Name: מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: למד שיטת סינון פנוטיפית לבידוד מוטציות Toxoplasma gondii רגישות לטמפרטורה ביציאה מתאי מארח. השיטה משתמשת במוטגנזה כימית ובידוד מוטנטים עם פגמים ביציאה לחקירת מנגנונים מולקולריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי איגוד הלב האמריקני המדען פיתוח גרנט 0635480N ואת המכונים הלאומיים לבריאות מענק מחקר AI081220. BIC נתמך על ידי קרן עין האבירים הטמפלרים מענק מחקר.

<ol><li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+%5BCa2%2B%5D+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li>
<li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li>
<li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li>
<li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+dithiol-induced+Ca2%2B+flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li>
<li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li>
<li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li>
<li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li>
<li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li>
<li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li>
<li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium%2Fhydrogen+exchanger+in+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li>
<li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li>
<li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li>
<li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba.+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li>
<li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li>
<li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li>
<li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li>
<li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li>
<li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li>
<li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li>
<li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li>
<li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li>
<li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca%282%2B%29+release+from+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+%28IP%283%29%29%2Fryanodine-sensitive+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li>
<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
<li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

<html> פרוטוקול תיאר מספק שיטה יעילה לבודד מוטנטים Toxoplasma עם מום יציאה. אנחנו מבודדים בהצלחה מוטציות לאורך השלבים השונים של מסלול יציאה, שחלקם יש פנוטיפ הפלישה כפול 13. השפעה על הפלישה ניתן לקבוע באמצעות מה שמכונה אדום ירוק assay, אשר מבדיל בין פלש ללא פלש טפילים ידי מכתים ההפרש נוגדנים 23,24. עבור שני מבחני הפלישה יציאה זה יכול להיות נוח להביע את הסמן חלבון autofluorescent בציטופלסמה של טפילים 13,22. עם זאת, אם להיות טפילים mutagenized...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 M לניירות ערך DMSO, החנות ב -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 M לניירות ערך DMSO, החנות ב -20 ° C </td></tr><tr><td> Dextran סולפט </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 מ&quot;מ לניירות ערך PBS </td></tr><tr><td> הבדל מהירה </td><td> EMD כימיקלים </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> מסנן בעל </td><td> קולמן בן הזוג </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 מיקרומטר פוליקרבונט המסנן </td><td> Whatmanשלייכר &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> האוסר מדעי </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 חממות </td><td> יצרנים שונים </td><td></td><td> CO Humidified, 5% 2, ב 35, 37 ו - 40 ° C </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> יצרנים שונים </td><td></td><td> הפוך באופן אידיאלי, תחום רחב במטרה שמן 63x או 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (לפי בלאק ואח&#39; 11.): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 98.0 מ&quot;ל הנקס תמיסת מלח מאוזנת (מספר קטלוג Hyclone SH30588) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl 1M MgCl 2 (100 בסוף mM) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl 1M CaCl 2 (100 בסוף mM) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.0 מ&quot;ל 1M Hepes pH 7.3 (20 בסוף mM) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 84 מ&quot;ג NaHCO 3 (סוף 10 mM) </li></ul>

