Name: גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: למדו שיטה לגידול ביופילמים של Mycobacterium tuberculosis בממשק אוויר-תזונה ולקביעת תדירות החיידקים העמידים לתרופות. טכניקה זו חיונית להבנת מנגנוני העמידות ופיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות בשחפת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה בוצעה עם תמיכה כספית מהמכון הלאומי לבריאות האמריקאי איגוד הריאות.

1. Biofilms גידול של מ &#39; שחפת בבקבוק 250 מ&quot;ל בורג כתרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה מדיה: ממיסים 0.5g של KH 2 PO 4, 0.5g של MgSO 4, 4G של Asparagine-L, 2G של חומצת לימון, 0.05g של אמוניום ציטראט Ferric, 60mL של גליצרול ב 900mL של מים. להתאים את ה-pH 7.0 ל עם NaOH. , החיטוי קריר זמן קצר לפני תחילת הניסוי, להוסיף ZnSO סטרילית 4 לריכוז הסופי של 0.1% w / נ מאז 7000 הוא mc 2 auxotroph pantothenate זן זה דורש גם חומצה פנטותנית ב 10μg/mL הריכוז הסופי. </li></ol> הערה: זהו ההרכב רמת התקשורת של Sauton המשמשים מ שחפת. עם זאת, אם נדרש מדיה מיוחדים אחרים יכולים לשמש גם עבור מינים mycobacterial אחרים. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה Inoculums: לגדול מ &#39; שחפת 7H9OADC עם 0.05% Tween-80 למשך שבוע, או 600 OD של 0.7-1.0. מ&quot;קlture ניתן להשתמש ישירות על דילול 1:100 הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 25mL של התקשורת Sauton כדי בקבוק 250 מ&quot;ל קלקר כתרים בורג (Corning). הוסף 250μl של הבידוד עד בינוני, מכסה את הבקבוק בחוזקה ומניחים אותו ללא הפרעה humidified 37 ° C החממה למשך 3 שבועות. שים את הבקבוק פעם אחת בכל יום על מנת להבטיח כי יש זיהום לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף השבוע השלישי, לשחרר את הפקק של הבקבוק כדי לאפשר צמיחה נוספת של מ &#39; שחפת על הממשק. אם הכובע לא משוחרר בשלב זה אז ריכוז חמצן מספיק במיכל יהיה לעכב צמיחה נוספת של חיידקים. </li></ol> 2. גידול של מ &#39; שחפת biofilms ב 12 גם צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את התקשורת הבידוד של mc 2 7000, כמתואר בסעיפים A1 ו-A2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 60mL של התקשורת עם 600μl של הבידוד. לוותר על 4.5mL של התערובת לתוך כל אחד גם הצלחת. מכסים את הצלחת עם מכסה. לעטוף את הצלחת כמה פעמים עם parafilm. דגירה צלחת ללא הפרעה חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שבועות. </li></ol> 3. קביעת תדירות persisters סמים סובלניים בתוך: מ &#39; שחפת biofilms <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מ biofilms שחפת בתבנית של 12 גם כמתואר בסעיף ב &#39;זה ייקח כולל של כ 5-שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר biofilms הם התבגר (אחרי 5 שבועות של דגירה) להזריק בחירתך אנטיביוטיקה בריכוז הרצוי לתוך התקשורת שמתחת biofilms באמצעות microtip ב פיפטה. </li></ol> הערה: היקף בתקשורת מתחת pellicles מפחית בכ 3.0mL. אז החוקרים צריכים בהתאם לחשב את כמות התרופה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבל את הצלחת בעדינות כך אנטיביוטיקה היא מתפזרת היטב במדיום. לקבלת תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, להזריק antibiotic ארבע בארות. במקביל, להזריק באותו נפח של הממס שבו אנטיביוטיקה פורקה בארבע בארות אחרות, ולהשאיר האחרונים ארבע בארות של צלחת ללא שינוי. מכסים את הצלחת עם מכסה ולשים שכבות חדשות של parafilm סביב הצלחת. מניחים אותו בחזרה חממה פרק הזמן הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, פתח את צלחת ולהוסיף Tween-80 לריכוז הסופי של 0.1% (נפח / נפח) בכל אחת הבארות. לערבל את כל הצלחת בעדינות לפיזור אחיד של חומר ניקוי. דגירה צלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מערבבים היטב את התוכן של כל אחד מהם מספר פעמים פיפטה כך התוכן ניתן להעביר באופן אחיד על צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את התוכן של הצינור על 4000rpm במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה ב 5 מ&quot;ל של חיץ לשטוף טרי (PBS עם גליצרול 10% ו 0.05% tween-80). חזור על כביסה שלוש פעמים. Resuspend גלולה ב 5 מ&quot;ל של חיץ הכביסה. שמור את זה על כיסא הנדנדה של overnight ב 4 ° C. </li></ol> הערה: למרות הטמפרטורה הנמוכה פותחה במקור עבור מ &#39;smegmatis (כדי למזער את צמיחתה במהלך פיזור) ושימשו שחפת מ&#39; גם כן, מינים הגדלים איטי יכול כנראה להיות התנדנד בטמפרטורת החדר מבלי להשפיע על התוצאה. נדנדה בטמפרטורת החדר יכול להיות הכרחי אם עובדים במתקן BSL-3. