Name: בזרימת כולסטרול Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: למדו שיטה לכימות שחרור כולסטרול מתאים תרבית ולמדידת יכולת קבלני פלזמה לקלוט כולסטרול. השיטה מסייעת לחוקרים להבין הומאוסטזיס של ליפידים ומטבוליזם תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד לבריאות ומחקר רפואי המועצה של אוסטרליה (NHMRC) (526615 ו - 545906) ו בין השאר על ידי תוכנית של ממשלת ויקטוריאני OIS. DS הוא בחור של NHMRC.

1. הכנת [3 H] כולסטרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונה קטר, לוותר על הסכום הנדרש של כולסטרול [3 H] לתוך צינור microfuge 1.5 מ&quot;ל (0.5 μCi (19 kBq) לכל גם נדרש assay אופייני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם [3 H]-כולסטרול הוא תלוי טולואן, לייבש אותו לחלוטין עם גז N2 ו resuspend אתנול עם 100% ריכוז סופי של 1 μCi (37 kBq / μl. וורטקס ומערבבים היטב. </li></ol> 2. ציפוי תאים וסימון כולסטרול נייד פרוטוקול זה נבדק באמצעות סוגי תאים הבאים: ומונוציטים האדם, 4.5 THP-1 אדם מונוציטים למוצרי ומקרופגים 6,7,8, גלם 264.7 ומקרופגים Murine 5,9,10,11, תאים הלה 12, וריד הטבור האדם אנדותל תאים (HUVEC), BHK-21 תאים 9, fibroblasts אדם ועכבר 13,14, HepG2 תאים hepatocarcinoma אדם 15 ו, בצורה שונה, החל טסיות &lt;sup&gt; 16. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ולספור אותם. התאים לתוך צלחת של 12 צלחות גם בצפיפות הסופי של 0.2x10 6 תאים בכל טוב בינוני 0.9 מ&quot;ל מלאה. תאים ימשיך לגדול ויגיע 0.8x10 6 תאים לכל גם כאשר הניסוי בזרימת. עבור תאים שאינם מתחלקים, כמו הבדיל THP-1 תאים, צפיפות זריעה צריך להיות 0.8x10 6 תאים לכל טוב. אם באמצעות 6 - או 24 גם צלחות, כפול או חצי את מספר התאים בכל טוב בהתאמה. מספר בארות צריך להיות מספיק קביעות ארבע פעמים עבור כל תנאי הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הבידול של THP-1 התאים נדרשת, להוסיף PMA (הריכוז הסופי 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתקשורת של 48-72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף aliquot קטנה של מדיה לתוך צינור המכיל microfuge [3 H] כולסטרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצדדים של הצינור עם התקשורת לפני הוספת [3 H] כולסטרול לתוך aliquot נפרד של אמצעי התקשורת מלאים (100 μl / טוב). </li> &lt;li&gt; הוסף התקשורת המכילים [3 H] הכולסטרול על בארות עם תאים (נפח סופי לכל גם הוא 1 מ&quot;ל). אם אין טיפול בתאי נדרש לפני תיוג, תאים ניתן מצופה ב [3 H] בינוני כולסטרול המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 48 שעות בתרבית תאים בחממה (37 ° C, CO 5% 2). </li></ol> 3. איזון דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 48 שעות, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ. לוודא שהם בריאים הם במפגש כ 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה המכילה [3 H] כולסטרול. לשטוף את התאים בעדינות עם PBS. לחזור 3 פעמים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין סרום ללא התקשורת. במידת הצורך, להפעיל את התאים על ידי הוספת אגוניסט LXR (כגון, 901317 ב 1-4 mmol / L) או מחנה (0.3 μMol / L, עבור תאים ממוצא העכבר בלבד) כדי בסרום חופשי בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl מדיה חופשיים בסרום היטב כל אחד מהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 18 שעות תרבית תאים בחממה (37 ° C, CO 5% 2). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. בזרימת כולסטרול דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 18 שעות במדיום סרום חינם, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ. לוודא שהם בריאים confluent (מינימום 80% confluency). