Name: מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: חקור את מנגנוני התגובה של SidA מ-Aspergillus fumigatus באמצעות ספקטרוסקופיית stopped-flow. שיטה זו מאפשרת מדידת קבועי קצב של תוצרי ביניים וניתוח שינויים ספקטרליים לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי פרס NSF MCB-1021384.

<ol><li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA%2C+encoding+L-ornithine+N5-oxygenase%2C+is+required+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L-ornithine N5-oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li>
<li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li>
<li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+spectroscopic%2C+steady+state%2C+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore-associated+flavin+monooxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore-associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li>
<li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFierke%2C+CA+%22Contemporary+enzyme+kinetics+and+mechanism%22">Contemporary enzyme kinetics and mechanism</a>. , Elsevier. USA. (2009).</li>
<li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li>
<li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavoprotein+monooxygenases%2C+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li>
<li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapman%2C+SK+%22Flavoprotein+Protocols%22">Flavoprotein Protocols</a>. , Humana Press. Totowa, USA. (1999).</li>
<li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2%2C+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li>
<li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substituent+effects+on+the+reaction+of+%C3%8E%C2%B2-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li>
<li>Yun, D., García-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28%CE%BC-1%2C2-Peroxo%29diiron%28III%2FIII%29+complex+as+a+precursor+to+the+diiron%28III%2FIV%29+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron-radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">(μ-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron-radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li>
<li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li>
<li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

