התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני
April 9th, 2012
זנים מסוימים עכבר מסוגלים לעמוד בפני גיוס של Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) עם חלבון המיאלין הבסיסי. המתואר כאן הוא פרוטוקול חיסון פשוט הופך את חוסר התגובה וגורם למחלת שיתוק בכמה כתמים אופייניים EAE עכבר עמידים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום ל-EAE באופן עקבי וקל בכל זן עכברים, כולל אלה הנחשבים עמידים בפני השראת EAE. זה מושג על ידי חיסון ראשון של עכברים תורמים עם חלבונים ספציפיים למיאלין או אנטיגנים פפטידיים, מתחלבים באדג'ובנט fres שלם. 10 ימים לאחר מכן, בלוטות הלימפה מהעכברים התורמים מבודדות ותאי בלוטות הלימפה מגורים מחדש במבחנה על ידי תרבית עם אותו אנטיגן למשך ארבעה עד חמישה ימים.
לאחר מכן התאים מועברים באימוץ לעכברים נאיביים נאיביים. זני עכברים רגישים יפתחו EAE תוך שמונה עד 14 ימים כדי להפעיל EAE בזן עמיד. 14 יום לאחר ההעברה לאימוץ, העכברים המקבלים חוסנו באנטיגן ב-CFA.
באמצעות שיטה זו, ניתן לגרום ל-EAE בזני עכברים עמידים. היתרון העיקרי של פרוטוקול ההעברה והאתגר האדפטיבי לגרימת EAE הוא שהוא מאפשר השראת מחלה אמינה. לעתים רחוקות אנו רואים פחות מ-100% מחלה קלינית.
אנו יכולים להתאים את הפרוטוקול לגרימת מחלות וזני עכברים רגישים, אך חשוב מכך, אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי לגרום ל-EAE בזני עכברים רבים שנחשבו בעבר עמידים למחלות. הדגמת הנהלים. היום הוא עמית המחקר הראשי שלנו, צ'ה צ'ינג.
התחל בהכנת תמיסה של שני מיליגרם למיליליטר של MBP. ב-PBS. השתמש במזרק זכוכית טחון המצויד במנעול פיתוי כדי לשאוב 100 מיקרוליטר של תמיסת אנטיגן לכל עכבר כדי להתחסן.
בעזרת מזרק נפרד, אספו נפח שווה של האדג'ובנט השלם של פרויד H 37 ra. לאחר מכן בעזרת תא עצירה תלת-כיווני, חבר את שני המזרקים ודחף את הבוכנות קדימה ואחורה כדי לערבב את האנטיגן והאדג'ובנט עד שנוצר תחליב. כדי לוודא שזה המקרה, העבירו את התמיסה לאחד המזרקים ונתק את הריק.
משוך את המזרקים הריקים לצלול מעט לאחור, ואז שחרר טיפה מהתערובת הנותרת לכוס מים נקיים בטמפרטורת החדר. אם הטיפה מתפזרת, חבר מחדש את המזרקים והמשיך לערבב. חזור על הבדיקה אם הטיפה נשארת שלמה ונוצר תחליב לאיסוף תחליב.
לחיסון. חבר מזרק פלסטיק של מיליליטר אחד למזרק הזכוכית שהבוכנה שלו הוסרה. העבירו בזהירות את התמיסה למזרק הפלסטיק ומלאו אותה עד לשפה.
לאחר מכן הכנס את בוכנת הפלסטיק והוציא מעט תחליב כך שיישארו בדיוק 1.2 מיליליטר. לא אמורות להיות בועות אוויר כלואות במזרק. אם הליך זה מבוצע כהלכה.
נתק את מזרק הפלסטיק. התקן אותו עם מחט בגודל 26 ומלא את נפח ריק המחט על ידי דחיפת הבוכנה לסימון מיליליטר אחד. קשקש את העכבר בחוזקה והחזק את הזנב לאחור בין הקמיצה לזרת כך שבית החזה והבטן יהיו נגישים בקלות. תת עורית.
הזרקו 50 מיקרוליטר של תחליב בבית החזה ממש מעל בית השחי הימני. אם ההזרקה מתבצעת כהלכה, מעט בליטה לבנה תיראה במקום ההזרקה. חזור על ההליך מעל בית השחי השמאלי, ואז שחרר את הזנב ואחז ברגל ימין, וחשוף את האגף הימני של העכבר.
הזריק 50 מיקרוליטר תמיסה ממש מתחת לכלוב הצלעות. שחררו את רגל ימין. סובב את העכבר לכיוון השני וחזור על ההזרקה בצד שמאל.
