מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

נוהל זה משתמש במכשיר זרימה מופסקת (stopped flow) כדי לזהות את הצורות הספקטרליות השונות של SID A ולמדוד קצבים. ניתן לחלק את התגובה המזורזת על ידי SID A לתגובה חלקית רדוקטיבית ותגובה חלקית חמצונית של FAD. הפלבין המחומצן נקשר ל-N-A-D-P-H ומגיב ליצירת פלבין מושפעל (reduced) ו-NADP, כאשר תגובה של חמצן מולקולרי וקישור של אורניתין מובילים ליצירת C ארבע.

הידרוקסי-פלאבין לאחר הידרוקסילציה של ornithine; ההידרוקסי-פלאבין עובר דהידרטציה כדי ליצור את האנזים המחוסן. NA DP plus נשאר קשור לאורך כל המחזור הקטליטי והוא הסובסטרט האחרון שמשתחרר. מכשיר ה-stopped flow מאפשר ערבוב מהיר של נפחים קטנים של מגיבים ומבצע רישום.

שינויים ספקטרליים לאורך זמן באמצעות ספקטרופוטומטר מאפשרים למדוד את קצב היווצרות ואובדן של תגובה המזורזת על ידי אנזים, ובמיוחד של תוצרי ביניים חולפים. שני חברי מעבדה, ריטה רובינסון ואנוירו רומרו, ידגימו ניסויים אלו תוך שימוש בסט A של flavor mono oxygenase כשיטה מודלית. שפכו 250 milliliters של 100 millimolar potassium phosphate buffer לתוך בקבוק ביכנר של 500 milliliters המכיל מוט ערבוב.

אטמו את הבקבוק באמצעות פקק גומי, לאחר מכן הניחו אותו על פלטת ערבוב וחברו את הצינור הקצר של הבקבוק לקו שופלק (sch flank line). בצעו דגזינג (degassing) לבאפר תחת ואקום למשך שעה בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב, ולאחר מכן שטפו ב-argonne. חזרו על הפעולה חמש פעמים.

לבסוף, שטפו את הבקבוק ב-Argonne למשך 10 שניות. נתקו את הבקבוק מרשומת הוואקום והניחו אותו בתוך תא הכפפות. המשיכו לערבב בעוצמה כאשר הבקבוק פתוח.

מלאו את מזרקי המאגר בפתרונות של 18.13 units per milliliter glucose oxidase ו-100 millimolar glucose. כעת, העבירו את שסתומי ההנעה למצב טעינה. מלאו את מזרקי ההנעה.

בשלב הבא, העבירו את שסתום F למצב הנעה (drive). באמצעות תוכנת בקרת הנתונים של ה-pro, לחצו על "empty the stop syringe" (ריקון מזרק העצירה), ולאחר מכן דחפו את הבאפר ממזרק ההנעה F דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה. המשיכו עם שלושת מזרקי ההנעה האחרים; השאירו להם להגיע לשיווי משקל במשך שעה.

כעת מלאו מחדש את מזרקי המאגר וחזרו על שטיפת מערכת הזרימה שהופסקה. להכנת בופר רווי בחמצן, הבעבעו את התמיסה ב-100% oxygen במשך שעה אחת תוך כדי ערבול.

לאחר מכן, הוציאו את המחט הקצרה מהבקבוק והמתינו 10 שניות. המשיכו בהוצאת המחט הארוכה והניחו את הבקבוק הסגור בתא הכפפות. עבור תמיסת ה-N-A-D-P-H.

הניחו מבחנה מסוג einor בנפח 1.5 מיליליטר המכילה 1 מיליגרם של N-A-D-P-H בתוך תא כפפות. המיסו ב-300 מיקרוליטר של בופר פוטסיום פוספאט אנארובי בריכוז 100 מילימולר, pH 7.5.

הסיר 30 µL כדי לקבוע את ריכוז ה-N-A-D-P-H. כעת, כדי להוציא חמצן ממאגר האנזים, העבר את התמיסה למבחנה של 25 mL המכילה מוט ערבוב, פקק גומי ואטם אלומיניום. הנח על קרח.

חברו לקו שלינק (Schlenk line), לאחר מכן בצעו ניקוון של הגזים באמצעות ואקום למשך 20 דקות, ולאחר מכן שטפו ב-argon. לבסוף, שטפו את הבקבוק ב-argon למשך 10 שניות ונתקו אותו מסוע ואקום. הניחו את הבקבוק על קרח בתוך תא כפפות (glove box).

בחלון לוח הבקרה של תוכנת הבקרה pro data, בחרו ב-photo diode array, בטריגר חיצוני (external trigger) ובסולם לוגריתמי. כמו כן, הפעילו את תוכנת הצפייה pro data viewer והגדירו את הספריה לשמירת קובצי הנתונים.

כעת החליפו את התמיסה במזרקי המאגר C ו-F בבופר פוספט פוטסיום אנאירובי בריכוז 100 millimolar ב-pH 7.5. סובבו את השסתומים C ו-F למצב הנעה (drive). לחצו על "empty the stop syringe" בתוכנת הבקרה pro data control.