אנזימים לזרז תגובות חמזור בדרך כלל מכילים cofactors כגון hemes ו flavins כי עוברים שינויים משמעותיים ספיגת במהלך מחזור קטליטי. טופס חמצון של פלבין מציג ספיגת מקסימום ב ~ 360 ו 450 ננומטר, וצמצום שלה הוא פיקוח בדרך כלל על ידי ביצוע ירידה ספיגת ב 450 ננומטר 7. באופן כללי, כמה ביניים זמניים קיימים אבל בצורה וריקבון מהר מדי כדי להימדד ב הספקטרופוטומטרים רגילים. שימוש Photophysics יישומי SX20 הפסיק זרימת ספקטרופוטומטר (או מכשירים דומים), ניתן למדוד שינויים ספיגת בקנה מידה זמן אלפית השנייה (מת בזמן, 2 ms). כאן למדנו את רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של monooxygenase פלבין תלוי Sida F, המשמש כמודל. שיעור ההעברה הידריד נקבע על ידי מדידת השינוי של ספיגת ב 452 ננומטר לאחר ערבוב עם האנזים NADPH בתנאים אנאירוביים. לאחר מכן, לוקחים advantagהדואר של מצב ערבוב כפול של המכשיר הפסיק זרימה, האנזים 1 היה הגיב עם NADPH, עד הפחתה מלאה הושגה, ואז מופחת אנזימים NADP + מורכב היה מעורב עם חמצן. בעקבות הליך זה, ניתן לזהות חולפות ביניים לפלבין מחומצן ו למדוד שיעורי היווצרות עששת. זיהוי ביניים אלה מספק נתונים ניסיוניים על אופיו של המין מגיב קטליזה. במקרה של Sida F, היווצרות C4a-hydroperoxyflavin (פיקוח בדרך כלל 370-380 ננומטר), שהיא המין hydroxylating. בנוסף, מדידת שיעור קבוע של כל שלב מאפשר לקבל מידע על השלב החליפין בקביעת התגובה לעזור להבהיר את המנגנונים הקינטית וכימי של האנזים. באופן כללי, גישות דומות ניתן להשתמש flavoenzymes אחרים, או חלבונים אשר ספיגת חלו שינויים, כגון חלבונים המשךעין heme, פוספט pyridoxal-או ללא ברזל heme 8-10. המגבלה בשיטה זו היא כי כמויות גדולות של האנזים מטוהרים נדרשים, אך ניתן להתגבר באמצעות מערכת ביטוי עם תשואות גבוהות. אחת קובעת את ריכוז החלבון האופטימלית ספקטרום הקלטה באמצעות חלבון מספיק כך אות מספיק חזק ניתן לצפות, אבל לא יותר מדי, כך האנזים אינו מבוזבז. בדרך כלל, ריכוז האנזים הנמוך ביותר פלבין המכילים אנזימים המשמשים עצר זרימה ניסויים הוא 6-10 מיקרומטר (אחרי ערבוב) והוא נקבע באמצעות מקדם המקביל טוחנת הכחדה של האנזים. במקרה של Sida F, אחוז FAD קשור האנזים הוא 50-65% 2. Apo-חלבון נחשב פעיל בניסויים אלו כי cofactor FAD כרוך הכרחי קטליזה. מגבלה נוספת ניתן בשיטה זו הוא, אם תהליכים האנזים להתרחש מהר יותר מאשר 2 ms (זמן מת של זרימה הפסיק) הם לא לצפות, אבל הפה מדווחים אסטרטגיות שבו שיעורי ניתן לצמצם להתגבר על בעיה זו. דוגמה אחת לכך כולל באמצעות ריכוז NaCl גבוה התגובה של ferredoxin-NADP + reductase 11. קרצוף של חמצן במעגל זרימת זרימה עצר לעתים קרובות צעד מסובך בניסוי זה דורש תשומת לב מיוחדת. אוקסידאז-גלוקוז גלוקוז המערכת המתוארת כאן משמשת בהצלחה ברוב המעבדות כפי שהיא שיטה יעילה וזולה. עם זאת, ישנם מספר חסרונות אשר כוללים את הייצור של H 2 O 2 עבור יישומים מסוימים חלופות אחרות כמו מערכת dioxygenase-protocatechuate protocatechuate יש לשקול 12. ניצול של תיבת כפפה אנאירובי מקל כדי להבטיח תנאים אנאירוביים, אך אינה הכרחית. חמצן יש להסיר מן המעגל זרימת זרימה הפסיקה כפי שאנו רוצים את האנזים להיות מופחת בהיעדר חמצן או מגיבים עם חמצן בריכוזזה שאנחנו לציין. למרות הפסיקה זרימת הוא בתא הכפפות, אין חמצן במעגל זרימת אם היינו מאגרים אירובי בניסויים קודמים. בנוסף ספיגת מדידות, מבחני dichroism הקרינה ואת מעגלי ניתן לבצע ספקטרופוטומטר הפסיקה זרימת Photophysics יישומי SX20 עם האביזרים המתאימים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ציוד כללי למעבדות </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> משאבת ואקום </td><td> וולש </td><td> - </td></tr><tr><td> בוכנר צלוחיות </td><td> דיג </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> מערבבים ברים </td><td> דיג </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> מערבבים צלחות </td><td> דיג </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk קווי </td><td> Kontes זכוכית </td><td> - </td></tr><tr><td> ארגון מיכל </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> מיכל חנקן </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> מיכל חנקן, טוהר אולטרה ציון גבוה </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> מיכל חמצן </td><td> Airgas </td><td> שור 40 </td></tr><tr><td> 5% מימן מאזן חנקן מיכל </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 סנטopped זרימת ספקטרופוטומטר </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> כפפה תיבת </td><td> בישן </td><td> - </td></tr><tr><td> מי האמבט </td><td> יתירה מאונ &#39;Brinkmann </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ספקי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל BD פלקון צינורות </td><td> דיג </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל BD פלקון חרוטי צינורות </td><td> דיג </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;ל Eppendorf צינורות microcentrifuge </td><td> דיג </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 ו 25 מ&quot;ל צלוחיות זכוכית </td><td> דיג </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> גומי פקקים </td><td> דיג </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> אלומיניום חותמות </td><td> דיג </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ReagenTS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט אשלגן, monobasic </td><td> דיג </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> פוספט אשלגן, dibasic </td><td> דיג </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> סודיום אצטט </td><td> סיגמא </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> גלוקוז אוקסידאז מ א ניז&#39;ר </td><td> סיגמא </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> דיג </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> דיג </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornithine hydrochloride </td><td> דיג </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-flow spectrophotometry