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מזרק סטרילי מצויד microtip (2-200μl) על ידי חיתוך קצה הרחב לגודל מתאים, הולם אותו מזרק, וכרך אותו עם parafilm. להעביר את כל התוכן של הצינור באמצעות מזרק קצה מצויד ולאסוף בעוד כמה צינורות 15 מ&quot;ל טריים. חזור על שלב 5 עד 6 פעמים עד שאתה רואה ההשעיה הומוגנית למדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו סדרה של דילולים ההשעיה ואת הצלחת דילולים על הצלחת 7H11OADC כדי לקבוע את מספר מושבות קיימא ב היטב כל אחד מהם. דגירה צלחות במשך שלושה שבועות 37 ° C חממה. קבע את frequenלסי של persisters באוכלוסייה biofilm על ידי חישוב היחס בין מספר המושבות שהתקבלו טיפול אנטיביוטי לאלו שהושגו על צלחות שטופלו ממס. </li></ol> 4. נציג תוצאות כאשר בתרבית בבקבוק, גידול של מ &#39; שחפת ניתן לראות בבסיס הבקבוק עד סוף השבוע הראשון. בסוף השבוע השני, צמיחה של חיידקים בלתי סדיר על ממשק האוויר התקשורת ניתן לראות, אם כי הצמיחה בממשק אוויר מדיה גלוי באופן עקבי בסוף השבוע השלישי (איור 1 א). בשלב זה החיבור של החיידקים לדופן המיכל הוא ציין גם. מנקודה זו ואילך הצמיחה של התרבות מתרחשת בעיקר על ממשק האוויר בתקשורת. נוזלים מתחת לפני השטח הצמיחה הוא ברור. בדרך כלל, מבנה מתבגר עד סוף השבוע 5 (איור 1 ב). אם הדגירה ממושכת, מבנים יתחילו לשקוע בתחתית המיכל. מעניין לגלותהידוק המכסה עד סוף השבוע השלישי הוא שלב חשוב בתהליך, ומסיבות לא ידועות בקבוק רופף הכתיר מפגרים באופן משמעותי את תחילת הצמיחה בממשק 9. בתבנית של 12 היטב, biofilm חזק על הממשק אוויר התקשורת נתפסת בכל אחת הבארות בתום חמישה שבועות (איור 2 א). אם הצלחות אינן לכיסוי מלא ואז הצמיחה biofilm ההפרש הוא ציין. במקרה הגרוע ביותר, משמעותית אידוי התקשורת יכול לעכב את הצמיחה של החיידקים (איור 2 ב). לכן, גלישת הצלחת יש גם כדי למנוע אידוי וגם כדי לספק סביבה ליצירת biofilm (ראה סעיף קודם). מספר החיידקים קיימא biofilms שנקבעו עם טכניקה זו היא לשחזור למדי. תגובת מ &#39; שחפת biofilms משתנה אופיו של אנטיביוטיקה. על אנטיביוטיקה bactericidal כגון ריפאמפיצין, אובדן הכדאיות כדלקמן bipha<html> כך במקור מגמה 9. ירידה מהירה של כדאיות במשך שלושה עד ארבעה ימים הראשונים ואחריהם שלב מתמשך שבו אחוז קטן מהאוכלוסייה נשאר הסרבן לחלוטין לאנטיביוטיקה ללא קשר ריכוז של אנטיביוטיקה או זמן החשיפה. איור 3 מציג את מספר החיידקים קיימא biofilms בוגרים לאחר חשיפה 7 ימים כדי 50μg/mL (50 פעמים גבוה יותר מאשר MIC) של ריפאמפיצין. <img alt="איור 1 א." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> איור 1 א. הופעה מוקדמת של מ &#39; שחפת החיידקים בממשק אוויר התקשורת של החיידקים לאחר 3 שבועות של דגירה. <img alt="איור 1 ב." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> איור 1 ב. התבגר biofilms של מ &#39; שחפת בממשק אוויר התקשורת לאחר חמישה שבועות של דגירה. 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; איור 2 א. 5 שבועות biofilms הישנים של מ &#39; שחפת גדל בתבנית של 12 גם כן. <img alt="איור 2 ב." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> איור 2 ב. ניסיון כושל לגדל יג biofilms שחפת בצלחת 12 גם בלי parafilm. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> איור 3. העלילה נציג מראה את שכיחות persisters סמים סובלניים בתוך: מ &#39; שחפת biofilms גדל בתבנית של 12 היטב חשופים 50μg/mL של ריפאמפיצין במשך שבעה ימים.

