוך השארת שאר חלקי גלגל העין ללא הפרעה. כריתה (Excision) מתייחסת להוצאת רקמות עיניות, ובמיוחד הקרנייה, על ידי חיתוכה והפרדתה מגלגל העין. אוויסקרציה (Evisceration) היא התהליך של הסרת האיברים הפנימיים, המתייחסים כאן לרשתית. גלגל העין מורכב מהקרנייה, הלובנה (Sclera), הגוף הזגוגית, העדשה, הקשתית, הרשתית, הכורואיד, שרירים וכדומה (תוספת איור 1). כאשר מטופל סובל מנזק לקרנייה, יש להסיר את הקרנייה ולהשתיל קרנייה בריאה באמצעות ניתוחי קרנייה (keratoplastic surgeries). הפרעות גנטיות או פגמים בתפקוד הרשתית עלולים לפגוע בראייה. ניתן להשתמש בגלגלי עיניים אנושיים להליכים כירורגיים שונים, כגון בנק עיניים, השתלת קרנייה או לובנה אנושית ומחקר של רקמות עיניות. עם זאת, קיים מידע מועט על כריתת קרנייה ורשתית אנושית, ככל הנראה בשל הנגישות המוגבלת לרקמות אנושיות. מרבית המחקרים המתארים הליכים דומים בוצעו במודלים של בעלי חיים. מדעים נסמכים על זמינותן של רקמות עיניות שחולקו כהלכה ונשמרו היטב כדי להרחיב את הידע על התפתחות העין האנושית, ההומאוסטזיס ותפקודה. מכיוון שאנו מקבלים כמות גדולה של גלגלי עיניים, שמרביתם (כ-40%, טבלה 1) משמשים למטרות מחקר, אנו מסוגלים לבצע מספר רב של ניסויים ברקמות אלו, ולהגדיר טכניקות לכריתתן ולשימורן באופן קבוע.
הקרנית היא רקמה חסרת כלי דם המאפשרת את העברת האור אל הרשתית, ולצורך כך עליה לשמור תמיד על דרגה טובה של שקיפות. בתוך הקרנית, אזור הלימבוס, המהווה מאגר של תאי גזע, מסייע לשחזור תאי אפיתל ומגביל את גדילת היתר של הלחמית כדי לשמור על שקיפות ובהירות הקרנית. הגודל והעובי של הקרנית הם קריטיים לראייה צלולה, שכן שינויים בכל אחד מהם עלולים להוביל לראייה מטושטשת ולא ברורה. הקרנית מורכבת מ-5 שכבות: א) אפיתליום, ב) שכבת בומן (Bowman's layer), ג) סטרומה, ד) קרום דסמט (Descemet's membrane) ו-ה) אנדותליום. כל השכבות חייבות לתפקד כראוי כדי להבטיח ראייה צלולה4,5,6. הכורויה היא השכבה הביניים שבין הלובן לרשתית, הגבולה מפנים על ידי קרום ברוך (Bruch's membrane), והיא האחראית על זרימת הדם בעין. הכורויה מסייעת גם בוויסות הטמפרטורה ומספקת הזנה לשכבות החיצוניות של הרשתית5,6. הרשתית היא שכבת רקמה עצבית המכסה את החלק האחורי של גלגל העין (נספח איור 1) והיא מורכבת משני חלקים: חלק פוטו-רצפטיבי וחלק שאינו רצפטיבי. הרשתית מסייעת בקליטת האור מהקרנית ומהעדשה וממירה אותו לאנרגיה כימית המועברת בסופו של דבר למוח בעזרת העצב האופטי5,6.
מטרתו של מאמר זה היא לספק פרוטוקול לדיסקציה של רקמות קרנית ורשתית מגלובוסים עיניים אנושיים. מניעת זיהום צולב עם רקמות סמוכות ושמירה על שלמות ה-RNA הן בעלות חשיבות מכרעת, שכן רקמות אלו חיוניות למטרות מחקר השואפות ל-(i) אפיון הטרנסקריפטום של רקמות העין, (ii) בידוד תאי גזע עבור פרויקטים של רפואה רגנרטיבית, ו-(iii) הערכת הבדלים היסטולוגיים בין רקמות מנבדקים בריאים/חולים. במאמר זה אנו מתארים את הטכניקה שבה אנו משתמשים כיום להסרת הקרנית, הכורואיד ורקמות הרשתית מגלובוס עין. להלן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לדיסקציה של גלובוס העין האנושי ולהוצאת רקמות הקרנית והרשתית. הסרטון המצורף יעזור לחוקרים ללמוד טכניקה מתאימה להשגת רקמות אנושיות יקרות שקשה למצוא באופן שוטף.

