התקני microfluidic פשוטים עבור

שלום, אני שמאל, פוסט-דוקטורנט במעבדה של TUR Kika במרכז הלאומי למדעי הביולוגיה בהודו. בסרטון זה אראה לכם כיצד לייצר התקני מיקרו-פלואידיקה ביולוגית באמצעות טכניקות של ליתוגרפיה רכה בסביבת מעבדה רגילה. אשתמש בהתקנים אלו לצילום תאי ותת-תאי ברזולוציה גבוהה של אורגניזמים מודליים גנטיים.

פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לבצע הדמיה זו במרווחי זמן (time lapse imaging) באורגניזמים שלמים ללא הרדמה. אז בואו נתחיל. פיתחנו התקן מיקרופוני פשוט לביצוע הדמיה in vivo ללא הרדמה של אורגניזמי מודל גנטיים כגון *C. elegans*, זבוב דרוסופילה (*D. melanogaster*) ודגי זברה.

במחקר זה, אנו מדגימים התקן למובליזציה שקופה מבוסס ממברנה, שיוצר באמצעות יציקה רכה של PDMS. כדי לקבע אורגניזם בודד, אנו מאתרים חיה בודדת תחת מיקרוסקופ סטריאו ולוכדים אותה באמצעות טיפה קטנה של תמיסת בופר בעזרת מיקרופיפט, מ memasים את החיה הבודדת לתוך תעלת הזרימה ומקבעים אותה תחת ממברנת ה-PTMS. זאת באמצעות חיבור גז חנקן בלחץ דרך שסתום כדורי תלת-כיווני.

תכננו את מבני המיקרו-פלואידיקה באמצעות תוכנת שרטוט. נקו פרוסות סיליקון בגודל שני סנטימטר על שני סנטימטר ב-20% KOH למשך דקה אחת ושטפו במים מזוקקים (di water). ייבשו את החלקים באמצעות גז חנקן ובצעו דהידרציה ב-122 Celsius למשך ארבע שעות.

בצעו ציפוי סיבוב (Spin-coating) של hexa metal על חלקי סיליקון במהירות של 500 RPM למשך חמש שניות ו-3000 RPM למשך 30 שניות. בצעו ציפוי סיבוב של SU 8 2 0 2 5 על פרוסות סיליקון במהירות של 500 RPM למשך חמש שניות ו-2000 RPM למשך 30 שניות. בצעו אפייה רכה (Soft bake) לחלקי הסיליקון המצופים בטמפרטורה של 65 °C למשך דקה אחת ובטמפרטורה של 95 °C למשך 10 דקות.

חשפו את פרוסות הסיליקון (wafers) המצופות ב-SU-8 לאחר אפייה למנורת UV בהספק של 200 watt דרך הפוטו-מסכה עבור עיצוב 1 ועיצוב 2, עבור שכבת זרימה ושכבת בקרה בהתאמה. בצעו אפייה לאחר החשיפה (post bake) לפרוסות בטמפרטורה של 65 °C למשך דקה אחת ו-95 °C למשך 10 דקות. פתחו את החלקים באמצעות תמיסת פיתוח SUA למשך 20 דקות.

קודדו את החלקים באמצעות אדי tri chloro per fluoro CET seline במייבש למשך שעתיים. ערבבו את בסיס ה-poly dyl xox ואת סוכן ההקשחה ביחס של 10 ל-1 לפי משקל. בצעו דגזציה לתערובת כדי להסיר את כל בועות האוויר שנוצרו במהלך הערבוב.

שפכו תערובת PDMS בעובי של 5 מילימטרים על גבי פרוסות סיליקון עם תבנית משקל SC של העיצוב. עשו זאת בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. בצעו ציפוי סבב (Spin coat) כדי ליצור שכבה אחידה של PDMS על פרוסות הסיליקון עם העיצוב עבור שכבת הזרימה, במהירות של 500 RPM למשך 5 שניות, ולאחר מכן במהירות של 1500 RPM למשך 30 שניות.

חממו בתנור את שני החלקים של עיצוב אחד ועיצוב שתיים המכילים PDMS בטמפרטורה של 50 °C למשך שש שעות. גזרו את חלק ה-PDMS מהמצע של הסיליקון באמצעות להב משני המכיל את תבנית SCH שתיים. נקבו חור קטן בחלק העליון של המאגר המחבר את המלכודת הראשית בתבנית ה-PDMS.