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של acceptors בזרימת הכולסטרול בדם ללא בינוני. דוגמאות acceptors כוללים: אפוליפופרוטאין AI (apoA-I) (הריכוז הסופי 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) (הריכוז הסופי 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל) Cyclodextrin (הריכוז הסופי 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל) פלזמה (הריכוז הסופי 1-2%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של סרום ללא מדיה עם acceptors היטב כל אחד מהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעזוב קבוצה אחת של בארות כדי לקבוע רקע בזרימת (בזרימת התקשורת חופשיים בסרום עם acceptor NO) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 2 שעות תרבית תאים אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). משך הדגירה בזרימת עשוי לנוע בין 30 דקות ועד 8 שעות לפי הצורך. </li></ol> 5. עיבוד שאmples <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות הדגירה לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מדיה לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל microfuge. ספין ב -14,000 סל&quot;ד 1-10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר Media 100 μl לתוך בקבוקון מ&quot;ל 7 נצנץ. הוסף 5 MLS של Insta-ג&#39;ל פלוס (PerkinElmer) תערובת מערבולת. לאחסן דגימות הנותרים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחות במקפיא למשך 30 דקות. הוסף 500 μl DH 2 O היטב כל אחד מהם. לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי כל התאים נוקף מעומק בארות. אם חסיד עדיין, או לעזוב את הצלחות עם DH 2 O על 4 מעלות צלזיוס בארות לילה או גירוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל התאים לא המריא, פיפטה למעלה ולמטה כדי לפרק את גושי תאים. העברת 100 μl לתוך צלוחיות 7 מ&quot;ל נצנץ. הוסף 5 MLS של Insta-ג&#39;ל פלוס (PerkinElmer) תערובת מערבולת. אחסן את לוחות הנותרים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלוחיות נצנץ על מונה נצנץ. להגדיר מונה לספור על [3 H] בDPM יחידות. </li></ol> 6. ניתוח תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיעור בזרימת הכולסטרול בא לידי ביטוי בדרך כלל שיעור הכולסטרול עבר התאים acceptor. הנוסחה הבאה נעשה שימוש: </li></ol><img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזרימת מסוימת מחושב כהפרש בין בזרימת בנוכחות או העדר acceptor (ריק). </li></ol><img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7. ציר הזמן <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8. נציג תוצאות דוגמה לתוצאות של ניסוי בזרימת כולסטרול מוצג איור. 1. בניסוי זה THP-1 מונוציטים אדם היו מובחנים אל מקרופאגים ו בזרימת הכולסטרול acceptors שונים היהנבדק. בזרימת כולסטרול עד בינוני ללא acceptors (&quot;ריק&quot;) היה 0.79% ואת ערך זה נחשב בזרימת שאינו ספציפי והיה מפחיתים את הערכים האחרים. בזרימת כולסטרול לאדם apoA-I (הריכוז הסופי 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל) היה 4.75%. מדגם פלזמה התייחסות נכלל לתוך הניסוי הזה כדי לפקח בין הניסוי השונות. מדגם התייחסות יכול לשמש נורמליזציה של נתונים על פני מספר רב של ניסויים, אבל מצאנו שנכון לחזור assay אם השונות היא גבוהה. פלזמה החולה (הריכוז הסופי 2%) נבדקה לפני ואחרי החולה קיבל טיפול תרופתי. הוא הגיע למסקנה כי התרופה לחולה הייתה השפעה שלילית על היכולת של פלזמה לתמוך בזרימת כולסטרול. דוגמה נוספת של תוצאות הניסוי בזרימת מוצג איור. 2. בניסוי זה הגלם 264.7 מקרופאגים הופעלו או לא יופעלו על ידי הדגירה לילה עם אגוניסט LXR TO-901317 (הריכוז הסופי1 μmol / L) בזרימת כולסטרול מדגם זהה של פלסמה אנושית (2%) נבדק. הוא הגיע למסקנה כי הפעלת ביטוי הסלולר של רשת ABC עם מובילי אגוניסט LXR מגביר את היכולת של התאים לשחרר את הכולסטרול acceptor תאיים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> באיור 1. בזרימת כולסטרול מן THP-1 תאים acceptors שונים. אחוז בזרימת כולסטרול (דהיינו, את שיעור הכולסטרול שכותרתו עבר התאים acceptor הוגדר) מוצגת לאחר ניכוי המקרים של ערכים ריקים. ממוצע ± סטיית תקן של קביעות ארבע פעמים, * p &lt;0.05. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> איור 2. בזרימת כולסטרול מ 264.7 אחוז מופעל או לא מופעל עם אגוניסט LXR כדי פלזמה האדם. RAW של בזרימת כולסטרול (דהיינו, את שיעור הכולסטרול שכותרתו עבר התאיםacceptor המצוין) מוצגת לאחר ניכוי המקרים של ערכים ריקים. ממוצע ± סטיית תקן של קביעות ארבע פעמים, * p &lt;0.001.