<ol><li>Saltini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+and+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis.</a> Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+dispersal+and+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens.</a> Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).</li>
<li>Henke, J. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+social+engagements%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial social engagements.</a> Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).</li>
<li>Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all+and+all+for+one%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One for all and all for one.</a> Science. 280, 226-227 (1998).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Ojha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GroEL1%3A+a+dedicated+chaperone+involved+in+mycolic+acid+biosynthesis+during+biofilm+formation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria.</a> Cell. 123, 861-873 (2005).</li>
<li>Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).</li>
<li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).</li>
<li>Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+tuberculosis+incidence+and+their+determinants+in+134+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries.</a> Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).</li>
<li>Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+and+sterilizing+activities+of+antituberculosis+drugs+during+the+first+14+days%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).</li>
<li>Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biofilm+formation+by+clinical+isolates+of+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium.</a> J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+rapidly+growing+mycobacterial+species+Mycobacterium+fortuitum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum.</a> FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+regulation+of+mycolic+acid+cyclopropanation+in+saprophytic+mycobacteria%3A+role+of+the+Mycobacterium+smegmatis+1351+gene+%28MSMEG_1351%29+in+CIS-cyclopropanation+of+alpha-mycolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates.</a> J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

שחפת (TB), נגרמת על ידי זיהום של Mycobacterium שחפת, נותר איום משמעותי על בריאות הציבור העולמית. כמעט שליש מאוכלוסיית העולם מוערך להידבק asymptomatically ידי פתוגן, כ -9 מיליון מקרים חדשים מופיעים במרפאה כל שנה עם תסמינים של שחפת פעילה על 1,700,000 מתים מזיהום מדי שנה 11. נטל עצום של המחלה תרם בעיקר על ידי חוסר החיסון ואת כימותרפיה מסובך מאוד כי מדובר במשטר multidrug מנוהל על שישה עד תשעה חודשים. כימותרפיה ממושכת מיוחסת במידה רבה סובלנות פנוטיפי של subpopulatio...