השתמשו במחט בעלת קוטר מקסימלי או במחט 18 gauge. חשפו את פני השטח התחתונים של שכבת הבקרה ואת פני השטח העליונים של שכבת הזרימה לפלזמה של אוויר ב-18 wat למשך שתי דקות. הצמידו את שני פני השטח שעברו טיפול בפלזמה בעזרת לחץ עדין, ובקלו אותם בטמפרטורה של 50 °C למשך שעתיים.

גזרו את המכשירים המחוברים ממצע הסיליקון באמצעות תכנון SUH 1 ונקבו חורי גישה במאגרי הכניסה והיציאה של תעלת הזרימה. חשפו את שכבת ה-PD התחתונה של המכשיר ואת כיסוי הזכוכית הנקי. חשפו לפלזמה של אוויר במתח של 18 volt למשך שתי דקות.

הניחו את שני המשטחים שעברו טיפול בפלסמה בלחץ עדין ואפו בטמפרטורה של 50 °C למשך שעתיים. אחסנו את המכשיר בסביבה נקייה לשימוש עתידי. לאחר ייצור המכשירים, אראה לכם כיצד להשתמש בממברנת PDMS כדי להטמיע c elegans בתוך המכשיר. חברו קצה אחד של צינור microflex לווסת אספקת גז חנקן בלחץ, ואת הקצה השני למאגר המלכודת הראשי באמצעות מחט gauge 18.

ברז תלת-דרכי המשמש במרכז חיבור הפיתול מאפשר הפעלת או שחרור של הלחץ על הממברנה. מלאו את הפיתול המחובר למכשיר ה-PDMS בעמוד של 10 סנטימטרים של מים מזוקקים לפני חיבורו למאגר של המלכודת הראשית. פתחו את שסתום אספקת החנקן כדי להגיע ללחץ ה-PSI הרצוי, ועקבו אחר התכופפות הממברנה של המלכודת הראשית לכיוון תעלת הזרימה תחת הגדלה נמוכה של מיקרוסקופ הפוך.

שחררו את ברז התלת-דרך והניחו את הממברנה במצב מנוחה. מלאו את תעלת הזרימה בבופר למשך 10 דקות. לפני תחילת הניסוי, אתרו פרט בודד של *S. elegans* באמצעות מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה נמוכה.

שאבו בעל חיים בודד באמצעות נפח קטן של תמיסת בופר לתוך טיפ מיקרו. דחפו את הפרט הבודד דרך כניסת תעלת הזרימה. כווננו את לחץ השאיבה כדי למקם את בעל החיים הבודד מתחת למלכודת הראשית.

העלה את הלחץ של ממבנה ה-PDMS באיטיות כדי למקם את בעל החיים כנגד גבול התעלה וקבע אותו במקומו באמצעות לחץ של 7 עד 14 PSI. השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדרות הרצויות להדמיה ברזולוציה גבוהה של מילוי ימין או פלואורסצנציה. רכוש תמונות פלואורסצנציה בודדות או תמונות פלואורסצנציה עם תזמון בקצב פריימים שנקבע מראש בזמן אמת.

שחרר את לחץ המלכודת ועקוב אחר התנהגות התנועה של בעל החיים. במשך חמש דקות בהגדלה נמוכה, שטוף את בעל החיים והכנס בעל חיים חדש. כדי לחזור על שלבי ה-DevOp, השתמש בקצה מיקרופיפט חתוך כדי לאסוף זחלי oph בודדים והכנס אותם למכשיר המיקרו-פרירי (micro ferric device) בגודל הגדול יותר.

דחפו את הזחל הבודד דרך פתח הכניסה של תעלת הזרימה. הגבירו את הלחץ של ממбраסת ה-PDMS לאט וקבעו אותו בעזרת שבעה ESI pressure. השתמשו במיקרוסקופ הפוך להדמיה פלואורסצנטית בהגדלה נמוכה, ורכשו תמונות פלואורסצנציה בשיטת time lapse לצורך הדמיית ההובלה.

שחרר את לחץ המלכודת ועקוב אחר התנהגות התנועה של הזחל בהגדלה נמוכה. השתמש באותו עיקרון מכשיר כדי להקפיא את התנועה ולרכוש תמונות של צילום רצף (time lapse) של דגי זאברה 30 שעות לאחר ההפריה. Val heart.

לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו לייצר התקני מיקרו דומים במעבדה שלכם ולהשתמש בהם בהצלחה לקיבוע אורגניזמים לצורך ניסויים מדהימים ברזולוציה גבוהה. תודה שצפיתם בסרטון ובהצלחה בניסויים שלכם.