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore (Sida) הוא monooxygenase FAD המכיל המזרז hydroxylation של ornithine ב ביוסינתזה של siderophores hydroxamate החיוניים ארסיות (למשל ferricrocin או נ &#39;, נ&#39;, נ&#39;&#39; &#39;, triacetylfusarinine C) 1. התגובה catalyzed ידי Sida ניתן לחלק רדוקטיביים ו חמצוני למוצרי תגובות וחצי (ערכת 1). רדוקטיבי חצי תגובה, FAD חמצון חייב Sida F, הוא מופחת על ידי NADPH 2,3. ב חמצוני חצי תגובה , cofactor מופחת מגיב עם חמצן מולקולרי כדי ליצור C4a-hydroperoxyflavin ביניים, אשר מעבירה אטום חמצן ornithine. כאן אנו מתארים הליך למדוד את שיעורי וכדי לזהות את הצורות השונות של הספקטרום Sida באמצעות מכשיר הפסיקה זרימת מותקן תא הכפפות אנאירובי. ב-מכשיר הפסיק לזרום, כמויות קטנות של המגיבים הם במהירות מעורבת, ואחרי זרימה הוא נעצר על ידי המזרק ה stop (איור 1), השינויים הרפאים של הפתרון ממוקם בתא המדידה נרשמות לאורך זמן. בחלק הראשון של הניסוי, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש במכשיר הפסיק זרימת במצב אחד, שבו הפחתת אנאירובי של פלבין ב Sida F על ידי NADPH נמדד באופן ישיר. לאחר מכן להשתמש בהגדרות ערבוב כפול שבו Sida F מצטמצם 1 anaerobically ידי NADPH עבור פרק זמן מוגדר של זמן בלולאה ההזדקנות, ולאחר מכן הגיבו עם חמצן מולקולרי בתא המדידה (איור 1). על מנת לבצע את הניסוי הזה, מאגרים אנאירוביים נחוצים משום שכאשר רק רדוקטיבי חצי התגובה פיקוח, כל החמצן הפתרונות יגיב עם cofactor פלבין מופחת וליצור C4a-hydroperoxyflavin ביניים אשר בסופו של דבר להירקב בחזרה פלבין חמצון . זו לא תאפשר למשתמש למדוד במדויק את קצב הפחתת מאז לא תהיה תחלופה מלאה של enzyme. כאשר חמצון וחצי תגובת נחקרת האנזים חייב להיות מופחת בהיעדר חמצן כך רק את הצעדים בין הפחתת חמצון הם נצפו. אחד מאגרים המשמשים בניסוי זה הוא רווי חמצן, כדי שנוכל ללמוד חמצוני חצי תגובה על ריכוזים גבוהים יותר של חמצן. אלה הם לעתים קרובות את ההליכים שבוצעו כאשר לומדים בין אם את רדוקטיביים או חמצוני למוצרי תגובות וחצי עם פלבין המכילים monooxygenases. טווח הזמן של טרום היציב ניסויים שבוצעו עם הזרם, הוא עצר את אלפיות שניות, אשר מאפשר לקבוע את קבועי קצב פנימי איתור וזיהוי של חומרי ביניים בתגובה 4. הנהלים המתוארים כאן יכול להיות מיושם על פלבין תלויי monooxygenases אחרים. 5,6

אנו מתארים את השימוש של המכשיר הפסיקה זרימת לחקור הן את רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות<em&gt; אספרגילוס fumigatus</em&gt; Siderophore (Sida), monooxygenase פלבין תלוי. לאחר מכן, אנו מציגים את הספקטרום המתאים המינים בתגובה של Sida ואנחנו לחשב את קבוע קצב עבור היווצרותם.

מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

Siderophore A (SidA) של Aspergillus fumigatus הוא מונו-אוקסיגנזה המכיל FAD, המקטליז את ההידרוקסילציה של אורניתין בביוסינתזה של...

