מדידה של פעילות פקטור V בפלזמה אנושית באמצעות Assay קרישת Microplate

המטרה הכוללת של ההליך הבא הייתה לפתח בדיקת מיקרו-פלטות המודדת את פעילותו של גורם חלבון קרישה V במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית. בתגובה לפציעה, תהליך קרישת הדם מופעל ומביא לסדרה של תגובות המרה של Xymogen לפרוטאז שמובילות בסופו של דבר ליצירת אנזים הקרישה תרומבין, תרומבין מחבר פיברינוגן מסיס למונומרים פיברין, אשר לאחר מכן מתחברים ליצירת קריש פיברין בלתי מסיס. בדרך כלל, הדם נשאר כנוזל הזורם בחופשיות במצב בריא או לא פגוע, וכמות הפיברין שנוצרת שווה לכמות הפיברין שהתפרקה או התפרקה.

עם זאת, במצבי מחלה מסוימים, קרישה רבה מדי מובילה למחלות לב ושבץ מוחי, בעוד שקרישה מועטה מדי מובילה לנטיות דימום, הנראות לעתים קרובות בהמופיליות. פקטור V הוא חלבון בפלזמה שבצורתו הפעילה 5 A הוא מאיץ קריטי ליצירת טרומבין במהלך היווצרות קרישי פיברין כחלק מקומפלקס האנזים פרותרומבין, פרותרומבין מורכב מארבעה מרכיבים פקטור 10 A, פקטור הפרוטאז 5 A, שומן הקו-פקטור, פני השטח והסידן. פקטור המלין 5 A מגדיל את היעילות הקטליטית או ה-kcat של פקטור 10 A לכיוון פרותרומבין המצע שלו בכ-3000 פעמים, ובכך משפר באופן משמעותי את יצירת התרומבין ואת היווצרות קרישי הפיברין.

פלטפורמת המיקרופלייט מועדפת למדידת אירועים מזורזים של אנזימים בגלל נוחות, עלות זמן, נפחי דגימה קטנים, ניטור רציף ותפוקה גבוהה. ניתן לנטר את אירוע היווצרות קרישי הפיברין באמצעות קורא מיקרו-פלטות על ידי מדידת העלייה בספיגת האור של הפלזמה כאשר היא משתנה ממראה צהוב בהיר ללא קריש פיברין וספיגת אור מינימלית למראה מעונן אטום עם קריש פיברין וספיגת אור מקסימלית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון מבחני צינור הטיה ידניים או בדיקות עם מנתחים אוטומטיים הוא שהשיטה מהירה, זולה ובעלת דרישות נפח דגימה קטנות ובעלת תפוקה גבוהה.

הבדיקה מודדת את הפעילות של פקטור חמש המופעל שלא במתכוון ומופעל תרומבין כדי לקבל הערכה כמותית מלאה של הפעילות התפקודית הכוללת שלו. מי שידגים את הטכניקה הזו יהיה דרק טילי, סטודנט לתואר שני במעבדה. על מנת למדוד את פעילות פקטור חמש בדגימת פלזמה, יש צורך לבנות פעילות פקטור חמש בשלב אחד, עקומות סטנדרטיות של זמן היווצרות קרישי פיברין בפאנל A והקצב ההתחלתי של היווצרות קרישי פיברין בפאנל B באמצעות פלזמה אנושית רגילה או NHP כסטנדרט המכיל בהגדרה יחידה אחת של פקטור חמש פעילות לכל ML מפשיר את הפלזמה החסרה של פקטור חמש, פלזמה אנושית רגילה, ודגימת פלזמה לא ידועה וטרומבופלסטין ב-37 מעלות למשך 10 דקות.

מערבבים בעדינות את הפלזמה החסרה של פקטור 5 והעברת פלסטיק טרומבו למגשי כביסה נפרדים מפלסטיק ודגירה על קרח. אחסן את הפלזמה האנושית הרגילה ודגימת פלזמה לא ידועה על קרח לאחר ערבוב עדין. אחסן את הסידן כלורי 25 מילימולר במים מזוקקים במגש כביסה נפרד בטמפרטורת החדר עבור עקומות סטנדרטיות של פעילות פקטור חמש שלב אחד.