העיתון מתאר שיטה פשוטה כדי הקרנית בלו וכדי להוציא את העקר רקמות רשתית העין מן העולם של תורמים גווייה אדם. הטכניקה המתוארת כאן יעזור ובלו רקמות באיכות טובה כדי לשמש להשתלה, למטרות מחקר או ניתוח מבלי לפגוע ברקמות אחרות של הגלובוס העין.

טכניקה פשוטה עבור<em&gt; באתרו</em&gt; כריתת של הקרנית ואת הוצאת הקרביים של רקמת רשתית מ גלוב Ocular האדם

אנוקלציה (Enucleation) היא התהליך של הוצאת גלגל העין מתורם גופה תוך השארת שאר חלקי הגלגל ללא הפרעה. כריתה (Excision) מתייחסת ל...

כיום אנו מדגימים טכניקה מפושטת להוצאת קרנית ורקמת רשתית מגלגל עין אנושי של תורמי גופות. הטכניקה המתוארת תסייע בהשגת רקמה באיכות גבוהה לשימוש לצורכי השתלה, ניתוחים ומחקר, מבלי לפגוע ברקמות אחרות של גלגל העין. עם ניסיון של 18 שנים ומאות השתלות קרנית מדי שנה, שמרנו על רמה גבוהה של עבודתנו על ידי פיתוח טכניקות חדשות ושיפור מיומנויותינו מדי יום.כדי להשיג זאת, אנו מבצעים תחילה כריתה של הקרנית, ולאחר מכן הוצאה של הרשתית. הקרנית היא רקמה חסרת כלי דם המאפשרת את מעבר האור אל הרשתית, ולצורך כך, עליה לשמור תמיד על דרגה טובה של שקיפות. הקרנית מורכבת מחמש שכבות: האפיתל, שכבת באומן (Bowmans layer), הסטרומה, ממברנת דססמט (descemet membrane) והאנדותל.אם הקרנית פגועה, ניתן להחליפה בעזרת קרנית תורם מתאימה. הכורויה היא הרקמה הבינונית בין הלובנה לרשתית, הגבולה בחלקה הפנימי על ידי ממבראת ברוס והיא האחראית על זרימת הדם בעין. השלקה נאותה של הכורויה חשובה באותה מידה כמו הסרת הרשתית.הרשתית מסייעת בקליטת האור המגיע מהקרנית ומהעדשה וממירה אותו לאנרגיה כימית המועברת בסופו של דבר למוח. בשל העובדה שהעצב האופטי הוא שקוף ועדין, יש להוציא אותו באופן שיטתי כדי להבטיח איכות רקמה טובה. הפעל את תא הזרימה הלמינרית.נקה את מapay הזרם הלמינרי באמצעות אלכוהול איזופרופיל 70%. לבש ביגוד מגן אישי כגון כיסוי ראש כירורגי, כפפות סטריליות ושרוולים חד-פעמיים. תוך שימוש בטכניקה אספטית, הכן את השטח הסטרילי על ידי הנחת מגבת סטרילית ומגש מכשירים שעבר סטריליזציה מראש.פתחו בצורה אספטית את מארז המכשירים הסטריליים והפכו אותו אל השדה הסטרילי, תוך הימנעות מכל זיהום. מקמו את כל החומרים והמכשירים הסטריליים בשדה הסטרילי והניחו את צנצנות העיניים המכילות את גלובוס העין כך שיהיו רחוקות מקצה השדה הסטרילי. לנוחות השימוש, סמנו את הבקבוקים המכילים מדיום אחסון שהוכן מראש, והניחו iodine polyol pyro lid על sodium th sulfate, ומحلול phosphate buffer saline סטרילי.מחוץ למסביבה הסטרילית, יש להמתין עד שרקמות העין והתמיסות יגיעו לטמפרטורת החדר הרגילה, שכן הן נשמרות במקררים בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. יש להימנע ממחזורי חימום או קירור חוזרים. יש להסיר את הגזים והספוגים מצנצנת העין באמצעות פינצטה סטרילית.