<table><tbody><tr><td>אינקובטור</td><td>VWR international</td><td>Model # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי תרבית מפוליסטירן</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>פלטת תרבית רקמה בעלת 12 בארות</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות קוניות בנפח 50-mL</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>רוקר (מנער)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>מקרר כרומטוגרפי</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (מונובסי)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ציטרית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>ferric ammonium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>גליצרין</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-pantothenic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>מצע Difco Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC Enrichment</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק אחסון בנפח 250mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>פלטות בעלות 12 בארות</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>ריפמפיצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>מזרק בנפח 10ml</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפט של 1-200&amp;mu;L</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>parafilm M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה לצנטריפוגה בנפח 15mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>מצע Difco Mycobacteria 7H11 Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (דיבסי)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

גידול של שחפת mycobacterium biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium שחפת, סוכן האטיולוגי של שחפת האדם, יש יכולת יוצאת דופן לשרוד כנגד לחצים סביבתיים, כולל אנטיביוטיקה. למרות הלחץ הסובלנות של מ &#39; שחפת היא אחד התורמים צפוי כימותרפיה 6 חודשים ארוכה של שחפת 1, המנגנונים המולקולריים שבבסיס זה פנוטיפ אופייני הפתוגן עדיין אינן ברורות. מינים רבים של חיידקים פיתחו כדי לשרוד בסביבות מלחיצים על ידי הרכבה עצמית על פני השטח, מאורגן המצורפת, ו מטריקס מבנים כמוס קרא biofilms 2-4. הגידול ביישובים נראה האסטרטגיה המועדפת הישרדות של חיידקים, והיא מושגת באמצעות רכיבים גנטיים המווסתים מצורף משטח, תקשורת אינטר, וסינתזה של חומרים פולימריים תאיים (EPS) 5,6. עמידות ללחץ סביבתי הוא הקל ככל הנראה על ידי EPS, ואולי על ידי physioloההסתגלות של החיידקים gical הפרט microenvironments הטרוגניות בתוך הארכיטקטורה המורכבת של biofilms 7. בסדרה של מאמרים האחרונות הקמנו כי מ &#39; שחפת Mycobacterium smegmatis יש נטייה חזקה לגדול מבנים תאיים מאורגנים, קרא biofilms, שיכול לשאת יותר מ -50 פעמים הריכוזים מעכבות מינימלי של שחפת תרופות נוגדות isoniazid ו 8-10 ריפאמפיצין. מ &#39; השחפת, לעומת זאת, מסקרן דורש תנאים מסוימים כדי ליצור biofilms בוגרים, ב 09:01 יחס מסוים של אמיץ: מדיה, כמו גם חילופי מוגבלת של אוויר עם אווירה 9. דרישות של תנאי סביבה מיוחדים יכול להיות קשור לעובדה מ &#39; שחפת היא הפתוגן האנושי מחייבים ולכן יש להתאים לסביבות רקמות. בפרסום זה אנו מדגימים שיטות culturing מ &#39; שחפתbiofilms בבקבוק בתבנית של 12 גם צלחת, שהוא נוח מחקרים בקטריולוגי כמו גם גנטיים. תיארנו פרוטוקול זן מוחלש של מ &#39; שחפת, mc 2 7000, עם המחיקה בשני לוקוסים, panCD ו RD1, כי הם קריטיים עבור vivo בצמיחה של 9 הפתוגן. זן זה בטוח לשימוש על מנת להבין את הביולוגיה הבסיסית של הפתוגן שחפת וכך למנוע את הדרישה של מתקן BSL-3 יקר הכלה BSL-2. השיטה ניתן להרחיב, עם שינויים מתאימים בתקשורת, לגדול biofilm של מינים אחרים mycobacterial culturable. באופן כללי, פרוטוקול אחיד של biofilms culturing mycobacterial יעזור לחוקרים המעוניינים ללמוד את המאפיינים הבסיסיים של mycobacteria וגמיש. בנוסף, שיטה ברורה ותמציתית של biofilms mycobacterial גדל גם יעזור Inv קליני התרופותestigators כדי לבחון את היעילות של התרופה הפוטנציאלית.

