הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

אנו מתארים הליכי הכנה הקלטה אלקטרו מן פרוסות המוח השומרים על הציר הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי entorhinal (MEC). בגלל קידוד עצבי של מיקום כדלקמן הארגון הגב, הגחון בתוך MEC, נהלים אלה להקל על החקירה של מנגנונים תאיים חשובים לניווט וזיכרון.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את הארגון הטופוגרפי של התכונות הסינפטיות והאינטגרטיביות של נוירונים בקליפת המוח האמצעית. זה מושג על ידי הכנת פרוסות של קליפת המוח המדיאלית המכוונת במישור הגחון הגבי. כשלב שני, הקלטות מהדק תיקון נעשות מנטו נוירונים של קליפת המוח RH כדי לחקור את התכונות הסינפטיות והאינטגרטיביות שלהם.

לאחר מכן, מיקום הנוירון המוקלט נקבע כדי להעריך את הארגון הגחוני הגבי של המאפיינים הנמדדים האלקטרופיזיולוגיים. מתקבלות תוצאות המראות את הארגון הטופוגרפי של התכונות הפנימיות של תאי כוכב בשכבה השנייה על סמך מדידות התנגדות הקלט שלהם, קבוע זמן הממברנה וסף פוטנציאל הפעולה, מדגים את ההליך יו פסטל, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פרוסות מוח בכיוון אופקי, הוא שניתן לרשום במדויק את מיקום הנוירון המוקלט לאורך ציר הגחון הגבי של קליפת המוח הבין-לאומית.

כדי להתחיל בהליך זה, הסר את המוח מהעכבר והנח אותו מיד בחיתוך קר. נוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי בעבע בקרבוגן. לאחר שלוש דקות, הסר בזהירות את המוח מהחיתוך A CSF באמצעות מרית.

הנח אותו בעדינות במצב זקוף על נייר הסינון שהורטב בחיתוך A CSF. לאחר מכן השתמש בסכין גילוח או באזמל כדי להסיר כמה שיותר מהמוח הקטן מבלי להשפיע על קליפת המוח האנטרלית האמצעית, הממוקמת בקצה הפנימי של המוח. הסר את החלק הרוסטרלי של המוח הגדול על ידי חתך במישור העטרה.

לאחר מכן המיס סק, המוח במישור האנכי של קו האמצע. לאחר מכן, החזירו את חצאי הכדור לבועה וחתכו CSF למשך דקה וחצי לפני ההרכבה. ודא שקצה החיתוך של להב הוויברטו בזווית של 20 מעלות מהאופק על משטח ההרכבה, צור רצועה רדודה של דבק סופר במקביל ללהב הוויברטו, בערך ברוחב חצי כדור, וארוכה מספיק כדי להכיל את שתי ההמיספרות מקצה לקצה.

לאחר מכן העבירו כל חצי כדור מחיתוך CSF למשטח ההרכבה על ידי מיקום חצי הכדור כך שהמשטח המדיאלי שלו מונח על המרית וההיקף הגבי שלו פונה לכיוון להב הטון הרוטט. החלק בעדינות את חצי הכדור על רצועת הדבק הסופר וודא שהמשטח המדיאלי של כל חצי כדור מקביל לבסיס הוויברטו. לאחר מכן, טבלו מיד את חצאי הכדור בחיתוך קר.

CSF. שמור על הטמפרטורה והמכונית והרוויה לאורך כל הליך החיתוך. בעזרת הוויברם, הסר את קליפות המוח משתי ההמיספרות במישור הסגיטלי עד שהחלק הצדדי ביותר של קליפת המוח האנטרלית המדיאלית בכל חצי כדור מזוהה לפחות 600 מיקרומטר מהמשטח הרוחבי.

ההיקף הרוחבי של קליפת המוח האנטרלית המדיאלית מזוהה על ידי היעדר הרצועה הלבנה העבה סביב עקומת הגחון של ההיפוקמפוס. הצורה הלא קמורה של הגבול הרוסטרלי שלו והפינה הקורטאלית הגבית הזוויתית חותכים 400 מיקרון חתכים פרה-סגיטליים משתי ההמיספרות עד שמגיעים להיקף המדיאלי של קליפת המוח האנטרלית האמצעית. לאחר כל חיתוך, מניחים מיד את הפרוסות בתקן רווי קרבוגן A CSF הנשמר באמבט מים בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס ומדגרים אותן כ -15 דקות.