מסך גנטית לבודד toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

נפוצה, מחייבים תאיים, protozoan הטפיל Toxoplasma gondii גורם למחלות אופורטוניסטית ב חיסונית שנפרצו חולים וגורם למומים מולדים עם זיהום מולד. מחזור שכפול ממס מתאפיינת בשלושה שלבים: 1. הפלישה פעיל של תא פונדקאי גרעיני: 2. שכפול בתוך התא המארח, 3. יציאה פעילה מן התא המארח. מנגנון של יציאה היא יותר ויותר להיות מוערך כתהליך, ייחודי פיקוח הדוק, אשר עדיין ממעטים להבין ברמה המולקולרית. מסלולי איתות יציאה בבסיס אופיינו באמצעות סוכני פרמקולוגיים הפועלים על היבטים שונים של מסלולים 1-5. לפיכך, גורמים עצמאיים שונים של יציאה זוהו שכל להתכנס על שחרורו של Ca 2 + תאיים, סימן שהוא גם קריטי עבור הפלישה התא המארח 6-8. תובנה זו הודיע ​​הגן המועמד הגישה שהוביל identiאחת מהבעיות הנגזרות מהחלוקה של הצמח כמו סידן קינאז החלבון תלויה (CDPK) מעורב יציאה 9. בנוסף, פריצות הדרך האחרונות מספר יציאה הבנה נעשו באמצעות (כימי) גישות גנטיות 10-12. לשלב שפע של מידע תרופתי עם נגישות גנטי גדל והולך של Toxoplasma לנו לאחרונה הוקמה מסך המאפשר העשרה מוטציות טפיל עם פגם יציאה התא המארח 13. למרות mutagenesis כימי באמצעות N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) או אתיל methanesulfonate (EMS) שימש במשך עשרות שנים בחקר הביולוגיה Toxoplasma 11,14,15, רק לאחרונה יש מיפוי גנטי של מוטציות שבבסיס פנוטיפים הופכים לשגרה 16 -18. יתר על כן, על ידי יצירת מוטציות רגישות טמפרטורה, תהליכים חיוניים ניתן גזור ואת הגנים הבסיסיים מזוהה באופן ישיר. מוטציות אלה מתנהגים כמו wild-type תחת טמפרטורה מתירנית (35 ° C), אבל לא מצליחים עמ &#39;roliferate בטמפרטורת כובל (40 ° C) כתוצאה של מוטציה הנדון. כאן אנו להמחיש שיטה חדשה ההקרנה פנוטיפי לבודד מוטנטים עם פנוטיפ הטמפרטורה רגיש יציאה 13. האתגר עבור מסכי היציאה היא להפריד egressed מן הלא egressed טפילים, אשר מורכבת על ידי מהיר מחדש הפלישה הדביקות הכללי של טפילים לתאי המארח. מסך יציאה הוקמה בעבר היה מבוסס על סדרה של צעדים מסורבלת biotinylation להפריד בין תאיים טפילים תאיים 11. שיטה זו גם לא ליצור מוטנטים מותנים וכתוצאה מכך פנוטיפים חלשים. השיטה המתוארת כאן מתגבר מצורף חזקה של egressing טפילים על ידי הכללת מתחרה glycan, סולפט dextran (DS), המונע טפילים יידבקו אל התא המארח 19. יתר על כן, טפילים תאיים נהרגים במיוחד את ידי pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), מה שמשאיר טפילים תאייםללא פגע 20. לכן, עם מסך פנוטיפי חדש במיוחד לבודד מוטנטים טפיל עם פגמים יציאה יזומה, כוחה של הגנטיקה כעת ניתן לפרוס באופן מלא לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התא המארח יציאה.

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של כמה<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egresses מהתא המארח שלה. הפרוטוקולים ניתנים כימית mutagenize טפילים, להעשיר את מוטנטים עם פגמים יציאה יזומה, ולאמת את הפנוטיפ של מוטציות משובטים.

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

הטפיל הפרוטוזואי *Toxoplasma gondii*, טפיל תוך-תאי אובליגטורי הנפוץ רחבה, גורם למחלה אופורטוניסטית בחולים עם מערכת חיסון מוחלשת וגורם ללידה...