שחפת Mycobacterium מהווה biofilms סמים סובלניים כאשר בתרבית בתנאים מסוימים. כאן אנו מתארים שיטות culturing מ &#39; שחפת biofilms וקביעת תדירות persisters סמים סובלניים. פרוטוקולים אלה יהיה שימושי למחקרים נוספים לתוך מנגנוני עמידות לתרופה בתוך: מ &#39; שחפת.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

ל-Mycobacterium tuberculosis, הגורם האטיולוגי לשחפת בבני אדם, ישנה יכולת יוצאת דופן לשרוד מאמצים סביבתיים, כולל...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים שיטה לגידול ביופילמים של m tuberculosis בממשק אוויר-מצע, ולקבוע את שכיחותם של תאים עמידים לתרופות בביופילמים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת המצעים והאינוקולומים המתאימים. השלב השני הוא גידול ביופילמים של m tuberculosis בפלטות עם 12 בארות.לאחר מכן מוסיפים אנטיביוטיקה לבדיקה בריכוז הרצוי, ונמדד השכיחות של תאי פרסיסטרים (persisters) העמידים לתרופה. ב-M tuberculosis, ניתן לקבוע את נוכחותם של ביופילמים. בסופו של דבר, ניתן לנצל טכניקה זו כדי לסייע בהבנת הבסיס לפיתוח הביופילם ולהפענח את מנגנוני העמידות לתרופות ב-M tuberculosis. היתרון המרכזי של גידול תרבית ביופילם in vitro של M tuberculosis במצע ללא דטרגנטים הוא שהצמיחה הספונטנית של המבנה הרב-תאי המורכב של קו הבסיס חושפת תכונות ייחודיות של האורגניזם שאינן נראות בתרבית פלנקטונית.אלה כוללים היצמדות לפני השטח, אינטראקציות בין-תאיות, סינתזה של מטריצה נלווית והסתגלות פיזיולוגית בתוך המיקרו-סביבה ההטרוגנית של מבנה זה. חשוב לציין כי מידע זה יהיה רלוונטי ביותר להבנת הבסיס של *M. tuberculosis*, וההתמדה שלו בנישות מיוחדות מסוימות כגון חלליים, שבהם צמיחה שופעת של בסיס בסביבה נלווית עשויה להתרחש במבנים רב-תאיים. ההשלכות של טכניקה זו פונות לעבר טיפול קצר יותר בשחפת, מכיוון שזיהוי וסימון גורמים הקשורים לביופילמים עשויים להפחית את השכיחות של תתי-אוכלוסיות עמידות לתרופות בביופילמים.בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בהרכב סטנדרטי של מצע soans לתרבית של M tuberculosis. עם זאת, בעת גידול ביופילמים של מיני mycobacteria אחרים, השתמשו במצעים הייעודיים המתאימים להם. הכינו את האינוקולומים הראשוניים של M tuberculosis בבקבוקי פלסטיק של 125 milliliter המכילים 15 milliliters של מצע נוזלי.בין 80 לצמיחה. את התרביות תחת תנאים סטנדרטיים עד שה-OD 600 שלהן הוא בין 0.7 ל-1.0, תהליך שארך כשבוע. בצפיפות זו, ניתן להשתמש בתרבית ישירות כאינוקולום בדילול של 1 ל-100. לאחר הכנת האינוקולום, הוסיפו 600 µL ל-60 mL של מצע sawtons.לאחר ערבוב עדין של האינוקולום לתוך המצע, העבירו 4.5 milliliters של התערובת לכל באר בלוח 12 בארים, כסו את הלוח ועטפו אותו מספר פעמים בפרה. לאחר מכן, דגרו את הלוח באינקובטור עם לחות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.לאחר חמישה שבועות של גדילה ללא הפרעה, המשיכו בבדיקה של התאים העמידים לסמים (persisters). לאחר חמישה שבועות של הבשלה, נפח המצע יצטמצם לכ-3 mL לכל באער בארבעה באערים. הזרקו את האנטיביוטיקה הרלוונטית אל מתחת לביופילם על גבי המצע.יש להזריק למספר ארבעה בארות נוספות את הממס לבדו, ואת ארבע הבארות האחרונות יש להשאיר ללא טיפול. הדבר מספק עוצמה סטטיסטית ובקרות מתאימות; נערו את הפיתה בעדינות כך שהאנטיביוטיקה תתפשט באופן מלא במצע. כעת כסו את הפיתה.