לאחר מכן, דחפו את הבאפר משתי מזרקות ההנעה דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה. חזרו על השטיפה עם מזרקות המאגר C ו-F שלוש פעמים נוספות. כדי להבטיח הסרה מלאה של glucose oxidase ממעגל הזרימה, לחצו על baseline בתוכנת הבקרה pro data.

החלף את התמיסה במזרק המאגר F בתמיסת האנזים. סובב את שסתום F למצב ההנעה (drive). לחץ על "empty the stop syringe" בתוכנת הבקרה pro data.

דחפו את תמיסת האנזים ממזרק ההנעה F דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה. חזרו לתוכנת בקרת הנתונים (pro data control software) כדי להגדיר את זמן הרכישה ל-60 שניות. ודאו ששני מזרקי ההנעה מלאים בתמיסות המתאימות להם ושבוכנות ההנעה נמצאות במגע עם בוכנות המזרקים.

סובב את שני השסתומים למצב הנעה (drive) ולחץ על acquire בתוכנת הבקרת הנתונים pro כדי לבצע את ההנעה. רשום נתונים ספקטרליים של הצורה המחושנת של האנזים בשלוש חזרות, תוך שימוש בערך ה-A 4 52 nanometer שהתקבל מההנעות. קבע את ריכוז האנזים לפני הערבוב והכן ארבעה מיליליטר של תמיסת N-A-D-P-H.

מלאו את מזרק מאגר המילוי C בתמיסת N-A-D-P-H המרוכזת פי 1.5, ורוקנו ומלאו מחדש את מזרק העצירה שלוש פעמים כפי שהודגם קודם לכן. כעת, רכשו ספקטרום במהלך החזרת האנזים למצב רדוקציה תוך שטיפת התכולה ממעגל הזרימה עם בופר פוספט פוטסיום אנאירובי 100 millimolar pH 7.5. כעת לחצו על baseline בתוכנת הבקרת הנתונים pro data.

לאחר מכן, ערבבו 200 µL של תמיסת מאגרי אנזים עם 1000 µL של בופר פוטסיום פוספט אנאירובי בריכוז 100 mM, pH 7.5. החליפו את התמיסה במזרק מאגר A בתמיסת האנזים.

העבירו את שסתום A למצב הנעה (drive) בתוכנת בקרת הנתונים (pro data control). לחצו על "stop syringe empty". דחפו את תמיסת האנזים ממזרקת הנעה A דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה.

הגדירו את זמן ההשהיה ל-0.5 שניות ואת זמן הרכישה ל-60 שניות. ודאו שכל מזרקי ההנעה מלאים בתמיסות המתאימות להם ושהבוכנות של מערכת ההנעה נמצאות במגע עם בוכנות המזרקים. לאחר מכן, העבירו את כל שסתומי ההנעה למצב הנעה ולחצו על acquire בתוכנת הבקרה pro data control.

השיגו נתונים ספקטרליים של הצורה המחושסנת של האנזים בשלוש חזרות. לאחר מכן, החליפו את התמיסה במזרק המאגר B בתמיסת N-A-D-P-H בריכוז הגבוה פי 1.5 מריכוז תמיסת האנזים במזרק A. העבירו את השסתום B למצב הפעלה (drive) ורוקנו ומלאו מחדש את מזרק העצירה שלוש פעמים, כפי שהודגם קודם לכן בחלון לוח הבקרה.

הגדירו את זמן השהייה ל-0.5 שניות. בביצוע רכישה ב-20 שניות, החליפו את התמיסה במזרק המאגר (reservoir syringe sea) בבופר מחומצן. סובבו את שסתום C למצב ההנעה (drive position).

בצעו שטיפה שלוש פעמים בתוכנת הבקרה Pro Data. הגדירו את זמן ההשהיה ל-15 שניות ואת זמן הרכישה ל-900 שניות. המשיכו ברכישת ספקטרה במהלך החימצון מחדש של האנזים המחוזר באופן מלא במכשיר ה-stopped flow.

ניתן לנטר את החמצון האנאירובי של SID A באמצעות N-A-D-P-H על ידי מדידת שינויים במצב החמצון-חיזור של הפלבין באמצעות בולע ב-452 ננומטר. שינויים ספקטרליים נרשמים לאורך זמן, מהמצב של SID A מחומצן ועד לספקטרום האחרון של SID A חזור באופן מלא. ניתן לקבוע את קצב השלב האנזימטי זה על ידי התאמת הנתונים למשוואה המתאימה. ניתן לקבוע את קצב החמצון ואת תוצרי הביניים של התגובה באמצעות מצב ערבוב כפול של stopped flow בתגובה זו על ידי AF Sid A. תוצר הביניים C four A Hydroxi flavin מזוהה בבירור עם lambda max של 380 ננומטר, ולאנזים המחומצן יש lambda max של 450 ננומטר.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בתוך ארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. זכרו לוודא שהתמיסות הן אנאירוביות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לחקור הן את הייון היחסי והן את הייון האולקטיבי של FLA לצורך ניסויי המשך עצמאיים, כגון כימיה מהירה.

Quentin יכול לסייע בבירור מהותם של תוצרי הביניים.