מדידה של פעילות פקטור V בפלזמה אנושית באמצעות Assay קרישת Microplate

המטרה הכללית של ההליך הבא הייתה לפתח בדיקת מיקרופלטה (microplate assay) המודדת את הפעילות של חלבון הקרישה פקטור V במהלך היווצרותו של קריש פיברין בפלזמה אנושית. בתגובה לפגיעה, מופעל תהליך קרישת הדם, המוביל לסדרה של תגובות המרת זימוגן (Xymogen) לפרוטאז, אשר בסופם מובילות להיווצרות אנזים הקרישה thrombin; ה-thrombin ממיס פיברינוגן מסיס למonomers של פיברין, אשר נקשרים לאחר מכן כדי ליצור קריש פיברין בלתי מסיס. במצב תקין או ללא פגיעה, הדם נשאר כנוזל הזורם בחופשיות, וכמות הפיברין שנוצרת שווה לכמות הפיברין שעוברת פירוק.

עם זאת, במצבים מחלה מסוימים, קרישה מוגברת מדי מובילה למחלות לב ושבץ מוחי, בעוד שקרישה חסרה מובילה לנטייה לדימומים, הנראית לעיתים קרובות בהמופיליות. Factor V הוא חלבון בפלזמה שבצורתו הפעילה, factor five A, מהווה מאיץ קריטי של ייצור thrombin במהלך היווצרות קריש fibrin כחלק מקומפלקס האנזים prothrombin; prothrombin מורכב מארבעה מרכיבים: factor 10 A, הפרוטאז factor five A, הקו-פקטור lipid, המשטח וסידן. factor five A מגביר את היעילות הקטליטית או ה-kcat של factor 10 A כלפי הסובסטרט prothrombin בערך פי 3000, ובכך הוא מחזק באופן משמעותי את ייצור ה-thrombin ואת היווצרות קריש ה-fibrin.

פלטפורמת המיקרופלטה מועדפת למדידת אירועים המזורזים על ידי אנזימים בשל הנוחות, עלות הזמן, נפחי הדגימות הקטנים, הניטור הרציף והתפוקה הגבוהה. ניתן לנטר את אירוע היווצרות קריש הפיברין באמצעות קורא מיקרופלטות על ידי מדידת העלייה בבליעת האור של הפלזמה, בעודה משנה את מראהו מצבע צהוב צלול ללא קריש פיברין ובבליעת אור מינימלית, למראה עכור ואטום עם קריש פיברין ובבליעת אור מקסימלית. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות שפופרות בהטיה ידנית או בדיקות עם אנליזים אוטומטיים, הם שזוהי שיטה מהירה, זולה, הדורשת נפחי דגימה קטנים ובעלת תפוקה גבוהה.

הבדיקה מודדת את הפעילות של פקטור חמישה שהופעל באופן לא מכוון ושל פקטור חמישה שהופעל על ידי תרומבין, כדי לקבל הערכה כמותית מלאה של פעילותו התפקודית הכוללת. את הטכניקה ידגים דרק טילי (Derek Tilley), סטודנט לתואר שני במעבדה. כדי למדוד את פעילות פקטור חמישה במדגם פלזמה, יש להוכיח עקומות סטנדרט של פעילות פקטור חמישה בשלב אחד, של זמן היווצרות קריש פיברין בפאנל A ושל קצב היווצרות קריש פיברין ראשוני בפאנל B, תוך שימוש בפלזמה אנושית נורמלית (NHP) כסטנדרט המכילה, לפי הגדרה, יחידה אחת של פעילות פקטור חמישה ל-ML. הפשיר את הפלזמה deficient פקטור חמישה, את הפלזמה האנושית הנורמלית, את מדגמי הפלזמה הבלתי ידועים ואת התרומבופלסטין בטמפרטורה של 37 מעלות למשך 10 דקות.

ערבבו בעדינות את הפלזמה עם החסר בגורם חמישה, העבירו למגשי שטיפה פלסטיקיים נפרדים והדריגו על קרח. אחסנו את הפלזמה האנושית הנורמלית ואת דגימות הפלזמה הבלתי ידועות על קרח לאחר ערבוב עדין. אחסנו את Calcium chloride 25 millimolar במים מזוקקים במגש שטיפה נפרד בטמפרטורת החדר עבור עקומות standard של פעילות גורם חמישה בשלב אחד.