הכן 200 מיקרוליטר כל אחד של דילול סדרתי כפול של פלזמה אנושית רגילה מ-0 2 4 8 16 32 64, 1 28, 2 56 ו-512 ב-HBS pH 7.4 באמצעות צינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, מערבולת היטב ודגירה על קרח. עבור דגימת הפלזמה הלא ידועה, הכינו 200 מיקרוליטר כל אחד של 40 דילולים של פלזמה אנושית רגילה ופלזמות דגימה לא ידועות ב-HBS pH 7.4 באמצעות צינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הנח חמש רצועות מיקרווול לתוך מחזיק התבנית של קורא המיקרו-פלטות.

הפעל את קורא המיקרופלייט וגש לתוכנת היישום Softmax Pro microplate באמצעות פיפטה רב-ערוצית. בצע תוספות בו זמנית של 50 מיקרוליטר של פלזמה חסרה בפקטור חמש לכל בארות המיקרופלטה לדוגמה באמצעות פיפטה בודדת הוסף 50 מיקרוליטר מתוך 10 הדילולים הסדרתיים המוכנים של פלזמה אנושית רגילה ודילול פי 40 של פלזמה אנושית רגילה ופלזמה לא ידועה כדי להפריד בארות MICROPLATE באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 50 מיקרוליטר של פלסטיקה פקקת לכל בארות הדגימה. דגירה בקורא המיקרופלייט בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת עם טלטול במהלך 15 עד 25 השניות של הדגירה של דקה.

באמצעות המחשב המתממשק לקורא MICROPLATE גש לתוכנת היישום Softmax Pro Microplate. הגדר את קורא ה-Microplate לאורך גל ספיגה למצב 405 ננומטר לטמפרטורה קינטית ל-25 מעלות צלזיוס ותכנת את קורא ה-Microplate לרעוד בחמש השניות הראשונות לאחר הוספת סידן כלורי ולמדוד ספיגה ב-405 ננומטר כל חמש שניות למשך שש דקות. לאחר מכן, מרווח הטלטול של חמש השניות אינו נכלל בזמני הקריש המחושבים באמצעות שתי פיפטות רב-ערוציות בו זמנית מוסיפים 50 מיקרוליטר סידן כלורי לשתי רצועות המיקרופלייט עם דגימות.

המתן 15 שניות ולחץ מיד על סמל ההתחלה ב-Softmax Pro מהמחשב כדי להתחיל בבדיקה. עבור כל דגימת פלזמה שנותחה, זמן היווצרות הקריש נקבע ומוגדר כזמן בשניות להגיע לעלייה המקסימלית במחצית הספיגה. הקצב ההתחלתי של היווצרות הקריש מוגדר כקצב העלייה בספיגה בחמש נקודות הזמן הראשונות של החלק הליניארי של העלייה בספיגה לעומת הזמן.

מידת היווצרות הקריש מוגדרת כהפרש בין הספיגה המקסימלית למינימלית שהושגה במהלך אירוע היווצרות הקריש בסוף הריצה. השתמש בפרופילי הספיגה לעומת הזמן ב-Softmax Pro כדי לקבוע את הזמן, הקצב ההתחלתי והיקף היווצרות הקריש לדילול סדרתי של פלזמה אנושית רגילה. כדי לבנות את פקטור V, עקומות סטנדרטיות של פעילות שלב אחד, השתמש בזמני הקריש עבור הפלזמה האנושית הרגילה המדוללת פי 40 ודגימת פלזמה לא ידועה כדי I אינטרפולציה של פעילות גורם חמש ביחידות לטחנה מהעקומה הסטנדרטית של פעילות שלב אחד של פקטור חמש.

זה מייצג את הגורם חמש פעילות שלב אחד או ללא הפעלה מכוונת על ידי תרומבין. זוהי דוגמה מייצגת להיווצרות קרישי פיברין במבחן פקטור חמש לאורך זמן שנוצר על ידי קורא המיקרו-פלטות. הפרופיל מייצג היווצרות קרישי פיברין באמצעות פלזמה אנושית רגילה מדוללת פי 32 במיקרופלטה אחת.

ובכן, הציר האנכי מציין את השינוי בספיגה ב-405 ננומטר שהתרחש כתוצאה מהיווצרות קרישי פיברין. זמן היווצרות הקריש חושב כנקודת האמצע של עקומת הספיגה לעומת הזמן, 36.4 שניות. הקצב ההתחלתי של היווצרות קרישים חושב כ-611.88 מילי-יחידות לדקה.