הניחו את גלגל העין על המכסה והסירו את התחבושות הנוספות. הרימו בזהירות את גלגל העין יחד עם העצב האופטי וטבלו את גלגל העין בנוזל סטרילי. חטאו את גלגלי העין ב-IPVP סטרילי למשך שתי דקות.העבירו את הגלובוס לתוך תמיסת סודיום תיאוסולפט סטרילית למשך דקה אחת. העבירו את הגלובוסים לתמיסת תמיכה לתאי קו תאים בבופר פוספט סטרילי והשאירו עד למועד הביצוע. בעבודה תחת מנדף זרימה למינרית, שטפו והוציאו את גלובוס העין מה-PBS והניחו אותו תחת שדה סטרילי.עטפו את גלגל העין בבד סטרילי, תוך השארת הקרנית וכחמישה מילימטרים של הסקלרה מהקרנית חשופים; ניתן להחזיק את גלגל העין פשוט ביד. תוך שמירה על לחץ מתאים, השתמשו במספריים סטריליים כדי להסיר את כל שאריות הלחמית, מבלי לפגוע בקרנית.השתמש בלהב סקאלפל חד-פעמי כדי לבצע חתך בסיקלרה במרחק של שלושה עד ארבעה מילימטרים מאזור הלימבוס. לאחר מכן הרחב את החתך ב-360 מעלות, תוך הימנעות מניקוב רקמת הענבייה שמתחתיו או מגרימה לעיוות של קימור הקרנית התקין. בצע ארבעה חתכים גדולים המותירים ארבעה מרווחים קטנים, תוך מניעת דליפה של הגוף הזגוגית.ארבעת הפערים נגזרים, תוך הבטחה שאין הסרה של רקמה אחרת כלשהי. נוכחותם של פלאקים סקלרליים קטנים עלולה להפריע לגזירה, לכן יש לוודא את השלמת הכריתה הסקלרלית באמצעות מספרי מיקרו-כירורגיה. פעולה זו צריכה להתבצע ללא פגיעה בכורואיד, ברשתית ובגוף הזגוגית.בדקו את החתך כדי לוודא שהוא הושלם. אם החתך בוצע כראוי, השוליים הסקלרליים של הקרנית נצמדים לגוף הציליארי רק בנקודה המתאימה לקרנית; הניחו את גלגל העין במרכז השדה הסטרילי. השלימו את הסרת הקרנית באמצעות פינצטה סטרילית.החזק את שולי הלובן (sclera) ללא תזוזה והסר את שולי הקרנית והלובן הרחק מהזוהר העיני. הפר בעדינות את כל השאריות הסמוכות מכפתור הקרנית והלובן. אין למתוח את שולי הקרנית והלובן באופן שעלול לגרום למתח חוצה-קרניתי, ואין לאפשר להם לצנוח חזרה אל תוך התא הקדמי.את צפיפות התאיים האנדותליים של הקרנית בודקים באמצעות תמיסה היפוטונית, ואת תמותת התאים באמצעות צביעת trip and blue למשך כדקה אחת. מסירים את צבע ה-trip and blue באמצעות גזה סטרילית ממתכת ושוטפים את הקרנית ב-PBS סטרילי. מעבירים אותה לצלחת פטרי סטרילית מלאה בתמיסת סוכרוז.תמיסה זו מסייעת ביצירת סביבה היפוטונית ובזיהוי ויזואלי של התאים. לאחר מכן סופרים את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה של 100x ומודדים אותם כמספר תאים לממ"ר. בדרך כלל בוחנים את התאים לצורך הערכת צפיפות תאית ומאפיינים מורפולוגיים כגון גבולות בין-תאיים, פולימורפיזם, דגנרציה, דיסטרופיה ותמותת תאים.