<ol><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li>
<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+feedback%3A+from+Schoenheimer%27s+bottle+to+Scap%27s+MELADL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation%3A+basic+concepts+and+physiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li>
<li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li>
<li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li>
<li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li>
<li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li>
<li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2FFunction+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides%3A+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li>
<li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li>
<li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li>
<li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li>
<li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+%28caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li>
<li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li>
<li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li>
<li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים שום אינטרסים מנוגדים הקשורים במחקר זה.

השיטה המתוארת למדוד בזרימת כולסטרול נועד למדוד את התנועה של כולסטרול מן התאים acceptor כולסטרול תאי. ישנם שיקולים קריטיים מספר בהבנה זו מתודולוגיה. Labelling ועל איזון המתודולוגיה המתוארת כולסטרול שכותרתו מתווסף סרום סרום המכיל. למרות שמעולם לא נחקר בהרחבה, ההנחה היא כי כולסטרול הוא משולב בתוך ליפופרוטאינים בדם והם נתפסות על ידי התאים. חשוב לאפשר מ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים \ תאים </td><td> הלה </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> השלם מדיה </td><td colspan="3"> RPMI - 10% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td><td> M199 - 5% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 1% סטרפטוקוקוס HEPES - 2% (1M) - 7% תוספת צמיחה תא האנדותל (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td> חינם מדיה בסרום </td><td colspan="3"> RPMI - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td><td> M199 - 1% L-גלוטמין - עט 1% סטרפטוקוקוס HEPES - 2% (1M) - תא האנדותל 7% לגדולה תוספת (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td> מעבר שיטה </td><td> 1 x טריפסין </td><td> השעיה </td><td> לגרד </td><td colspan="3"> 1 x טריפסין </td></tr><tr><td> מעבר יחס </td><td> 3:10 </td><td> 01:03 </td><td></td><td> 1:20 </td><td> 01:03 </td><td> 01:03 </td></tr><tr><td> הפעלת התא (לא חובה) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901317 - LXR-אגוניסט - גמר קונצרט כלשהו. 4 מיקרומטר </td></tr><tr><td> אחרים ריאגנטים </td><td></td><td> phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) - תא התמיינות - גמר קונצרט כלשהו. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בזרימת כולסטרול assay

Cholesterol Efflux Assay

תוכן כולסטרול בתאי יש לשמור בגבולות צרים מאוד, יותר מדי או מעט מדי כולסטרול בעוד כמה תוצאות תאים שיבוש של ממברנות הסלולר, אפופטוזיס ו נמק 1. תאים יכולים כולסטרול המקור סינתזה תאיים וממנה ליפופרוטאינים פלזמה, שני מקורות מספיקים כדי לספק את הדרישות באופן מלא של תאים כולסטרול. תהליכים של סינתזה ספיגת כולסטרול מוסדרים בחוזקה ליקויים של כולסטרול הן 2 נדיר. כולסטרול מופרזת היא בעיה נפוצה יותר 3. למעט hepatocytes וכן כמה תאים תואר adrenocortical, התאים אינם יכולים לבזות כולסטרול. לתאים יש שתי אפשרויות להפחתת כולסטרול התוכן שלהם: להמיר כולסטרול לתוך אסטרים cholesteryl, אופציה עם קיבולת מוגבלת כמו עומס יתר התאים עם אסטרים cholesteryl הוא גם רעיל, בזרימת כולסטרול, אפשרות בלתי מוגבלת עם יכולת פוטנציאלית. בזרימת כולסטרול הוא מפרטתהליך ific זה מוסדר על ידי מספר מובילי תאיים, כגון ה-ATP מחייב טרנספורטר קלטת חלבונים A1 (ABCA1) ו - G1 (ABCG1) ו הקולטן נבלות B1 סוג. Acceptor טבעי של כולסטרול בפלסמה הוא ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) אפוליפופרוטאין AI. Assay בזרימת כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית. הוא מודד את היכולת של התאים לשמור בזרימת כולסטרול ו / או את היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay מורכב מהשלבים הבאים. שלב 1: תיוג כולסטרול הסלולר באמצעות הוספת כולסטרול שכותרתו עד בינוני סרום המכיל ו דוגרים עם תאים של 24-48 שעות. צעד זה עשוי להיות משולב עם הטעינה של תאים עם כולסטרול. שלב 2: הדגירה של תאים בינוניים סרום ללא כולסטרול כדי לאזן בין כל שכותרתו בריכות כולסטרול תאיים. שלב זה עשוי להיות משולב עם הפעלת הסלולר CHolesterol מובילי. שלב 3: הדגירה של תאים עם acceptor תאי ו quantitation התנועה של כולסטרול שכותרתו מתאי כדי acceptor. אם מבשרי כולסטרול שימשו לתייג כולסטרול מסונתז החדש, שלב 1/4, טיהור של כולסטרול, ייתכן שיהיה צורך. Assay מספק את הפרטים הבאים: (א) כיצד טיפול מסוים (מוטציה, דפיקה למטה, ביטוי יתר או טיפול) משפיע על היכולת של התא כולסטרול בזרימת ו (ב) עד כמה את היכולת של acceptors פלזמה לקבל את הכולסטרול נגוע במחלה או טיפול. שיטה זו משמשת לעתים קרובות בהקשר של המחקר לב וכלי דם, הפרעות מטבוליות ו ניווניות, מחלות זיהומיות הרבייה.