הניחו שכבות טריות של פראפורם סביב הפלטה והדגירו את הפלטה למשך תקופה של בין יום אחד לשבעה ימים, בהתאם לניסוי. בסיום הדגירה, הוסיפו tween 80 לכל באר. נערה את כל הפלטה בעדינות כדי לפזר את הדטרגנט באופן אחיד.לאחר מכן, דגרו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בתום 15 דקות, השתמשו בפיפטה כדי לערבב את התוכן של כל באר עד להגעה לאחידות. לאחר מכן, העבירו את התרבית למבחנה קונוית של 15 מיליליטר.סבבו בצנטריפוגה את המבחנה הקונית, וסספנדו מחדש. השעיה את המשקע בחמישה מיליליטר של בופר שטיפה טרי, סבבו לצבירה וסספנדו מחדש. השעיה את התאים בבופר שטיפה שלוש פעמים נוספות.לאחר מכן, יש להחזיק את התאים בבופר שטיפה למשך לילה על רוקר בחדר קר. למרות שטמפרטורה נמוכה פותחה במקור עבור EMS magmatic כדי למזער את צמיחתו במהלך הפיזור, והדבר תקף גם עבור M tuberculosis. סביר להניח שניתן להניח מינים בעלי קצב צמיחה איטי על רוקר בטמפרטורת החדר ללא השפעה על התוצאות.ייתכן שיהיה צורך בערבוב בתנועה (Rocking) בטמפרטורת החדר אם העבודה מתבצעת במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL 3). למחרת, הכינו מזרק להומוגניזציה ולהעברה. עבור כל תמיסה, התאימו טיפ של מיקרופיפטה למזרק סטרילי. גזרו את הקצה הרחב של הטיפ לגודל המתאים, חברו אותו למזרק ועטפו את החיבור ב-Parafilm.העבירו את תרחיף התאים המקורר דרך המזרק המצויד בקולב והעבירו את התוכן לשפופרת קונית נקייה בנפח 15 מיליליטר. חזרו על שלב זה חמש עד שש פעמים, תוך החלפה רציפה של השפופרת, עד שהתרחיף ייראה הומוגני מאוד. כעת, הכינו דילולים סדרה של כל תרחיף וזריעו כל דילול על צלחת אגר.לאחר דגירה של הפלטות למשך שלושה שבועות, קבעו את שכיחות התאים העמידים (persisters) באוכלוסיית הביופילם על ידי השוואת מספר המושבות בפלטות שטופלו באנטיביוטיקה לעומת פלטות הביקורת. כאשר התרבית גודלה בבקבוק, במהלך השבוע הראשון, M tuberculosis צמח בבסיס הבקבוק.בסוף השבוע השני, נצפתה צמיחה מפוזרת של חיידקים בממשק שבין האוויר למצע, שהפכה גלויה אף יותר בסוף השבוע השלישי. כמו כן, נצפתה היצמדות של החיידקים לדופן המכל, וצמיחת התרבית התרחשה בעיקר בממשק שבין האוויר למצע. הנוזל מתחת לשכבת הצמיחה היה צלול.עד לסוף השבוע החמישי, המבנה היה בשל לחלוטין. בפורמט של 12 בארות לאחר חמישה שבועות של דגירה, נראה ביופילם חסון בממשק שבין האוויר למדיום בכל בארה בלוחות שלא היו עטופים לחלוטין. נצפתה צמיחה דיפרנציאלית של הביופילם וכן התאיידות משמעותית של המדיום.צמיחת החיידקים על מצעים אלה נעצרה. מספר הבצילוסים החיוניים בביופילמים היה הניתן לשחזור במידה רבה והשתנה בהתאם לאנטיביוטיקות שונות. לדוגמה, בריפמפיצין, אנטיביוטיקה בקטריצידית, ירידה מהירה בחיוניות במהלך שלושת או ארבעת הימים הראשונים לוותה בשלב התמדה שבו אחוז קטן מהאוכלוסייה נותר עמיד לחלוטין לאנטיביוטיקות, ללא קשר לריכוז האנטיביוטיקה או למשך זמן החשיפה.ניתן להשתמש באותו הליך לסריקת מוטנטים במטרה לזהות גנים המעורבים בהיצמדות של mycobacterium tuberculosis למשטח הביופילם, בצמיחת חיידקים בממשק ובבשלות של הפקוסים. יש לזכור כי עבודה עם M tuberculosis עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש במתקני הכלה ברמת בטיחות ביולוגית 3 בעת ביצוע הליך זה.

