מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני

מטרת הליך זה היא למדוד את ההובלה ההפוכה של דופמין בנוירון מהודק מתח באמצעות מהדק תיקון ופירומטריה בו זמנית למדידת שחרור D בתיווך RAT. זה מושג על ידי בדיקה ראשונה של תקינות האלקטרודה הפירומטרית עם דופמין. השלב השני הוא למקם את האלקטרודה הפירומטרית ליד התא ולהשיג טלאי תא שלם של הנוירון עם פיפטת תיקון.

לאחר מכן, המתח של התא נשלט באמצעות פיפטת התיקון והדופמין המתווך DAT המשתחרר על ידי התא נרשם באמצעות אלקטרודה פירומטרית בו זמנית. השלב האחרון הוא להוסיף את חוסם ה- DAT ולתעד שוב את כל זרמי התא והפירומטריה כדי לאפשר להפחית את הזרם המתווך במיוחד על ידי טרנספורטר הדופמין. המשמעות של טכניקה זו היא היכולת למדוד הובלה הפוכה של דופמין דרך טרנספורטר הדופמין ובמקביל לשלוט במתח של הנוירון הדופמינרגי

מהדק התיקון ומערכת הקלטת הברומטריה בו זמנית דורשים מיקרוסקופ הפוך עם אופטיקת DIC מצוינת ועדשה למרחקי עבודה ארוכים כדי ליצור מקור אור DC למערכת. עם רעש חשמלי נמוך, חבר את מגדלור המיקרוסקופ למצבר לרכב. נעשה שימוש במניפולטורים המיקרו ההידראוליים מכיוון שהם אינם תורמים באופן ניכר לרמות הרעש בתצורה שלנו.

מניפולטור ימני משמש למהדק המתח, הקלטת תא שלם והמניפולטור השמאלי לפירומטריה. כדי להכין את האלקטרודה להקלטה סיטונאית, משוך פיפטה קוורץ עם חולץ P 2000. בדרך כלל, אנו משתמשים בפיפטה עם התנגדות של שלושה עד ארבעה מגה אוהם.

לאחר מכן, מלאו את האלקטרודה בתמיסת הפיפטה המכילה דופמין מילי-מולרי אחד. לאחר מכן הרכיב אותו על מחזיק הפיפטה במניפולטור הימני. הקפידו לעטוף את המיכל המכיל את תמיסת הפיפטה המכילה דופמין בנייר אלומיניום ולשמור אותו על קרח כאשר הוא אינו בשימוש.

מכיוון שדופמין ניתן לחמצון, שמירה על התמיסה על קרח ומוגנת מפני אור תפחית את קצב החמצון. השחילו את חוט הכסף לתוך מחזיק האלקטרודה, ולאחר מכן השחילו את המתאם הפרמטרי am על מחזיק האלקטרודה. לאחר מכן, מלאו את האלקטרודה הטריקית במספיק כספית כדי ליצור קשר עם חוט הכסף.

כאשר האלקטרודה מותקנת על המתאם, הקפד לבדוק את סיבי הפחמן והאלקטרודה הפרמטרית pro CFE עם רעש נמוך מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהקצה נקי ושלם. הקפד להחזיק את הקצה הרחוק של סיבי הפחמן על מנת להגן על קצה סיבי הפחמן מפני נזק. לאחר מכן הרכיב את האלקטרודה pro CFE Tric.

לאחר מכן הרכיב את האלקטרודה המורכבת על המניפולטור ההידראולי השמאלי כדי לבחון את תקינות האלקטרודה הטרית. הורד אותו לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית המכילה את התמיסה החיצונית. רשום את זרם הבסיס בהיעדר דופמין.

לאחר מכן הוסיפו למנה 10 מיקרוליטר של תמיסת דופמין מילי-מולרית אחת. אלקטרודה מטרית טובה אמורה לרשום עלייה בזרם החמצון. הקפד לבדוק את תקינות האלקטרודה המטרית לפני ואחרי הניסויים.

בהליך זה, אחזר את תאי העצב או התאים של הדופמין שהונדסו לבטא טרנספורטר דופמין המונח בצלחת פטרי בתחתית הזכוכית מהאינקובטור. שטפו בעדינות את התאים או נוירוני הדופמין שלוש פעמים בתמיסה חיצונית חמה. כדי לדמיין את התאים ולבצע את הניסוי, הרכיבו את צלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית על במת המיקרוסקופ ומצאו את נקודת המוקד הנכונה כדי לדמיין את התאים בבירור.

לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי על אלקטרודת התיקון. בעזרת מזרק של מיליליטר אחד, הורידו בעדינות את שתי האלקטרודות לתמיסה וקרבו את התא בעזרת המניפולטורים המיקרו. לאחר מכן מקם את האלקטרודה המטרית בצד שמאל של התא ואת אלקטרודת התיקון בצד ימין.

כאשר אלקטרודת התיקון נוגעת בתא. הפעל יניקה קלה דרך הפה או המזרק כדי ליצור חותם ג'יגה על התא. לאחר מכן, קרעו את האיטום עם יניקה כדי להשיג תצורת תא שלם, והמתינו חמש עד שמונה דקות לדיאליזה של התמיסה הפנימית המכילה דופמין לתוך התא.

לאחר מכן רשום זרמים מתווכים DAT על ידי צעד מתח קרום התא בין מינוס 60 לפלוס 100 מילי-וולט מפוטנציאל החזקה של מינוס 40 מילי-וולט דרך הפיפטה. כדי לקבוע את ה-DAT הספציפי בתיווך דופמין flx לרשום את הזרמים המטריים בהיעדר ונוכחות של אנטגוניסט DAT. הזרם הטרי הספציפי בתיווך DAT נקבע לאחר מכן על ידי הפחתת העקבות שתועדו בנוכחות אנטגוניסט DAT מעקבות האמפר שתועדו ללא האנטגוניסט.

סטייה כלפי מעלה בזרמי הטריק תואמת לשטף החוצה של דופמין המוצג כאן. זרמים מתווכים של DAT נרשמו על ידי צעד מתח הממברנה ב-20 מילי-וולט בין מינוס 60 לפלוס 100 מילי-וולט מפוטנציאל החזקה של מינוס ארבעה מילי-וולט C כאשר הפיפטה מכילה שני דופמין מילי-מולרי במצב תיקון התא כולו. הנה הזרם המטרי Emper הנרכש בו זמנית עם כל זרם התא.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד הובלה הפוכה של דופמין דרך טרנספורטר הדופמין בתא עצב מהודק מתח. זכור לבדוק את תקינות האלקטרודה הפרמטרית לפני ואחרי ניסויים, ואל תשכח להחסיר את העקבות שתועדו בנוכחות אותו אנטגוניסט מעקבות הטריקים שתועדו ללא האנטגוניסט.