עובי הקרנית הוא מאפיין חשוב נוסף עבור השתלה, לצד דרגת שקיפות טובה של הקרנית שהוצאה. משתמשים ב-CLO קרנית סטרילי כדי לקבע את הקרנית לשולי הסקלרה, מכופפים את ה-CLO של הקרנית כדי להבטיח שפתיחת החור מספיקה לנעילת שולי הסקלרה, ומעבירים את שולי הסקלרה של הקרנית באמצעות corneal clove לתוך תווך אחסון קרנית שהוכן מראש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשמור את הקרנית ב-31 degree SIUs במהלך תקופת השימור של הקרנית הנמשכת ארבעה שבועות.תוכנית האחסון עוברת מספר בדיקות מיקרוביולוגיות באמצעות מכשיר B 9 2 4 0. מאחר שבמהלך האחסון, הקרנית הופכת לעבה יותר מגודלה הרגיל הנדרש להשתלה, בנקי קרניות משתמשים בחומרי נפיחות כדי להפחית את העובי; 6%Dextron T 500 משמש להחזרת הקרנית לגודלה הנורמלי ולתווך ההובלה.נקה את המכשירים הסטריליים באמצעות RNA app כדי ליצור סביבה נקייה מ-RA לפני חיתוך הרשתית. הכן את השטח הסטרילי וודא שגלגל העין שלם וכי רק הקרנית ושולי הסקלרה הוסרו. אם גוף הזכוכית דולף החוצה, הסרת רקמת הרשתית הופכת לקשה יותר.אם התורד מתחת לגיל 65, הלובן (sclera) נשמר ב-70% alcohol למטרות ניתוחיות לאחר בדיקות סרולוגיות. במקרים אלו, לא חותכים את הלובן, אלא מסירים רק את הגוף הזגוגית ושומרים את כל הלובן לצורך כריתת רשתית. התחילו בחתך קטן ליד הצד הקרנאלי של הלובן, והתקדמו לכיוון העצב האופטי באמצעות פינצטה ומספריים סטריליים.החזיקו את חלק הלובן (sclera) באמצעות פינצטה סטרילית וגזרו במספריים בקו ישר לכיוון העצב האופטי, חלק אחר חלק, תוך הימנעות מפגיעה בגוף הזגוגית (vitreous body). יש להפריד את פקקי הכורואיד מהלובן כיוון שהם דבוקים זה לזה. גזרו את כל הלובן כדי לחשוף את רקמת הכורואיד.מה?לאחר שהסקלרה נחתכה לחלוטין, הפרידו אותה מהרקמות הנותרות על ידי חיתוך ליד העצב האופטי; כעת תהיה גלויה שכבה שלמה של הכורואיד המכסה את הגוף הזגוגית. מלאו מבחנות סטריליות נטולות RNA ב-2 ml של תמיסת RL באמצעות שתי פינצטות סטריליות. הסירו בעדינות את שכבת הכורואיד על ידי תפיסת העצב האופטי עם זוג פינצטות אחד והסרת הכורואיד עם הזוג השני.הפרידו את הכורואיד באופן חלקי וגזרו אותו כדי להקל על הסרתו. ניתן לגזור את שכבת הכורואיד בעזרת מספריים תוך הימנעות מגרימת נזק לרשתית. הניחו את שכבת הכורואיד שהוסרה בתוך תמיסת RNA later ושמרו אותה בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך 24 שעות.הסר את כל שאריות הכורויה כדי לחשוף את רקמת הרשתית. לאחר הסרת שכבת הכורויה כולה, תיראה שכבת רשתית שקופה. ניכר כי לשכבת הכורויה יש ממברנה ברוס פנימית, אותה ניתן להסיר גם כן, אך קשה לזהותה בעין בלתי מזוינת.