Assay כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית ואת היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay כולל תיוג תאים עם איזון כולסטרול, הכולסטרול בין בריכות תאיים ושחרור של כולסטרול כדי acceptor תאיים.

בזרימת כולסטרול Assay

יש לשמור על תכולת הכולסטרול בתאים בתוך גבולות צרים מאוד; עודף או חסר של כולסטרול בתא מובילים להפרעה ב...

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטאוליפוזומים משמשים לחקר תעלות מטוהרות וטרנספורטרים שהוקמו מחדש בסביבה ביוכימית מוגדרת היטב. מודגם הליך ניסיוני למדידת פליטה בתיווך חלבונים אלה. מתוארים השלבים להכנת פרוטאוליפוסומים, ביצוע ההקלטות וניתוח נתונים כדי לקבוע כמותית את התכונות הפונקציונליות של החלבון המשוחזר.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

מטרת מחקר זה היתה להעריך במבחנה להורדת שומנים בדם סמים אפקטים ב להתכוונן המורפולוגיה של חלקיקים כולסטרול. השוואה של התרופות להורדת שומנים בדם חשף בווריאציות השפעתם ב להתכוונן התכונות מורפולוגי של חלקיקים כולסטרול.

דיפרנציאלית השפעות תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים

פרוטוקול זה מספק גישה יעילה מדידת ספיגת כולסטרול LDL במחירים זרם בזמן אמת באמצעות תא חי הדמיה למערכת סוגי תאים שונים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה למסך את פעילות פרמקולוגית של תרכובות להשפיע על זרם LDL תוך מעקב אחר עבור תא ומורפולוגיה cytotoxicity ומכאן פוטנציאליים.

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

מדידה של קיבולת בזרימת במבחנה כולסטרול סרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח כמו סמן עבור טרשת עורקים. במחקר הנוכחי, אנו לייעל לתקנן שיטה בזרימת להארכה-כולסטרול פלורסנט, לפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.

תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay

שתי שיטות של העשרה כולסטרול מוצגים: היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול כדי להעשיר את רקמות היונקים ואת התאים, ואת השימוש של פוספוליפיד זרחן מועשר מבוססי מפזרים (ליפוזומים) כדי להעשיר Xenopus oocytes. שיטות אלה הן אינסטרומנטלי לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול הגבוהות בתפקוד המולקולרי, הסלולר והעוגב.

העשרה של רקמות מיונקים וקסנפוס אוציטים עם כולסטרול

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול כיצד לבנות מיקרוסקופ ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS) של וריאציה נקודתית כדי למדוד דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים.

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

אנו מתארים שיטה לשימוש בציקלודקסטרין כדי לתווך חילופי שומנים של קרום הפלזמה עם ליפידים אקסוגניים. ניתן לשלב טכניקה זו עם ניסויים החוקרים חלבונים טרנסממברניים, המתנהגים באופן שונה בסביבות דמויות רפסודת שומנים מאשר בסביבות שאינן דמויות רפסודה.

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים למדידת כמות הפוספוליפיד הפלואורסצנטי שהוסר במיוחד מחלקיקי תורם שומנים על ידי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) הקיים בפלזמה או בסרום אנושי שלם. הראינו שמדד זה של פונקציונליות HDL מנבא מחלות לב וכלי דם אירועיות.

בדיקת פליטת פוספוליפידים ספציפית לליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.

גרורה ניסויית Assay

למדו שיטה לכימות שחרור כולסטרול מתאים תרבית ולמדידת יכולת קבלני פלזמה לקלוט כולסטרול. השיטה מסייעת לחוקרים להבין הומאוסטזיס של ליפידים ומטבוליזם תאי.

בזרימת כולסטרול Assay

גלה סרטונים נוספים