לאחר 15 דקות, הסר את מחזיק הפרוסות מאמבט המים והמשיך לבעבע עם קרבוגן בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות לפחות. העבירו פרוסה לתא ההקלטה, המבעבע ברציפות בתקן רווי קרבוגן A-C-S-F-A 35 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, זהה אזור הקלטה משוער בתוך קליפת המוח האמצעית.

לאחר מכן עבור למטרת הגדלה גבוהה. זהה תאים ברי קיימא באזור זה. בשלב זה, ניתן לבצע ניסויים המשתמשים במהדק תיקון התא השלם הקונבנציונאלי כדי לתעד את פוטנציאל הממברנה או זרם הממברנה מהנוירונים שזוהו.

ניתן לאמת את זהות הנוירון מהתכונות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירון המוקלט ועל ידי הכללת תוויות פלואורסצנטיות בתוך התמיסה התוך-תאית. לאחר הניסוי לקביעת מיקומו של נוירון מוקלט לאורך ציר הגחון הגבי, עבור למטרה בהגדלה נמוכה. סמן את מיקום העניין על ידי הכללת אלקטרודת ההקלטה בתמונה או על ידי הורדת דיאפרגמת קשתית השדה.

כדי להשאיר עיגול בהיר סביב המיקום המעניין בתמונת תמונה משוכפלת, אזור קליפת המוח המדיאלי וה-RH והאזורים הסובבים את הפרוסה כדי לאתר את מיקום ההקלטה בתוך התמונה, ניתן להניח את העותק על התמונה הראשונית של מיקום ההקלטה וסביבתו. ייתכן שיידרשו עד שלוש תמונות נפרדות בהגדלה נמוכה כדי לכסות את האזור ממיקום הקלטה גחוני לגבול הגבי של קליפת המוח הבין-מדיאלית. לאחר מכן ניתן לתפור את התמונות הללו באמצעות תוכנת מניפולציה של תמונות.

הגבול הגבי של קליפת המוח האנטרלית המדיאלית מספק נקודת ציון נוחה למדידת מיקום הגחון הגבי, אך גבול הגחון של קליפת המוח האנטרלית המדיאלית אינו מוגדר היטב. הנה. הקטעים הפרה-סגיטליים DIC ו-NIAL מראים את ההיפוקמפוס המעגלי ואת היעדר בליטה אורביקולרית לשכבה אחת של קליפת המוח האנטרלית הצדדית בהתאמה. אלה תמונות של הפרוסות האופייניות המכילות את קליפת המוח האנטרלית האמצעית.

אזור הצנחנים מתגלה בבירור על ידי צביעת טילים. בתמונות המתאימות, הגבול הגבי של קליפת המוח האנטרלית האמצעית המסומן על ידי החץ השחור הוא גחון לקבוצת התאים המעוגלים הבולטים הרחק לשכבה הראשונה כפי שמצוין על ידי החץ האדום. הנה דוגמה לתמונה מורכבת בהגדלה פי ארבעה של פרוסה פארא-סגיטלית.

המיקומים של תא גבי ותא גחון מסומנים על ידי עיגולים מלאים בכחול וירוק בהתאמה. החץ השחור מסמן את הגבול הגבי המשוער של קליפת המוח הבין-מדיאלית ונמשך לתוך השכבות העמוקות על ידי הקו המקווקו הלבן. הקו הלבן המוצק הוא מדריך המציג את נתיב קווי המתאר, שלאורכו מוצגת כאן מדידת הפיקסלים של המרחק מהגבול הגבי של קליפת המוח הבין-אל-מדיאלית לרישומי התאים הממוקמים בגחון מתאי הכוכב הגביים והגחונים המסומנים.

הקלטות אלה עוזרות לבסס את זהות התאים ולהמחיש כיצד תכונות חשמליות של מדיאלי נכנסות לקליפת המוח. תאי כוכב בשכבה השנייה נבדלים זה מזה במיקומים הגביים והגחונים בזמן ניסיון הליך זה. חשוב לזכור להיות זהירים במיוחד במהלך הכנת הפרוסות מכיוון שפרוסות באיכות גבוהה חיוניות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות פרודוקטיביות.