בדומה לכך, השתמש בשתי פינצטות כדי להסיר את שכבת הרשתית. קל לבודד כמות גדולה של רשתית אם הכריתה מבוצעת בקרבת העצב האופטי. כעת ניתן לראות את כל שכבות העין.הניחו את הרשתית החתוכה בתוך תמיסת RNA later ושמרו אותה בטמפרטורה של 4 °C למשך 24 שעות. נקו את אזור העבודה באמצעות אלכוהול איזופרופיל 70%. ניתן לצפות בתאי אנדותל שנצבעו באמצעות trypan blue תחת הגדלה של 100x של מיקרוסקופ הפוך.קרנית מתאימה עם יותר מ-200 תאים לממ"ר נשמרת בדרך כלל לשימוש עתידי. דירוגן של הקרניות, מאיכות סבירה ועד מצוינת, יסייע במחקרים השוואתיים. בדרך כלל, ברגע שהקרנית מוכנה להשתלה, נרשמים העובי והשקיפות, וקרנית מתאימה משמשת להשתלת קרנית חודרת (penetrating keratoplasty) שבה מושתלת הקרנית כולה.תמותת תאים נבדקת על ידי תצפית על תאים שנצבעו בכחול ומדורגת כאחוז התאים המתים. תמותת תאים כללית של יותר מ-2% נחשבת כבלתי מתאימה במהלך השימור. אם צפיפות התאים נמוכה מ-2200 תאים לממ"ר או שיש נזק עקב תמותה, ניתן להשתמש בקרנית לקרסטיה למינרית קדמית (anterior laminar keratoplasty).אם החלק הקדמי פגום והקרנית בעלת צפיפות תאי אנדותל טובה, ניתן להשתמש בקרנית לקרסטופלסטיה למינרית אחורית. עובי הקרנית גדל בדרך כלל במהלך תרבית איברים. תווך ההובלה מסייע להשיב לה את צורתה ומבנהה הנורמליים.בנוסף, תרבית איברים מסייעת לאפיתליזציה מחדש של הקרנית, ובשל תקופת האחסון הממושכת שלה, היא מסייעת בבחירת תורם מתאימה. בדיקות מיקרוביולוגיות וסרולוגיות. היא מעניקה מספיק זמן לארגון הניתוח ומסייעת בבדיקת צפיפות ומורפולוגיה של תאי האנדותל כאשר הדבר אינו אפשרי עקב זמן ממושך לאחר המוות.לפיכך, אם פועלים לפי הפרוצדורה המתוארת, ניתן להוציא את הקרניות ללא כל נזק לרקמות אחרות. במידה והקרנית אינה מתאימה להשתלה, ניתן להשתמש בה למטרות מחקר כדי לפתח מצעים ותנאי שימור חדשים לבחינת מחלות של פני השטח של העין, לבידוד תאי גזע לימבליים ולבחינת השפעת תרופות על הקרנית. עבור הרשתית, ניתן למנוע זיהום צולב של דגימות RNA עם רקמות סמוכות ולשמור על שלמות ה-RNA, דבר שהוא בעל חשיבות יסודית.רקמות אלו, החיוניות למטרות מחקר, נועדו לאפיון הטרנסקריפטום של רקמות העין, בידוד תאי גזע עבור פרויקטים של רפואה רגנרטיבית, והערכת הבדלים היסטולוגיים בין רקמות מנבדקים בריאים לנבדקים חולים. לאחר הסרת רקמת הרשתית, ניתן להשתמש בה למטרות שונות, ולכן השלבים הבאים והתנאים המשמשים לשימור עשויים להשתנות בהתאם. לדוגמה, ניתן להניח את רקמת הרשתית במבחנות המכילות ריאגנטים לייצוב RNA כגון r nator או thisis buffer לצורך מיצוי RNA או DNA, או ב-displaced או trypsin לצורך בידוד תאים.קיבוע של תמיסות לפני הטמעת רקמות בפרפין או ב-OCT עבור אימונוהיסטוכימיה. תודה שצפיתם בסרטון זה ובהצלחה במחקריכם.