נוהל זה משתמש במכשיר stopped flow כדי לזהות את הצורות הספקטרליות השונות של SID A ולמדוד קצבים. התגובה המזורזת על ידי SID A ניתנת לחלוקה לתגובות מחציתיות של חיזור וחמצון של FAD. הפלבין המחוסן נקשר ל-N-A-D-P-H ומגיב ליצירת פלבין מושחז ו-NADP, בתוספת תגובה של חמצן מולקולרי וקישור של ornithine, המובילים ליצירת C ארבע.הידרוקסי-פלאבין לאחר הידרוקסילציה של אורניטין, ההידרוקסי-פלאבין עובר דהידרטציה כדי ליצור את האנזים המחומצן. NA DP plus נשאר קשור לאורך כל המחזור הקטליטי והוא הסובסטרט האחרון שמשתחרר. מכשיר ה-stopped flow מאפשר ערבוב מהיר של נפחים קטנים של מגיבים ומבצע רישום.שינויים ספקטרליים לאורך זמן בספקטרופוטומטר מאפשרים למדוד את קצב ההיווצרות והפירוק של תגובה המזורזת על ידי אנזים, ובמיוחד של תוואים זמניים. שתי חברות מהמעבדה שלי, ריטה רובינסון ואנוויירו רומרו, ידגימו ניסויים אלה תוך שימוש בסט A של flavor mono oxygenase כמערכת מודל. שפכו 250 milliliters של 100 millimolar potassium phosphate buffer לתוך בקבוק בוכנר בנפח 500 milliliters המכיל מוט ערבוב.אטמו את הבקבוק בעזרת פקק גומי, לאחר מכן הניחו אותו על פלטת ערבוב וחברו את הצינור הקצר של הבקבוק לקו שנקרה sch flank. בצעו ניקוי גזים (degassing) לבאפר תחת ואקום למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ערבוב, ולאחר מכן שטפו בארגון. חזרו על הפעולה חמש פעמים.לבסוף, שטפו את הבקבוק ב-Argonne למשך 10 שניות. נתקו את הבקבוק ממסעף הוואקום והניחו אותו בתוך תא הכפפות. המשיכו לבצע ערבוב נמרץ כאשר הבקבוק פתוח.מלאו את מזרקי המאגר בתמיסות של 18.13 units per milliliter glucose oxidase ו-100 millimolar glucose. כעת, העבירו את שסתומי ההנעה למצב טעינה. מלאו את מזרקי ההנעה.בשלב הבא, העבירו את שסתוף F למצב ההנעה. באמצעות תוכנת הבקרה pro data, לחצו על "empty the stop syringe", ולאחר מכן דחפו את הבופר ממזריק ההנעה F דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה. המשיכו עם שלושת מזריקי ההנעה האחרים והמתינו לשיווי משקל למשך שעה אחת.כעת מלאו מחדש את מזרקי המאגר וחזרו על שטיפת מערכת הזרימה העצורה. להכנת בופר רווי חמצן, בועבע את התמיסה עם 100% oxygen למשך שעה אחת תוך כדי ערבול.לאחר מכן הוצא את המחט הקצרה מהבקיה והמתן 10 שניות. המשך בהוצאת המחט הארוכה והנח את הבקיה הסגורה לתוך תא הכפפות. עבור תמיסת ה-N-A-D-P-H.הנח מבחנה מסוג einor בנפח 1.5 milliliter המכילה milligram אחד של N-A-D-P-H בתוך תא הכפפות. המס ב-300 microliters של באפר פוטסיום פוספט אנאירובי בריכוז 100 millimolar, pH 7.5.הסר 30 µL כדי לקבוע את ריכוז ה-N-A-D-P-H. כדי להוציא חמצן ממלאי האנזים, העבר את התמיסה למבחנה של 25 mL הכוללת מכסה עם מגנט ערבוב, פקק ואטם אלומיניום. הנח על קרח.חברו לקו של Schlenk, לאחר מכן בצעו דגזינג באמצעות ואקום למשך 20 דקות, ולאחריו שטיפה ב-argonne. לבסוף, שטפו את הבקרה ב-Argonne למשך 10 שניות ונתקו אותה מסבון הוואקום. הניחו את הבקרה על קרח בתוך תא הכפפות.בחלון לוח הבקרה של תוכנת ה-pro data control, בחרו ב-photo diode array, ב-external trigger וב-logarithmic scale. כמו כן, הפעילו את תוכנת ה-pro data viewer והגדירו את הספריה לאחסון קבצי הנתונים.כעת החליפו את התמיסה במזרקי המאגר C ו-F בבופר פוספט פוטסיום 100 millimolar אנאירובי ב-pH 7.5. סובבו את השסתומים C ו-F למצב ההנעה. לחצו על empty the stop syringe בתוכנת הבקרה pro data control.לאחר מכן, דחפו את הבאפר משתי מזרקי ההנעה דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה. חזרו על השטיפה עם מזרקי המאגר C ו-F שלוש פעמים נוספות. כדי להבטיח הסרה מלאה של glucose oxidase ממעגל הזרימה, לחצו על baseline בתוכנת ה-pro data control.