סרטון זה מדגים שיטה חדשה לסריקה פנוטיפית לבידוד מוטנטים בעלי פנוטיפ של יציאה (egress) רגישה לטמפרטורה. מוטגן וטפילים מוספים לתרביות של פיברובלסטים מעור של בן אדם שנדבקו ב-Toxoplasma. במשך שעתיים, הטפילים שאינם פולשים מוסרים והבקבוק מועבר ל-40 °C כדי להשרות את התפתחות הפנוטיפ.לאחר 26 שעות, הוואקואולות מכילות שמונה עד 16 טפילים. לאחר מכן, התאים מעוררים באמצעות תרכובות המ 유גרומיות ליציאה (egress inducing compounds). טפילים מוטנטים עם פגם ביציאה יישארו תוך-תאיים, בעוד שטפילים מסוג הבר (wild type) יצאו אל המצע.הטפילים מסוג הבר (wild type) מוסרים באמצעות שטיפה, והתאים הנותרים מדגרים שוב בטמפרטורה של 35 °C כדי להעשיר את אוכלוסיית המוטנטים. לבסוף, הפנוטיפ המוטנטי מאומת, וקלונים של טפילים בודדים מבודלים מהאוכלוסייה המועשרת באמצעות דילול מגביל (limiting dilution). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת השאיפה הביולוגית (bio inhalation), הוא שההעשרה הספציפית של מוטנטים של יציאה (egress mutants) יעילה הרבה יותר.קיבלנו תחילה את הרעיון לשיטה זו כאשר זיהינו מוטנט של יציאה (egress mutant) מתוך פאנל של מוטנטים עם פגמים בצמיחה. באמצעות מוטנט זה, ביצענו אופטימיזציה להליך הסריקה על ידי ערבוב ביחסים שונים עם טפילים מסוג בר (wild type). את הדגמת ההליך יבצע בראדלי קולמן, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי.נוהל זה משתמש בתרכובות ובנוזלים מוטגניים ביותר וכן בטפיל זיהומי. השימוש בציוד מגן מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות כפולות ומCבטחה ביולוגית, הוא חיוני עבור Toxoplasma Gandhi. יש לאסוף כל פסולת נוזלית הנוצרת בנפרד לצורך סילוק נאות.התחל בהדבקת תאי פיברובלסט של עור דגדגן אנושי (HFF) שהגיעו למצב של התלכדות (confluent), עם מיליליטר אחד של tachy Lloyds שפורקו זה עתה בתווך ed one. לאחר מכן, הנח את הבקבוק באינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך 18 עד 25 שעות. למחרת, החלף את התווך ב-10 מיליליטר של תווך המכיל 0.1% fetal bovine serum, והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.לאחר הדגירה, הוסיפו 0, 12.5, 25, 50 או 100 µL של מוטגן ENU לכל בקבוק. דילולות העבודה יהיו 1.25, 2.5, 5 ו-10 mM בהתאמה. הוסיפו עד 100 µL של DMSO לכל בקבוק.דגרו במשך ארבע שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. שטפו את השכבה החד-שכבתית (monolayer) עם 10 milliliters של PBS קר, 3 פעמים למשך 10 שניות. הוסיפו 5 milliliters של PBS והשתמשו במגרדת תאים (cell scraper) כדי לשחרר את השכבה החד-שכבתית.לאחר מכן, בעזרת מספריים חזקים, גזרו את קצה כיסוי המחט כך שהמחט לא תהיה חשופה. בשלב הבא, העבירו את התאים למזרק והעבירו אותם דרך מחט בכיול (gauge) 26.5. כדי להסיר פיזית את הטפיל מהפיברובלסטים, מעברים מרובים דרך המחט יעלו את יעילות שחרור הטפילים מהתא המארח.חברו מסנן פוליקרבונט של 3.0 micrometer למזרק. העבירו את התאים לתוך המזרק באמצעות המחט ודחפו אותם דרך המסנן לתוך מבחנה, ולאחר מכן העבירו את הטפילים לתוך המוצימודומטר (hemo cytometer) לצורך ספירה. ההיבט הקשה ביותר בפרוצדורה זו הוא ההבחנה בין הטפילים לבין פסולת תאית.כדי להבטיח הצלחה, חשוב לאפשר לטפילים לשקוע לפני הספירה. לאחר המתנה של חמש דקות לשקיעת הטפילים, ספרו אותם. ברגע שריכוז ה-toxoplasma נקבע, דללו אותם ל-3,333 טפילים למילליליטר ב-ED one לנפח של 10 milliliters.דרושים 33,333 טפילים. הוסף שלושה מיליליטרים לבאר הראשונה של פלטה בעלת שש בארות של תאי HFF כדי להדביק אותם ב-10,000 טפילים. לאחר מכן, בצע דילול סדרתי של הטפילים פי עשרה לאורך שלוש הבארות הבאות על ידי העברה של 300 µL מבאר אחת לבאה אחריה.