a-simplified-technique-for-situ-excision-cornea-evisceration-retinal

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

סרטון זה מדגים שיטה לגרימת דלקת בפני השטח של העין ותפקוד לקוי של בלוטת המייבומיאן במודל מורין. גירוי המערכת החיסונית של העכבר באמצעות אימונוגן ולאחר מכן רסטימולציה עם אותו אימונוגן מקדם דלקת פני העין, הגורמת לסתימת הפרשת בלוטת המייבומיאן דרך aggNET המיוצר על ידי נויטרופילים ומובילה למחלת עין יבשה.

שיטה לגרימת דלקת פני העין במודל מורין

הסרת עיניים, המכונות גם אנוקלאציה, מספקת אסטרטגיה שימושית ללמוד היבטים של מודלי חוצי חזותיים,, ופלסטיות התפתחותית לאורך מערכת הראייה של יונקים שכן הוא גורם בלתי הפיך חלקית (משקפת) או אובדן ראייה (משקפת) מלא. כאן אנו מתארים גישה לשחזור וברורה מאוד לביצוע באנוקלאציה vivo.

שיטה מאוד לשחזור וישיר לביצוע בVivo Ocular Enucleation בעכבר לאחר פתיחת העיניים

מטרת פרוטוקול זה היא להראות טכניקה יעילה לבידוד ליבת הזגוגית וקליפת המוח השלמה והשלמה מעיני חזיר שעברו גרעין לאחר המוות.

כל הזגוגיות ההומור Dissection לניתוח Vitreodynamic

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

שינוי של מערך multielectrode קיים או ציוד מהדק תיקון עושה את ex vivo electroretinogram נגיש יותר. שיטות משופרות לתיעוד ושמירה על תגובות אור ex vivo מקלות על חקר תפקוד התאים הפוטורצפטורים וה-ON-דו-קוטביים ברשתית הבריאה, מודלים של בעלי חיים של מחלות עיניים ורשתיות של תורמים אנושיים.

אופטימיזציה של ההגדרה והתנאים עבור אלקטרורטינוגרמה של Ex Vivo כדי לחקור את תפקוד הרשתית בעיניים קטנות וגדולות

פרוטוקול זה מציג ומתאר שלבים לבידוד, דיסקציה, התרבות והכתמה של צמחי רשתית המתקבלים מעכבר בוגר. שיטה זו מועילה כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות שונות ברשתית כגון רטינופתיה סוכרתית.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה עינית במכרסמים. התהליך כולל את האינקולציה של גלגל העין יחד עם הממברנה הניקטיבית (כלומר, העפעף השלישי). לאחר מכן מתבצעת הפרדה של המשקפיים האחוריים והקדמיים.

מיקרודיסקציה של עין המכרסם

אנו מתארים שיטה להפרדה יעילה של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מהרשתית בעיניים אנושיות ויצירת שטוחים שלמים של RPE/כורואידים לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומורפומטריים של ה-RPE.

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לבידוד הרשתית מעין העכבר לניסויים ממושכים ex vivo . פרוטוקול זה מדגיש את הנגשת הגישה התובענית מבחינה טכנית לחוקרים המעוניינים לנצל את דרכי המחקר הניתנות על ידי שמירה על גליה ברשתית באתרה ברקמה חיה.

מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר

למד טכניקה פשוטה לכריתת קרנית והוצאת רשתית מגלוב עיניים אנושי לשימוש בהשתלות ומחקר. השיטה שומרת על איכות הרקמות ומונעת נזק למבנים סמוכים לאחר 18 שנות ניסיון.

טכניקה פשוטה עבור

גלה סרטונים נוספים