שבעה עד 10 ימים לאחר החיסון. קצור את בלוטות הלימפה מבעלי חיים שהומתו. ראשית הניחו את העכבר על גבו כשגפיו מתוחות ומאובטחות ללוח החיתוך בעזרת סיכות.
מרססים את העכבר באתנול. ואז שימוש בכלים סטריליים. חותכים חתך אורכי בעור העכבר מהבטן התחתונה ועד הסנטר.
בצע חתך נוסף מהבטן במורד רגל אחת. ואז במורד השני. קלף את העור מהעכבר והצמד אותו ללוח החיתוך.
חותכים גם את העור לאורך ארבע הגפיים. לאחר מכן מקלפים ומאבטחים את החלק העליון של דשי העור בעזרת סיכות משני הצדדים, בלוטות הלימפה המפשעתיות ובית השחי, הקרובות בדרך כלל למפשעה או לבתי השחי, צריכות להיות גלויות כגושים אטומים קטנים ישירות מתחת לעור. השתמש בשני מלקחיים עדינים כדי להסיר בעדינות את רקמת החיבור מעל בלוטת הלימפה הראשונה.
הקפדה לא לשבש את כלי הדם בתהליך. לאחר ניקוי רקמת החיבור, הניחו זוג מלקחיים אחד מתחת לבלוטת הלימפה ומשכו אותו מהגוף. העבירו את בלוטת הלימפה לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה PBS סטרילי וקצרו את שלוש בלוטות הלימפה האחרות באותו אופן.
לאחר שנקטפו כל בלוטות הלימפה, העבירו את צלחת הפטרי למכסה המנוע. שימוש בחלק האחורי של בוכנת מזרק סטרילית. הומוגניזציה של בלוטות הלימפה כדי לשחרר את התאים כדי להסיר את הפסולת, לסנן את המתלה דרך רשת ניילון לצינור חרוטי.
לאחר מכן התאם את עוצמת הקול ל -50 מיליליטר עם PBS סטרילי וצנטריפוגה את התאים למשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את התאים בנפח קטן של מדיום תרבית תאים חם מראש וספרו את התאים הקיימאים. התאם את הריכוז לארבע פעמים 10 לששת התאים למיליליטר.
לאחר מכן צלחו את התאים בשני מיליליטר לבאר בצלחת של 24 בארות. הוסף אנטיגן MVP לכל באר כדי לקבל ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר הוספת האנטיגן.
דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. לאחר גירוי התאים, קצרו אותם על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה והעבירו אותם לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים ב-1000 סל"ד למשך 10 דקות והשעיית הגלולה לנפח קטן של PBS סטרילי.
לאחר מכן ספור את התאים והתאם את ריכוז התאים הקיים ל -2.5 כפול 10 עד התאים השמיני למיליליטר עם PBS. משוך את התאים למזרק והתאם אותו עם מחט בגודל 26 כדי לבצע את ההעברה לאימוץ. הזרקו 0.2 מיליליטר תאים לווריד בזנב של כל עכבר כדי לאתגר עכברים עמידים לשבועות לאחר ההעברה לאימוץ.
להזריק לבעלי החיים 200 מיקרוגרם אנטיגן בנפח של 200 מיקרוליטר תחליב באותו אופן שבו בוצע חיסון של עכברים תורמים. שבעה עד עשרה ימים לאחר האתגר תתפתח מחלה משותקת וניתן לעקוב אחר התקדמותה. מחלה מתחילה בחולשה בזנב.
כאשר הזנב רפוי, המחלה מדורגת, מחלה אחת מדורגת. שתיים, אם העכבר מפתח שיתוק בגפה אחורית אחת, ושלוש, אם שתי הגפיים האחוריות משותקות. דרגה רביעית היא כאשר שתי הגפיים הקדמיות משותקות.
בכיתה ה', העכבר נפוץ יותר. ובכיתה ו', העכבר מת. כפי שמוצג כאן, שבעה עד 14 ימים לאחר האתגר, עכברים יפתחו מחלת שיתוק חד-פאזית, שניתן לדרג באמצעות הקריטריונים הקלאסיים של EAE.
בעוד שהעכברים עשויים להתאושש, הם לא יחזרו באופן ספונטני. השראת מחלה דורשת אתגר ספציפי לאנטיגן. אתגר עם CFA בלבד או אנטיגן לא רלוונטי לא מצליח לעורר מחלה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את שיטת ההעברה לאימוץ ואתגר לגרימת EAE. על ידי שילוב של העברה אדפטיבית של תאי בלוטות לימפה ספציפיים לאנטיגן עם אתגר אנטיגני מגביר את האתגר, ניתן לגרום בקלות ל-EAE בכל זן עכבר. שיטה זו מאפשרת לנו להתגבר על מנגנוני העמידות הטמונים בזני עכברים מסוימים, ולכן מאפשרת לחקור עמידות למחלות. גם.
