התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשרות EAE באופן עקבי וקל בכל זן של עכבר, כולל אלו הנחשבים לעמידים להשראת EAE. דבר זה מושג תחילה על ידי חיסון עכברי תורם בחלבונים ספציפיים למיאלין או באנטיגנים פפטידיים, שהגבישו בתוך complete frend adjuvant. כעבור 10 ימים, מבודדים את קשרי הלימפה מעכברי התורם, ותאי קשרי הלימפה מעוררים מחדש in vitro על ידי גידולם עם אותו אנטיגן למשך ארבעה עד חמישה ימים.

לאחר מכן, התאים מועברים באופן אדופטיבי לעכברים נאיביים מקבלים. זנים רגישים של עכברים יפתחו EAE תוך שמונה עד 14 ימים כדי לעורר EAE בזן עמיד. 14 ימים לאחר ההעברה האדופטיבית, העכברים המקבלים חוסנו עם אנטיגן ב-CFA.

באמצעות שיטה זו, ניתן להשרות EAE בזני עכברים עמידים. היתרון המרכזי של פרוטוקול ההעברה האדפטיבית והאתגר להשראת EAE הוא שהוא מאפשר השראה אמינה של המחלה. לעיתים רחוקות אנו נתקלים בפחות מ-100% מחלה קלינית.

ניתן להתאים את הפרוטוקול להשראת המחלה וזנים של עכברים הרגישים לה, אך חשוב מכך, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשריץ EAE בזנים רבים של עכברים שנחשבו בעבר כעמידים למחלה. הדגמת הפרוטוקול. היום איתנו עמית המחקר הראשי שלנו, cha ching.

התחילו בהכנת תמיסה של MBP בריכוז 2 mg/mL ב-PBS. השתמשו במזרק זכוכית מטוחק המצויד ב-lure lock כדי לשאוב 100 µL מתמיסת האנטיגן עבור כל עכבר המיועד לחיסון.

באמצעות מזרק נפרד, אספו נפח שווה של complete Freud's adjuvant H 37 ra. לאחר מכן, בעזרת ברז תלת-כיווני (three-way stopcock), חברו את שני המזרקים ודחפו את הבוכנות הלוך וחזור כדי לערבב את האנטיגן והעזר (adjuvant) עד להיווצרות אמולסיה. כדי לוודא שהדבר אכן קרה, העבירו את התמיסה לאחד המזרקים ונתקו את המזרק הריק.

משכו מעט אחורה את הבוכנה של המזרקים הריקים, ולאחר מכן פרוקו טיפה מהתערובת השארית לתוך כוס כימית המכילה מים נקיים בטמפרטורת החדר. אם הטיפה מתפזרת, חברו מחדש את המזרקים והמשיכו בערבוב. אם הטיפה נשארת שלמה ואמולסיה נוצרה, חזרו על הבדיקה כדי לאסוף את האמולסיה.

עבור החסנה. חברו מזרק פלסטיק של 1 ml למזרק זכוכית שהוסר ממנו הבוכנה. העבירו בזהירות את התמיסה למזרק הפלסטיק, עד למילויו עד השפה.

לאחר מכן, הכניסו את הבוכנה מפלסטיק והוציאו מעט מהאמולסיה כך שיישארו בדיוק 1.2 milliliters. לא צריכות להיות בועות אוויר כלואות במזרק. אם הליך זה מבוצע נכון.

נתק את המזרק מפלסטיק. חבר אליו מחט בכיול 26 gauge ומלא את נפח המתאי של המחט על ידי דחיפת הבוכנה עד לסימון של one milliliter. אחז את העכבר בחוזקה והרחק את הזנב לאחור בין האצבע הטבעתית לזרת, כך שבית החזה והבטן יהיו נגישים בקלות. תת-עורית.

הזריקו 50 µL של אמולסיה לחזה, ממש מעל בית השחי הימני. אם ההזרקה בוצעה כהלכה, תיראה בליטה לבנה קטנה באתר ההזרקה. חזרו על הפעולה מעל בית השחי השמאלי, לאחר מכן שחררו את הזנב ואחזו ברגל ימין, כך שצדו הימני של העכבר יהיה חשוף.

הזריק 50 µL מהתמיסה ממש מתחת לבית החזה. שחרר את כף הרגל הימנית. הפנה את העכבר לצד השני וחזור על ההזרקה בצד שמאל.

שבעה עד 10 ימים לאחר החיסון. קצרו את קשרי הלימפה מבעלי החיים שהורדמו. ראשית, הניחו את העכבר על גבו כאשר גפיו פרושות ומקובעות ללוח הניתוח באמצעות סיכות.

רסס את העכבר באתנול. לאחר מכן, באמצעות כלים סטריליים, בצע חתך אורכי בעור העכבר מהבטן התחתונה ועד לסנטר.