growth-of-mycobacterium-tuberculosis-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר שיטות שונות של...

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

מאמר זה מתאר את הליך הקמת ויזואליזציה של biofilm חיידקי גדל בתוך שקופית 8-גם...

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin...

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של התפתחות הביופילם לאחר חשיפה לגורמי מארח באמצעות מודל תא שקופיות. מודל זה מאפשר הדמיה ישירה של התפתחות ביופילם וכן ניתוח פרמטרים של ביופילם באמצעות תוכנות מחשב.

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה לביצוע צמיחת ביופילם ומדידות ביומסה באמצעות התקני לוח PCR עמוקים בהרכבה עצמית עבור הקרנת ביופילם סטטית של מכסה 96-היטב.

ייצור ביופילם ביומסה חיידקית גדולה יותר באמצעות מכשירי מיקרופלאט עמוק באר עמוקה צלחת PCR

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לפיתוח ביופילם כדורי. השיטה ניתנת להרחבה לנפחי תרבות שונים, ומאפשרת אימוץ קל למטרות ניסוי שונות. תכנון השיטה מאפשר הערכה איכותית או כמותית של פוטנציאל יצירת הביופילם של מספר מינים מיקובקטריאליים.

גידול ביופילם מיקובקטריאלי כמודל לחקר עמידות מיקרוביאלית

מתודולוגיה זו מאפשרת הקמת מודל ביופילם פולימיקרוביאלי בסיסטיק פיברוזיס לבדיקת רגישות מיקרוביאלית במעבדות מחקר וקליניות. מודל זה מספק תוצאות מדויקות ואמינות על פני מגוון תפוקות.

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף עבור PmbExM, טכניקת מיקרוסקופיית הרחבה שתוכננה במיוחד עבור ביופילמים של Proteus mirabilis . PmbExM משתמש בטיפול אנזימטי מדורג בדגימות ביופילם כדי להשיג התרחבות איזוטרופית פי 4.3, המאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של הארגון המרחבי של מבנים תאיים ותת-תאיים בתוך קהילות מיקרוביאליות יושבות אלה.

הדמיה ברזולוציה גבוהה של ביופילם Proteus mirabilis על ידי מיקרוסקופ הרחבה

למדו שיטה לגידול ביופילמים של Mycobacterium tuberculosis בממשק אוויר-תזונה ולקביעת תדירות החיידקים העמידים לתרופות. טכניקה זו חיונית להבנת מנגנוני העמידות ופיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות בשחפת.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

גלה סרטונים נוספים