מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

הליך זה משתמש במכשיר זרימה נעצרת כדי לזהות את הצורות הספקטרליות השונות של SID A ולמדוד קצבים. ניתן לחלק את התגובה המזרזת על ידי SID A לתגובות חצי רדוקטיביות וחמצון של FAD. הפלבין המחומצן נקשר ל-N-A-D-P-H ומגיב ליצירת פלבין ו-NADP מופחתים בתוספת תגובה של חמצן מולקולרי וקשירת אורניתין מביאה להיווצרות C four.

הידרוקסי פלבין לאחר הידרוקסילציה של אורניתין, הידרוקסי פלבין מתייבש ליצירת האנזים המחומצן. NA DP plus נשאר קשור לאורך כל המחזור הקטליטי והוא המצע האחרון ששוחרר. מכשיר הזרימה המופסקת מאפשר ערבוב מהיר של כמויות קטנות של מגיבים ותקליטים.

השינויים הספקטרליים לאורך זמן ספקטרופוטומטר אובדן חומר מאפשר למדוד את קצב ההיווצרות ושל תגובה מזורזת של אנזים במיוחד של חומרי ביניים חולפים. שניים מחברי המעבדה שלי, ריטה רובינסון ואנווירו רומרו ידגימו את הניסויים הללו באמצעות סט A בטעם מונו אוקסיגנאז כמערכת מודל. יוצקים 250 מיליליטר של מאגר אשלגן פוספט 100 מילי-מולרי לבקבוק בוכנר בנפח 500 מיליליטר המכיל מוט ערבוב.

אוטמים את הבקבוק עם פקק גומי, ואז מניחים אותו על צלחת ערבוב ומחברים את הצינור הקצר של הבקבוק לקו אגף sch. הסר את המאגר בוואקום למשך שעה בטמפרטורת החדר עם תסיסה, ולאחר מכן שטיפה עם ארגון. חזור על הפעולה חמש פעמים.

לבסוף שטפו את הבקבוק עם ארגון למשך 10 שניות. נתק את הבקבוק מסעפת הוואקום והנח אותו בתוך תא הכפפות. ממשיכים לערבב במרץ כשהבקבוק פתוח.

מלאו את מזרקי המאגר ב-18.13 יחידות למיליליטר גלוקוז אוקסידאז, ותמיסות גלוקוז של 100 מילי-מולריות. כעת הגדר את שסתומי ההנעה למצב העומס. מלא את מזרקי הכונן.

לאחר מכן, סובב את שסתום F למצב הכונן. באמצעות תוכנת בקרת הנתונים המקצועית, לחץ על רוקן את מזרק העצירה, ולאחר מכן דחוף את המאגר ממזרק הכונן F דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של זיכרון הכונן המתאים. המשך עם שלושת מזרקי הכונן האחרים בשיווי משקל למשך שעה.

כעת מלאו מחדש את מזרקי המאגר וחזרו על השטיפה של מערכת הזרימה שהופסקה. להכנת מאגר רווי חמצן. מבעבעים את התמיסה עם 100% חמצן למשך שעה עם תסיסה.

לאחר מכן הסר את המחט הקצרה מהבקבוקון והמתן 10 שניות. המשך להסיר את המחט הארוכה ולהניח את הבקבוקון הסגור בתא הכפפות. לפתרון N-A-D-P-H.

הכניסו שפופרת עינור בנפח 1.5 מיליליטר המכילה מיליגרם אחד של N-A-D-P-H לתוך תא הכפפות. ממיסים ב -300 מיקרוליטר של מאגר אשלגן פוספט אנאירובי, 100 מילי-מולרי. pH 7.5.

הסר 30 מיקרוליטר כדי לקבוע את ריכוז N-A-D-P-H. כעת כדי להסיר חמצן ממלאי האנזים, העבירו את התמיסה לבקבוקון של 25 מיליליטר המכיל מכסה מוט ערבוב עם חיטה ופקק ואטם אלומיניום. מניחים על קרח.

התחבר לקו שלינק, ואז הוצא את הגז בוואקום למשך 20 דקות, ולאחר מכן שטוף עם ארגון. לבסוף, שטפו את הבקבוקון עם ארגון למשך 10 שניות ונתק אותו מסעפת הוואקום. הניחו את הבקבוקון על קרח בתוך תא הכפפות.

בחלון לוח הבקרה של תוכנת בקרת הנתונים המקצועית. בחר מערך דיודות צילום, טריגר חיצוני וסולם לוגריתמי. הפעל גם את תוכנת מציג הנתונים המקצועית והגדר את הספרייה לאחסון קבצי נתונים.

כעת החלף את התמיסה במזרקי המאגר C ו-F במאגר אשלגן פוספט אנאירובי 100 מילי-מולרי pH 7.5. סובב את שסתומי C ו-F למצב הכונן. לחץ על רוקן את מזרק העצירה בתוכנת בקרת הנתונים המקצועית.