היקף היווצרות העננים חושב כ-0.35 יחידות. בדיקת פקטור חמש מודדת במדויק את הזמן, הקצב ההתחלתי והיקף היווצרות העננים. בדיקת הבארות עם השלמת הבדיקה אישרה כי התרחשה היווצרות קרישים.

כל התגובות הגיעו בערך לאותה מידה של CloudFormation עם שינוי כללי בספיגה ב-405 ננומטר של בין 0.35 ל-0.45 יחידות בין הספיגה ההתחלתית לפני לספיגה המקסימלית לאחר פלסטיקה טרומבו וסידן כלורי. הוספה הולכת דוגמאות מייצגות של פעילות פקטור חמש שלב אחד, עקומה סטנדרטית של זמן קריש בשניות לעומת פעילות פקטור חמש ביחידות למיל, והקצב ההתחלתי של היווצרות טפרים במילי יחידות לדקה לעומת פקטור חמש. פעילות ביחידות למיל עבור פלזמה אנושית רגילה מוצגת בפאנל A ובפאנל B בהתאמה.

מכיוון שפקטור חמש מופעל בדרך כלל עם תרומבין. בדיקת גורם הקו-פקטור הפעיל חמש A בשנייה לאחר הוספה ודגירה עם תרומבין היא קריטית למדידה מדויקת של פעילות פקטור חמש דו-שלבי של דגימת פלזמה עם הפעלה מכוונת על ידי תוספת תרומבין לבדיקת פקטור חמש דו-שלבי. הכינו 200 עד 300 מיקרוליטר של תרומבין מטוהר בריכוז הסופי של מאה ננו מולר ב-HBS pH 7.4 ודגרו על קרח, דללו 120 מיקרוליטר מהפלזמה האנושית הרגילה מעל הרגיל ודגמו פלזמות מפי 40 עד פי 100 עם 170 מיקרוליטר של HBS pH 7.4 המכילים 2.8 מילי-מולר.

סידן כלורי. הוסף 10 מיקרוליטר תרומבין כדי להשיג ריכוז סופי של 10 ננו-מולרי לכל דגימה. מערבולת. ובכן לערבב ולדגור ב-37 מעלות למשך דקה אחת, יש לדלל את הפלזמה האנושית הרגילה ולדגום פלזמות פי 500 על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של HBS pH 7.4.

קבע את זמן הקריש עבור פלזמה אנושית רגילה בכל אחת מבדיקות הפלזמה הלא ידועות של הדגימה מפרופילי הספיגה לעומת הזמן ב-soft max Pro. אם לוקחים בחשבון את דילול פי 500, השתמש בזמן הקריש עבור כל דגימה כדי לחשב את הגורם חמש פעילות דו-שלבית מהעקומה הסטנדרטית של פקטור חמש שלב אחד של זמן קריש לעומת פעילות. זה מייצג את הגורם חמש פעילות דו-שלבית או עם הפעלה מכוונת על ידי תרומבין.

לאחר מכן ניתן לחשב את הפעילות הכוללת של פקטור חמש כפעילות דו-שלבית של פקטור חמש פחות פקטור חמש פעילות שלב אחד. העקומה הסטנדרטית של זמן קריש לוג לעומת פעילות פקטור לוג חמש שימשה למדידת פעילות פקטור חמש בפלזמה אנושית רגילה ובפלזמות מתשעה חולים עם קרישה תוך-וסקולרית מפושטת או DIC, כל תשעת חולי DIC. הוצגו פעילויות שלב אחד של גורם חמש ושיעורים ראשוניים של היווצרות קרישי דם שירדו בממוצע ב-54 ו-18%הפעילות הכוללת של פקטור חמש, דו-שלבי וסך הכל ירדו בחולי DIC בממוצע ב-44% ו-42% בהשוואה לפלזמה אנושית רגילה.

פקטור חמש וחולי DIC גרמו לזמן ממושך ולירידה בקצב היווצרות קרישי הסיבים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד ליישם שיטה זו במעבדה שלך. ניתן להתאים את השיטה בקלות למדידת הפעילות של כל גורם קרישה בפלזמה, מה שהופך אותה למתאימה למגוון רחב של יישומים מחקריים וקליניים.

בסופו של דבר, מידע זה של גורם V ישפיע לטובה על סביבות בריאות באמצעות אבחון וטיפול מוקדם יותר בהפרעות פקקת או דימום כגון DIC.