השאירו את הצלחות ללא הפרעה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שבעה ימים. לאחר שחלף שבוע, שאבו את המצע וקבעו את התאים על ידי הוספת 3 mL של 100% ethanol לכל באר למשך 15 דקות. לאחר הסרת ה-ethanol, צבעו את התאים על ידי הוספת 3 mL של תמיסת crystal violet לכל באר למשך 15 דקות.לבסוף, שטפו כל באר עם 3 mL של PBS למשך דקה אחת. לאחר שהפלטה התייבשה, ספרו את הפלאקים ובחרו את ריכוז המוטגן הדרוש כדי להשיג הישרדות של 30% מהטפילים שנחשפו. מינון הגורם להריגה של 70% היה בשימוש היסטורית והוא משרה פחות מ-100 מוטציות נקודתיות לגנום.השלב הבא של הפרוצדורה הוא העשרת מוטנציית ה-egress באוכלוסייה. לאחר הרחבת האוכלוסייה, יש להוסיף 120,000 טפילים שlyed לאחרונה לתאי HFF נשפכים (confluent) ב-10 milliliters. לאחר מכן, יש לדגור למשך שעתיים ב-35 degrees Celsius.פעולה זו תסנכרן את האוכלוסייה על ידי הגבלת זמן הפלישה. לאחר הדגירה, שאבו את המצע ושטפו את התאים למשך 10 שניות עם 10 milliliters של PBS קר. הוסיפו 10 milliliters של מצע ED one מועשר ב-25 milligrams per milliliter של dextran sulfate.פעולה זו תרווי את החלבונים על פני השטח הקושרים גליקנים של הטפילים, כך שלא יוכלו להיצמד שוב ולהדביק מחדש את תא המאכסן. דגרו את הבקבוק למשך 26 שעות באינקובטור לח בטמפרטורה של 40 °C עם 5% CO2. במהלך זמן זה, חלבון במבנה תקין יוחלף בחלבון רגיש לטמפרטורה בעל מבנה שגוי.ביום למחרת, דללו את משרה היציאה (egress inducer) הנבחר לריכוז העבודה בתוך מבחנה של 15 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר H-B-S-S-C מועשר ב-25 milligrams per milliliter dextran sulfate. הניחו את המבחנה במקלחית כדי לחמם את התמיסה מראש למשך 30 דקות.שאבו את המצע מהבקבוקים המודבקים בטפיל והוסיפו את תמיסת מעודד היציאה (egress inducer) שחוממה מראש. דגרו בטמפרטורה של 37 °C כפי שמצוין במסמך המצורף. לאחר מכן, שאבו את המצע ושטפו למשך 10 שניות.הוסיפו 10 מיליליטר של PBS קר ו-10 מיליליטר של ED one מועשר ב-25 מיליגרם למילליליטר dextran sulfate ו-50 micromolar pyridine DIO carbamate, ולאחר מכן הדגירו למשך חמש שעות ב-35 degrees Celsius. לאחר ההדגרה, שאבו את המצע ושטפו פעם אחת עם PBS למשך 10 שניות.לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של מצע EED, והחזירו את הבקבוק לאינקובטור בטמפרטורה של 35 degree Celsius. נערו מדי יום כדי לפזר את הפarasites שיצאו.המשך את הדגירה עד שהטפילים ישמידו את השכבה החד-שכבתית (monolayer). כעבור שבעה ימים לאחר סינון ההעשרה, האוכלוסייה תורבה למעבר אחד. לאחר מכן, הפנוטיפים מאושרים באמצעות בדיקת יציאה (egress assay).החדירו 20,000 טפילים לכל באער של פלטת 24 באערים המכילה תאי HFF בשכבה רציפה (confluent) שגודלו על לבישי זכוכית, והדגירו למשך שמונה שעות באינקובטור בטמפרטורה של 35 degree Celsius כדי לאפשר פלישה של כל הטפילים שבמצע בטמפרטורה המאפשרת (permissive temperature). לאחר מכן, העבירו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 40 degree Celsius למשך 24 שעות כדי להשרות את הפנוטיפ ולגדל oles המכילים שמונה עד 24 טפילים, לאחר שטיפת כל באער ב-1 milliliter PBS למשך 10 שניות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו 1 milliliter של משרה יציאה (egress inducer) שחומם מראש ודולל ב-H-B-S-S-C, והדגירו למשך הזמנים המתוארים בפרוטוקול הכתוב המצורף.שאבו את המצע וקבעו את הדגימות על ידי הוספת 1 mL של 100% methanol לכל באר, והדגרירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו עם 1 mL של PBS בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה והכנת הנסליות, השתמשו במיקרוסקופ עם עדשה אובייקטיבית של 40 עד 60x כדי לספור את אחוז ה-S egress לעומת הוואקואולות התוך-תאיות. לאחר תיקוף הפנוטיפ של אוכלוסיית מוטנט ה-egress המועשרת, מבצעים שיבוט של האוכלוסייה הפוליקלונלית כדי לקבל שיבוטים של טפילים בודדים.