החליפו את התמיסה במזרק המאגר F בתמיסת האנזים. סובבו את השסתום של F למצב ההנעה (drive). לחצו על "empty the stop syringe" בתוכנת הבקרה pro data.דחפו את תמיסת האנזים ממזרק ההנעה F דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה התואמת. חזרו לתוכנת בקרת הנתונים (pro data control software) כדי להגדיר את זמן הרכישה ל-60 שניות. ודאו ששני מזרקי ההנעה מלאים בתמיסות התואמות להם ושבוכנות ההנעה נמצאות במגע עם בוכנות מזרקי ההנעה.סובב את שני השסתומים למצב ההנעה (drive) ולחץ על acquire בתוכנת הבקרה pro data כדי לבצע את ההנעה. רכוש נתונים ספקטרליים של הצורה המחושנת של האנזים בשלוש חזרות, תוך שימוש בערך ה-A 4 52 nanometer שהתקבל מההנעות. קבע את ריכוז האנזים לפני הערבוב והכן ארבעה מיליליטר של תמיסת N-A-D-P-H.מלאו את מזרק מאגר המילוי C בתמיסת N-A-D-P-H המרוכזת פי 1.5, ורוקנו ומלאו מחדש את מזרק העצירה שלוש פעמים כפי שהודגם קודם לכן. כעת, רכשו ספקטרומים במהלך רדוקציית האנזים תוך שטיפת התכנים ממעגל הזרימה באמצעות בופר פוטסיום פוספט אנאירובי 100 millimolar pH 7.5. כעת לחצו על baseline בתוכנת הבקרה pro data.לאחר מכן, ערבבו 200 µL של תמיסת מלאי האנזים עם 1000 µL של בופר פוספיהט פוטסיום אנאירובי בריכוז 100 mM, pH 7.5. החליפו את התמיסה במזרק המאגר A בתמיסת האנזים.העבירו את שסתום A למצב הנעה (drive) בתוכנת הבקרה של pro data. לחצו על stop syringe empty. דחפו את תמיסת האנזים ממזרקת הנעה A דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה.הגדירו את זמן ההשהיה ל-0.5 seconds ואת זמן הרכישה ל-60 seconds. ודאו שכל מזרקי ההנעה מלאים בתמיסות המתאימות להם ושבוכנות ההנעה נמצאות במגע עם בוכנות מזרקי ההנעה. לאחר מכן, העבירו את כל שסתומי ההנעה למצב הנעה ולחצו על acquire בתוכנת הבקרה pro data control.השיגו נתונים ספקטרליים של הצורה המחומצנת של האנזים בשלישייה. לאחר מכן, החליפו את התמיסה במזרק המאגר B בתמיסת N-A-D-P-H בריכוז הגבוה פי 1.5 מתמיסת האנזים שבמזרק A. העבירו את שסתום B למצב ההנעה (drive) ורוקנו ומלאו מחדש את מזרק העצירה שלוש פעמים, כפי שהודגם קודם לכן בחלון לוח הבקרה.הגדירו את זמן ההשהיה ל-0.5 שניות. בנקודת רכישה של 20 שניות, החליפו את התמיסה במזרק המאגר בבופר מחומצן. סובבו את שסתום C למצב ההנעה.בצעו שטיפה של שלוש פעמים בתוכנת הבקרה pro data. הגדירו את זמן ההשהיה ל-15 שניות ואת זמן הרכישה ל-900 שניות. המשיכו לרכוש ספקטרה במהלך החמצון החוזר של האנזים המחוזר באופן מלא במכשיר ה-stopped flow.ניתן לנטר את החיזור האנאירובי של SID A עם N-A-D-P-H על ידי מדידת שינויים במצב החמצון-חיזור של הפלבין באמצעות בליעה ב-452 nm. שינויים ספקטרליים נרשמים לאורך זמן, מה-SID A המחומצן ועד לספקטרום האחרון של SID A מחוזר באופן מלא. ניתן לקבוע את הקצב של שלב אנזימטי זה על ידי התאמת הנתונים למשוואה המתאימה. ניתן לקבוע את קצב החמצון ואת תוצרי הביניים של התגובה באמצעות מצב ערבוב כפול של stopped flow בתגובה זו על ידי AF Sid A. תוצר הביניים C four A Hydroxi flavin מזוהה בבירור עם lambda max של 380 nm, ולאנזים המחומצן יש lambda max של 450 nm.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. זכרו לוודא שהתמיסות הן אנאירוביות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי הדרך לחקור הן את הייון היחסי והן את הייון העלקיטיבי של FLA, כשלב מקדים לניסויים המשכיים כמו כימיה מהירה.Quentin יכול לסייע להבהיר את טבעם העצוב של תוצרי הביניים.