הכינו 200 µL של כל אחת מדילול סדרה דו-מכפלה של פלזמה אנושית רגילה מהדילולים 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ו-512 ב-HBS pH 7.4 באמצעות מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 ml, ערבבו היטב במכשיר וורטקס והדרימו על קרח. עבור דגימות הפלזמה הבלתי ידועות, הכינו 200 µL של דילול פי 40 של פלזמה אנושית רגילה ושל פלזמות דגימה בלתי ידועות ב-HBS pH 7.4 באמצעות מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 ML. הניחו חמישה פסי בארות (microwell strips) לתוך תפסן התבנית של קורא המיקרו-פלייטים.

הפעילו את קורא המיקרו-פלטות (Microplate reader) והגמישו לתוכנת היישומים Softmax Pro. באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסיפו בו-זמנית 50 µL של פלזמה חסרה לגורם 5 (factor five deficient plasma) לכל בארי הדגימות במיקרו-פלטה. באמצעות פיפט בודד, הוסיפו 50 µL של 10 דילולים סדרתיים מוכנים של פלזמה אנושית נורמלית, וכן של דילולים פי 40 של פלזמה אנושית נורמלית ושל דגימות פלזמה לא ידועות לבארי מיקרו-פלטה נפרדים. באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 50 µL של תרומבופלסטין (thrombo plasty) לכל בארי הדגימות. הדגירו בתוך קורא המיקרו-פלטות בטמפרטורה של 25 °C למשך דקה אחת, תוך כדי ניעור למשך 15 עד 25 שניות במהלך דקת ההדגירה.

באמצעות המחשב המחובר לקורא המיקרופלט (MICROPLATE reader), היכנסו לתוכנת היישום Softmax Pro Microplate. הגדירו את קורא המיקרופלט למצב של בליעה באורך גל של 405 nanometers, לטמפרטורה קינטית של 25 degrees Celsius, ותכנתו את קורא המיקרופלט לערבוב (shake) בחמש השניות הראשונות לאחר הוספת calcium chloride, ולמדידת בליעה ב-405 nanometers בכל חמש שניות למשך שש דקות. לאחר מכן, מרווח הערבוב של חמש השניות לא ייכלל בזמני הקרישה המחושבים. באמצעות שתי פפטות רב-ערוציות בו-זמנית, הוסיפו 50 µL של calcium chloride לשתי רצועות המיקרופלט עם הדגימות.

המתינו 15 שניות ולחצו מיד על סמל ההתחלה ב-Softmax Pro במחשב כדי להתחיל את הבדיקה. עבור כל דגימת פלזמה שנבדקה, נקבע זמן היווצרות הקריש, אשר מוגדר כזמן בשניות עד להגעה למחצית מהעלייה המקסימלית בבליעה. קצב היווצרות הקריש הראשוני מוגדר כקצב העלייה בבליעה לאורך חמש נקודות הזמן הראשונות של החלק הליניארי בעלייה בבליעה אל מול הזמן.

מידת היווצרות הקריש מוגדרת כההפרש בין הבליעה המקסימלית למינימלית שהושגה במהלך אירוע היווצרות הקריש בסוף ההרצה. השתמשו בפרופילי הבליעה (ABSORBENCE) מול זמן ב-Softmax Pro כדי לקבוע את הזמן, הקצב הראשוני ומידת היווצרות הקריש עבור דילול סדרתי של פלזמה אנושית נורמלית. לבניית עקומות סטנדרט לפעילות של גורם V בשלב אחד, השתמשו בזמני הקרישה עבור פלזמה אנושית נורמלית המדוללת פי 40 ודגימות פלזמה לא ידועות כדי לבצע אינטרפולציה של פעילות גורם חמישה ביחידות למילiliter מתוך עקומת הסטנדרט לפעילות גורם חמישה בשלב אחד.

זה מייצג את הפעילות של פקטור V בשלב אחד, או זאת ללא הפעלה מכוונת על ידי תרומבין. זוהי דוגמה מייצגת של היווצרות קריש פיברין בבדיקת פקטור V לאורך זמן, כפי שנוצרה על ידי קורא מיקרופלייט. הפרופיל מייצג היווצרות קריש פיברין תוך שימוש בפלזמה אנושית נורמלית בדילול של 32 פעמים במיקרופלייט בודד.

ציר ה-y מייצג את השינוי בבליעה באורך גל של 405 ננומטר שהתרחש כתוצאה מהיווצרות קריש פיברין. זמן היווצרות הקריש חושב כנקודת האמצע של עקומת הבליעה לעומת הזמן, 36.4 שניות. קצב היווצרות הקריש ההתחלתי חושב כ-611.88 מילי-יחידות לדקה.