לאחר קביעת ריכוז הטפילים, דללו אותם ל-500 טפילים למילליטר במצע ED one בתוך פלטת 384 בארות המכילה שכבה רציפה (confluent monolayer) של תאי HFF. החליפו את המצע ב-40 µL למבאר של מצע ED one באמצעות פיפט רב-ערוצי. ארבע אוכלוסיות פוליקלונליות מיוצגות בצבעי אדום, כחול, צהוב וירוק.באיור זה ניתן לבצע שיבוט על פלטה כדי להשיג זאת באמצעות פיפט. 40 µL למבב של מוטנט 1 מדולל לתוך מבבבים C3 עד C12, מוטנט 2 לתוך מבבבים C13 עד C22, מוטנט 3 לתוך מבבבים H3 עד H12, ומוטנט 4 לתוך מבבבים H13 עד H22. הנפח הכולל בכל מבבב צריך להיות כעת 80 µL.לאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצי, בצעו פיפוט של התמיסה מעלה ומטה חמש פעמים, והעבירו 40 µL לשורה שמתחת לשורת ההתחלה. המשיכו בדילולות סדרתיות דו-מכפלות אלו עד לשורה H עבור מוטנטים 1 ו-2, או לשורה N עבור מוטנטים 3 ו-4. השליכו את ה-40 µL העודפים מהשורה האחרונה.דגרו באינקובטור בטמפרטורה של 35 degrees Celsius למשך שבעה עד 10 ימים מבלי להזיז את הפלטה. בשבוע שלאחר מכן, בדקו את הבארים תחת מיקרוסקופ הפוך עם עדשה של 10 עד 20 x כדי לאתר פלאקים בודדים הנראים כחורים בשכבה החד-שכבתית (monolayer). בחרו ארבע בארות לכל מוטנט שבהן מופיע פלאק בודד, והעבירו את הטפילים לבקבוק תרבית רקמות T 12.5 המכיל שכבה רצופה של תאי HFF ומלא בחמישה milliliters.גדלו את הטפילים במצע ED one בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 35 degree Celsius. נערה את הבקבוקים מדי יום כדי לפזר את הטפילים החוץ-תאיים. תהליך זה נמשך בדרך כלל שבעה ימים.בדיקות פלאקים (Plaque assays) בוצעו בצלחת שש-בארות תוך שימוש בריכוזים שונים של המוטגן EMS ובמספרים שונים של טפילים לכל בארה. כפי שמוצג בסרטון זה, הנקודות הלבנות בבארות המוצגות כאן הן פלאקים של טפילים שנוצרו בשכבה אחת (monolayer) של תאי HFF בצלחות שטופלו ב-EMS. התוצאות מבדיקות פלאקים אלו שימשו ליצירת עקומות הישרדות של טפילים שנחשפו למינונים עולים של EMS ו-ENU.המינון הגורם להריגה של 70% נבחר עבור ניסויי המוטגנזה. בניסוי נפרד, אחוז הפנוטיפ של מוטנטים עם פגם ביציאה (egress) באוכלוסייה לאחר העשרה הוערך באמצעות ציטומטריית זרימה, כפי שמוצג כאן. כאשר יחס ההתחלה של טפילים מוטנטים עם פגם ביציאה ביחס לטפילים מסוג בר (wild type) היה אחד ל-10,000, הושגה רמת טוהר של 80% באמצעות העשרה.עם זאת, כאשר יחס ההתחלה היה טפיל אחד ל-100,000, האוכלוסייה המבודדת היוותה רק 1% עד 2%. נתונים אלו מצביעים על כך שכוח ההעשרה של הסריקה הוא פי 1000. בניסוי שלישי, היציאה (egress) הושרה על ידי יון הסידן A23187. בתמונות אלו, החצים מסמנים ארבעה VAEs שונים המכילים ארבעה עד שמונה טפילים המבטאים YFP בביקורות.עם זאת, החצים מסמנים ארבע קבוצות של טפילים מפוזרים המשקפות ארבעה אירועי יציאה (VAs) עצמאיים. לפיכך, ניתן לקבוע בקלות את היחס בין פנוטיפים מוטנטיים לפנוטיפים מסוג בר (wild type) על ידי ספירה בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון קומפלמנטציה קוסמית או ריצוף גנומי מלא, כדי לזהות את המוטציה הגורמת לכך ובכך את הגן המבוקש.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע טיטרציה של מוטגנית רצויה, ביצוע מוטגנזה לאוכלוסיית טפילים של toxoplasma, ובידוד של מוטנטים בודדים בעלי רגישות לטמפרטורה בשלב היציאה (egress) מאותה אוכלוסייה מוטגנית. זכרו כי עבודה עם טפילים של toxoplasma העמידים ל-param methymine עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הרכבת משקפי מגן, בעת ביצוע הליך זה.