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מקור:אלטרה ליאו1, לואיזה קרדוסו1, סבין שמיט1, אריך גניגר11אורובורוס אינסטרומנטססרטון זה מסביר כיצד שטף החמצן משמש להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בתאי יונקים חיים וחדירים. הוא מדגים את השימוש הרציף בדיגיטונין, סובסטרטים מטבוליים, ADP, מצמד ומעכב לאפיון מצבי נשימה שונים. פרופיל שטף החמצן המתקבל חושף את תפקוד המיטוכונדריה ויעילות צימוד האנרגיה בתנאים מוגדרים.

מדידות שטף חמצן להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בתאים חיים וחדירים

המיטוכונדריה מכילה מספר אנזימים תלויי-פלווין שיכול לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS). ניטור ROS שחרור שאתרים בתוך המיטוכונדריה הוא מאתגר עקב תגובות לוואי לא רצויות. אנו מציגים שיטה קלה, זולה עבור הערכה ישירה של המחירים יליד לשחרור ROS באמצעות מטוהרים flavoenzymes ו- microplate fluorometry.

מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי

כאן אנו מציגים עבור טיהור חלבון אנאירובית, ריכוז חלבון אנאירובית, ואפיון עוקבות קינטי משתמש במערכת אלקטרודה חמצן פרוטוקול. השיטה מומחש באמצעות האנזים DesB, אנזים dioxygenase אשר פעיל כאשר מטוהרים ומאוחסנים בסביבה אנאירובית ויציבה יותר.

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון המולקולרי של פרוטון רוברטסונית על פני הממברנות השומנים של ליפוזומים יחיד, ציטוכרום בו3  כדוגמא. שילוב אלקטרוכימיה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, pH לשינויים לומן של שלפוחית אחת, המכילה יחיד או אנזים מרובים, ועוזרת שנותחו בנפרד.

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

הערכת זרחון חמצוני באמצעות מד נשימה ברזולוציה גבוהה הפכה לחלק בלתי נפרד מהניתוח הפונקציונלי של מיטוכונדריה ומטבוליזם של אנרגיה תאית. כאן אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של אנרגיה תאית באמצעות מדים מבוססי תאים ומיקרו-פלטות ברזולוציה גבוהה ודנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר.

Respirometry ברזולוציה גבוהה להערכת ביו-אנרגיה בתאים וברקמות באמצעות מדים מבוססי תאים ולוחות

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשבתת חיידקים פתוגניים עם מיני חמצן תגובתי המיוצרים במהלך פוטוליזה של פלווין מונונוקלאוטיד (FMN) תחת קרינת אור כחול וסגול בעוצמה נמוכה. פוטוליזה FMN הוכחה כשיטה פשוטה ובטוחה לתהליכים סניטריים.

השבתה של פתוגנים באמצעות פוטוליזה של אור נראה של ריבופלבין-5′-פוספט

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

כאן אנו מציגים פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לניתוח ביו-אנרגטיקה בזבובי פירות מוטנטיים מסוג PINK1B9-null. השיטה משתמשת בפרוטוקול Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

מחקר זה מציג מתודולוגיה לחקר השפעות קסנוביוטיות על תפקוד המיטוכונדריה באמצעות בדיקות ספירומטריות ואנזימטיות. הוא בוחן אפנון שרשרת הובלת אלקטרונים במינים שונים, ומציע תובנות לפיתוח ממוקד של חומרי הדברה ביולוגיים נגד מחלות המועברות על ידי וקטורים של חרקים.

חשיפת הובלה קסנוביוטית והשפעות במיטוכונדריה מבודדת: תובנות מבדיקות רספירומטריות ואנזימטיות

חקור את מנגנוני התגובה של SidA מ-Aspergillus fumigatus באמצעות ספקטרוסקופיית stopped-flow. שיטה זו מאפשרת מדידת קבועי קצב של תוצרי ביניים וניתוח שינויים ספקטרליים לאורך זמן.

מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

גלה סרטונים נוספים