היקף היווצרות העננים חושב כ-0.35 יחידות. בדיקת "גורם חמישה" (factor five assay) מודדת במדויק את קצב התגובה הראשוני ואת היקף היווצרות העננים. בדיקה של הבארות עם סיום הבדיקה אישרה כי התרחשה היווצרות קרישיים.

כל התגובות הגיעו לכך שמידת היווצרות הקריש הייתה בקירוב דומה, עם שינוי כללי בבליעה באורך גל של 405 ננומטרים שנע בין 0.35 ל-0.45 יחידות, בין הבליעה ההתחלתית לבין הבליעה המקסימלית לאחר הוספת תרומבופלסטין וקלציום כלוריד. דוגמאות מייצגות של פעילות גורם 5 בשלב אחד, עקומת סטנדרט של זמן קרישה בשניות לעומת פעילות גורם 5 ביחידות למילילטר, וקצב היווצרות קריש ראשוני במילי-יחידות לדקה לעומת פעילות גורם 5 ביחידות למילילטר עבור פלזמה אנושית נורמלית, מוצגות בפאנל A ובפאנל B בהתאמה.

מכיוון שגורם חמישה מופעל בדרך כלל על ידי תרומבין, והקו-פקטור הפעיל, גורם חמישה A, דורש בדיקה שנייה לאחר הוספה ואינקובציה עם תרומבין, שלב זה קריטי למדידה מדויקת של פעילות גורם חמישה בשני שלבים של דגימת פלזמה באמצעות הפעלה מכוונת על ידי תרומבין מוסף עבור בדיקת גורם חמישה בשני שלבים. הכינו 200 עד 300 µL של תרומבין מטוהר בריכוז סופי של 100 nM ב-HBS pH 7.4 והדגירו על קרח. דללו 120 µL של פלזמה אנושית נורמלית ושל דגימות פלזמה כדילול של 40 עד 100 פעמים עם 170 µL של HBS pH 7.4 המכיל 2.8 mM.

סידן כלוריד. הוסף 10 µL של thrombin לכל דגימה כדי להגיע לריכוז סופי של 10 nM. ערבב בעזרת vortex ודגור ב-37 °C למשך דקה אחת, ואז דלל את פלזמה האנושית הנורמלית ואת פלזמות הדגימות בדילול של 500 פעמים על ידי הוספת 400 µL של HBS pH 7.4.

קבעו את זמן הקרישה עבור פלזמה אנושית תקינה בכל אחד מבדיקות הדגימות הבלתי ידועות מתוך פרופילי הבליעה לעומת זמן ב-SoftMax Pro. בהתחשב בדילול של 500 מ ganger, השתמשו בזמן הקרישה של כל דגימה כדי לחשב את הפעילות של פקטור V בבדיקה דו-שלבית (two stage activity) באמצעות עקומת הסטנדרט של פקטור V בבדיקה חד-שלבית (one stage standard curve) של זמן קרישה לעומת פעילות. תוצאה זו מייצגת את הפעילות של פקטור V בבדיקה דו-שלבית או זו עם הפעלה מכוונת על ידי תרומבין.

ניתן לחשב את הפעילות הכוללת של גורם חמישה (factor five) כהפרש בין הפעילות של גורם חמישה בשני שלבים לבין הפעילות של גורם חמישה בשלב אחד. עקומת סטנדרט של לוגריתם זמן קרישה אל מול לוגריתם הפעילות של גורם חמישה שימשה למדידת הפעילות של גורם חמישה בפלזמה אנושית תקינה ובפלזמה מתשעה חולים עם קרישה תוך-כליות מפושטת (disseminated intravascular coagulation) או DIC. כל תשעת חולי ה-DIC הראו פעילות של גורם חמישה בשלב אחד וקצבים ראשוניים של היווצרות קריש שהיו נמוכים בממוצע ב-54% וב-18%. הפעילות של גורם חמישה בשני שלבים והפעילות הכוללת היו נמוכות בחולי ה-DIC בממוצע ב-44% וב-42% בהשוואה לפלזמה אנושית תקינה.

הגורם חמישה ומטופלי DIC הביאו לזמן ממושך ולקצב מופחת של היווצרות קרישי סיבים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה כיצד ליישם שיטה זו במעבדה שלכם. ניתן להתאים את השיטה בקלות למדידת הפעילות של כל גורם קרישה בפלסמה, מה שהופך אותה למתאימה למגוון רחב של יישומים מחקריים וקליניים.

בסופו של דבר, מידע זה על גורם V ישפיע לחיוב על סביבות הבריאות באמצעות אבחון וטיפול מוקדמים יותר בהפרעות קרישה או דימום כגון DIC.