בצעו חתך נוסף מהבטן ומטה לאורך אחת הרגליים, ולאחר מכן לאורך הרגל השנייה. קלפו את העור מהעכבר והצמידו אותו ללוח הניסוח באמצעות סיכות.

חתכו גם את העור לאורך ארבע הגפיים. לאחר מכן קלפו והדקו את החלק העליון של פתיתי העור בעזרת סיכות משני הצדדים; קשרי הלימפה המפשריים והבטים, הנמצאים בדרך כלל קרוב למפשעה או לבית השחי, אמורים להיראות כגושים עכורים קטנים ישירות מתחת לעור. השתמשו בשני פינצטות עדינות כדי להסיר בעדינות את רקמת החיבור שמעל קשר הלימפה הראשון.

יש להקפיד על אי-פגיעה בכלי דם במהלך התהליך. לאחר שרקמת החיבור פונתה, יש להניח זוג פינצטות מתחת לקשרי הלימפה ולמשוך אותו הרחק מהגוף. העבירו את קשרי הלימפה לצלוחית פטרי של 35 מילימטר המכילה PBS סטרילי, ואספו את שלושת קשרי הלימפה האחרים באותו אופן.

לאחר שכל קשרי הלימפה נאספו, העבירו את צלחת הפטרי למנדף ביולוגי. בעזרת גב של בוכנה של מזרק סטרילי, הומוגניזו את קשרי הלימפה כדי לשחרר את התאים. כדי להסיר את השאריות, סננו את התו suspension דרך רשת ניילון אל תוך מבחנה קונית.

לאחר מכן, השלימו את הנפח ל-50 milliliters באמצעות PBS סטרילי וסבבו את התאים בצנטריפוגה למשך 10 דקות. לאחר הסבוב, השהו את התאים שוב בנפח קטן של מצע תרבית תאים שחומם מראש וספרו את התאים החיוניים. כווננו את הריכוז ל-four times 10 to the six תאים ל-milliliter.

לאחר מכן, זרעו את התאים בריכוז של שני מיליליטר לבאר בלוחית 24 בארות. הוסיפו אנטיגן MVP לכל באר כך שיתקבל ריכוז סופי של 100 micrograms per milliliter. לאחר הוספת האנטיגן.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך חמישה ימים. לאחר שהתאים עברו גירוי מחדש, אספו אותם על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה והעבירו אותם לשפופרת קונית של 50 mL. סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך 10 דקות ותלו את המשקע בנפח קטן של PBS סטרילי.

לאחר מכן ספרו את התאים והתאימו את ריכוז התאים החיים ל-2.5 times 10 to the eighth תאים למיליליטר באמצעות PBS. שאבו את התאים למזרק והרכיבו עליו מחט בנפח 26 gauge כדי לבצע את ההעברה האדופטיבית (adoptive transfer). מזריקו 0.2 מיליליטר של תאים באופן תוורידי לזנב של כל עכבר כדי לאתגר עכברים עמידים שבועיים לאחר ההעברה האדופטיבית.

הזריקו לבעלי החיים 200 micrograms של אנטיגן בנפח של 200 microliters של אמולסיה, באותה דרך שבה בוצעה החסנה של עכברי התורם. שבעה עד 10 ימים לאחר החשיפה, תתפתח מחלה שיתוקית וניתן יהיה לעקוב אחר התקדמותה. המחלה מתחילה בחולשה בזנב.

כאשר הזנב רפוי, המחלה מדורגת בדרגה אחת. דרגה שתיים נקבעת אם העכבר מפתח שיתוק בגפה אחורית אחת, ודרגה שלוש אם שתי הגפיים האחוריות משותקות. דרגה ארבע נקבעת כאשר שתי הגפיים הקדמיות משותקות.

בדרגה חמש, העכבר שכיח יותר. ובדרגה שש, העכבר מת. כפי שמוצג כאן, שבעה עד 14 ימים לאחר ההשראה, העכברים יפתחו מחלה פראליטית מונופאזית, אותה ניתן לדרג באמצעות קריטריוני EAE הקלאסיים.

בעוד שהעכברים עשויים להחלים, הם לא יחוו התלקחות ספונטנית של המחלה. השראת המחלה דורשת חשיפה מאתגרת לאנטיגן ספציפי. חשיפה ל-CFA לבדו או לאנטיגן לא רלוונטי אינה גורמת להופעת המחלה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של שיטת ההעברה האדופטיבית (adoptive transfer) והאתגר להשראת EAE. על ידי שילוב של העברה אדופטיבית של תאי קשרי לימפה ספציפיים לאנטיגן יחד עם אתגר אנטיגני מחזק, ניתן להשריץ EAE בקלות בכל זן של עכבר. שיטה זו מאפשרת לנו להתגבר על מנגנוני העמידות הגלומים בחלק מזני העכברים, ובכך מאפשרת את חקר העמידות למחלה.

ניתן להתאים טכניקה זו בקלות לחקר כל תהליך של מחלה אוטואימונית.