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מדגימים כאן reprogramming epigenetic באמצעות העברה תא סומטי גרעיני (SCNT) יכול לשמש ככלי לייצור מודלים העכבר עם קולטן T מוגדרים מראש תא (TCR) ספציפיות. עכברים אלה transnuclear לבטא את TCR המתאימה מוקד אנדוגניים שלהם תחת שליטה של ​​האמרגן אנדוגני.

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג...

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי וכל רצף הגנום. בנוסף, מערכת להמרת ה-DNA בתאים נגועים מתוארת שיכול לשמש למיפוי גנטי. שיטה זו יכולה להיות ישימה באופן נרחב למערכות חיידקים חסרות מערכות טרנספורמציה וכלים גנטיים מולקולריים.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Forward genetics היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים בפתוגנים תוך-תאיים החשובים לעמידות לחסינות אוטונומית של התאים. הגישה הנוכחית משתמשת בתאי חיסון מולדים, במיוחד מקרופאגים, כדי לזהות גנים חדשים של טוקסופלזמה גונדי החשובים להתחמקות חיסונית.

קדימה גנטיקה מסכי שימוש המקרופאגים לזיהוי<em&gt; Toxoplasma gondii</emחסינות אוטונומית נייד להתנגדות לIFN-γ-Dependent&gt; גנים חשובים

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

פרטים מוצגים על איך מיפוי QTL עם גנום שלם רצף גנטי מבוסס ניתן להשתמש כדי לזהות הגן עמידות התרופה ב Toxoplasma gondii וכיצד ניתן לאמת זאת עם מערכת CRISPR / Cas9 כי ביעילות עריכת יעד גנומי, במקרה זה גן ההתנגדות לסמים.

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

מוצג כאן הוא פרוטוקול להעריך את היעילות עכבות של תרכובות כימיות נגד הצמיחה מחוץ למוח טוקסופלזמה gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה. הטכניקה משמשת כדי לאשר את העיכוב ספציפיות על ידי מחיקה גנטית של הגן היעד המתאים. עיכוב של LHVS נגד TgCPL פרוטאז מוערך כדוגמה.

קביעת יעילות מעכבי כימית נגד הצמיחה טוקסופלזמה Gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה

פרוטוקול זה משתמש יזם פלורסנט-כתבים, מיקרוסקופית תא חי, וחילוץ הכללה בודדים בגישה גנטית קדימה מכוונת לזהות ולבודד מוטציות התפתחותיות של כלמידיה trachomatis.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר וגנוטיפ של זני טוקסופלזמה גונדי באמצעות ריצוף ננופורים נייד של סמנים גנטיים נבחרים, המאפשר זיהוי זן ממוקד וניתן להרחבה במבודדים המתוחזקים במעבדה, עם יישום פוטנציאלי בעתיד בסביבות ניטור.

ריצוף רב-לוקוס לטייפון זן של טוקסופלזמה גונדי

למד שיטת סינון פנוטיפית לבידוד מוטציות Toxoplasma gondii רגישות לטמפרטורה ביציאה מתאי מארח. השיטה משתמשת במוטגנזה כימית ובידוד מוטנטים עם פגמים ביציאה לחקירת מנגנונים מולקולריים.

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

גלה סרטונים נוספים