לאחר מכן דחוף את המאגר משני מזרקי הכונן דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של איל הכונן המתאים. חזור על השטיפה עם מזרקי מאגר C ו-F שלוש פעמים נוספות. כדי להבטיח הסרה מוחלטת של גלוקוז אוקסידאז ממעגל הזרימה, המשך ללחוץ על קו הבסיס בתוכנת בקרת הנתונים המקצועית.

החלף את תמיסת מזרק המאגר F בתמיסת האנזים. סובב את שסתום F למצב הכונן. לחץ על רוקן את מזרק העצירה בתוכנת בקרת הנתונים המקצועית.

דחוף את תמיסת האנזים ממזרק ההנעה F דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של איל ההנעה המתאים. חזור לתוכנת בקרת הנתונים המקצועית כדי להגדיר את זמן הרכישה ל-60 שניות. ודא ששני מזרקי הכונן מלאים בתמיסות המתאימות להם וכי אימי הכונן נמצאים במגע עם מזרק הכונן. פיסטונס.

סובב את שני השסתומים למצב הכונן ולחץ על רכישה בתוכנת בקרת הנתונים המקצועית כדי לבצע את הכונן. רכוש נתונים ספקטרליים של הצורה המחומצנת של האנזים בשלוש עותקים באמצעות ערך A 4 52 ננומטר המתקבל מהכוננים. קבעו את ריכוז האנזים לפני הערבוב והכינו ארבעה מיליליטר של תמיסת N-A-D-P-H.

פי 1.5 מזרק מאגר מילוי מרוכז יותר C עם תמיסת N-A-D-PH ורוקנו ומלאו מחדש את מזרק העצירה שלוש פעמים כפי שהוצג קודם לכן. כעת, רכוש ספקטרום במהלך הפחתת תוכן שטיפת האנזים ממעגל הזרימה עם pH 7.5 אנאירובי של 100 מילי-מולרי אשלגן פוספט. כעת לחץ על קו הבסיס בתוכנת בקרת הנתונים המקצועית.

לאחר מכן מערבבים 200 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אנזימים עם 1000 מיקרוליטר של חיץ אשלגן פוספט אנאירובי, 100 מילי-מולרי. pH 7.5. החלף את תמיסת מזרק המאגר A בתמיסת האנזים.

סובב את שסתום A למצב הכונן בתוכנת בקרת הנתונים המקצועית. לחץ על מזרק העצירה ריק. דחוף את תמיסת האנזים ממזרק הכונן A דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של איל ההנעה המתאים.

הגדר את זמן ההשהיה ל-0.5 שניות ואת זמן הרכישה ל-60 שניות. ודא שכל מזרקי הכונן מלאים בתמיסות המתאימות להם ואימי הכונן נמצאים במגע עם בוכנות מזרק הכונן. לאחר מכן סובב את כל שסתומי ההנעה למצב הכונן ולחץ על רכישה בתוכנת בקרת הנתונים המקצועית.

השג נתונים ספקטרליים של הצורה המחומצנת של האנזים במשולש. לאחר מכן, החלף את התמיסה של מזרק המאגר B בתמיסת N-A-D-P-H. פי 1.5 מרוכז יותר מתמיסת האנזים במזרק A. סובב את שסתום B למצב ההנעה ורוקן ומלא מחדש את מזרק העצירה שלוש פעמים כפי שהוצג קודם לכן בחלון לוח הבקרה.

הגדר את זמן ההשהיה ל-0.5 שניות. רכישה תוך 20 שניות, החלף את התמיסה של ים מזרק המאגר במאגר המחומצן. סובב את שסתום C למצב הכונן.

שטוף שלוש פעמים בתוכנת בקרת הנתונים המקצועית. הגדר את זמן ההשהיה ל-15 שניות ואת זמן הרכישה ל-900 שניות. המשך לרכוש ספקטרום במהלך החמצון מחדש של האנזים המופחת במלואו במכשיר הזרימה המופסקת.

ניתן לנטר את ההפחתה האנאירובית של SID A עם N-A-D-P-H על ידי מדידת שינויים במצב חמצון החיזור של הפלבין באמצעות סופג ב-452 כאן. שינויים ספקטרליים נרשמים לאורך זמן מ-SID A מחומצן לספקטרום האחרון של SID A מופחת במלואו.ניתן לקבוע את קצב השלב האנזימטי הזה על ידי התאמת הנתונים למשוואה המתאימה. ניתן לקבוע את קצב החמצון ואת תוצרי הביניים של התגובה גם באמצעות מצב הערבוב הכפול של הזרימה שנעצרה בתגובה זו על ידי AF Sid A.המתווך C four A Hydroxi flavin מזוהה בבירור עם למבדה מקסימום של שלושה 80 ננומטר ולאנזים המחומצן יש למבדה מקסימום של 450 ננומטר.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. זכור לוודא שהפתרונות הם אנאירוביים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור הן את היון היחסי והן את היון הכיבי של ניסוי מונו עצמאי FLA בהמשך הזרם כמו כימיקל מהיר.

קוונטין יכול לעזור להבהיר את האופי העצוב של המתווכים.