יש להתאים את הטכניקה הזו בקלות כדי לחקור כל תהליך של מחלה אוטואימונית.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר פרוטוקול לגרימת דלקת המוח והחוט השדרתי האוטואימונית הניסיונית (EAE) בזני עכברים שבדרך כלל עמידים. השיטה כוללת חיסון עכברי תורם עם חלבונים ספציפיים למיאלין והעברת תאי קשר לימפה לעכברי קבלן תמימים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- אוטואימוניות
רקע
- דלקת המוח והחוט השדרתי האוטואימונית הניסיונית (EAE) היא מודל לחקר טרשת נפוצה.
- חלק מעכברי זן מראים עמידות לגרימת EAE.
- הבנת גרימת EAE יכולה לסייע במחקר על מחלות אוטואימוניות.
- חלבון בסיסי של מיאלין הוא אנטיגן מרכזי במחקרי EAE.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לגרימת EAE בזני עכברים עמידים.
- לחקור את המנגנונים האימונולוגיים שמאחורי הרגישות ל-EAE.
- להקל על מחקר על תגובות אוטואימוניות ברקע גנטי שונה.
שיטות ששימשו
- חיסון עכברי תורם עם חלבוני מיאלין בתמיסה מלאה של אדג'ובנט של פרויד.
- בידוד קשרי לימפה מעכברי תורם מחוסנים לאחר 10 ימים.
- גירוי מחדש in vitro של תאי קשר לימפה עם אותו אנטיגן.
- העברה מאומצת של תאים מגורים לעכברי קבלן תמימים.
תוצאות עיקריות
- זני עכברים רגישים פיתחו EAE תוך 8 עד 14 יום לאחר ההעברה.
- גרימת EAE בזנים עמידים הושגה בהצלחה.
- הפרוטוקול מספק שיטה עקבית לגרימת EAE.
- התוצאות תורמות להבנת התגובה החיסונית ב-EAE.
מסקנות
- פרוטוקול החיסון המתואר גורם ביעילות ל-EAE בזני עכברים עמידים.
- שיטה זו יכולה לשמש לחקר מנגנוני מחלות אוטואימוניות.
- מחקר עתידי יכול לבנות על פרוטוקול זה כדי לחקור התערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Reliable induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in genetically resistant mouse strains enables robust modeling of central nervous system autoimmunity for early-stage drug discovery. This adoptive transfer and antigenic challenge protocol overcomes biological resistance barriers, supporting mechanistic de-risking and target validation in preclinical neuroimmunology pipelines. The approach enhances predictive confidence for translational research in multiple sclerosis and related autoimmune disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of autoimmune disease mechanisms in previously inaccessible genetic backgrounds.
- Supports functional validation of immune targets by inducing disease in resistant strains.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the role of antigen-specific T cells in disease onset.
- Improves predictive confidence for target selection in neuroinflammatory pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible model for evaluating immunomodulatory compounds.
- Enables quantitative grading of disease progression for assay readouts.
- Supports scalability and platform reuse across diverse mouse strains.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease heterogeneity by overcoming genetic resistance.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation in neuroimmunology.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling disease in multiple genetic contexts.
- Provides a foundation for translational biomarker exploration in CNS autoimmunity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling EAE induction in resistant strains, supporting lead identification and mechanistic studies in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on immune cell involvement and disease triggers.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative disease grading for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of disease incidence and severity across conditions.
- Translational Research: Models genetic diversity relevant to human autoimmune disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for autoimmune disease modeling across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes disease induction and grading for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroimmunology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, animal handling, and adoptive cell transfer techniques.
- Needs access to cell culture, animal facilities, and quantitative disease scoring infrastructure.
- Demands cross-team standardization of antigen preparation and disease grading protocols.
- Adaptation may be needed for different antigens or autoimmune disease models.
- Practical limitations include the need for precise timing and dose control in antigenic challenge.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Preparing CFA-emulsified Antigen
3:08
Immunization of Donor Mice
3:51
Isolation of Lymph Node Cells after Immunization and Re-stimulation with Antigen
6:07
Harvest of Re-stimulated Lymph Node Cells and Adoptive Transfer
6:47
Antigenic Challenge of Recipient Mice and Development of Disease
7:31
Results: Kinetics of Disease Progression Following Immunization, Adoptive Transfer and Challenge
7:58
Conclusion
