מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאים בודדים לצורך ניתוח טרנסקריפטום מבוסס מיקרו-מערך (microarray). דבר זה מושג תחילה על ידי הפרדה של הרשתית מהרקמה הסובבת אותה, ולאחר מכן פירוקה לתאים בודדים. השלב השני הוא איסוף התאים הבודדים והעברתם למבחנות PCR המכילות תמיסת ליזיס.

לאחר מכן מבצעים ליזיס לתאים ואת ה-CDNA מעצימים באמצעות שעתוק הפוך, ולאחריו תגובת שרשרת פולימראז. לבסוף, משתמשים בהיברידיזציה של ה-CDNA מהתא הבודד על מערך מיקרו-מטריצות A iMatrix כדי לחשוף את ה-mRNAs המבטאים בתא בודד. היתרון העיקרי של מיפוי ביטוי גנים בתאים בודדים לעומת שימוש בגישות של רקמה שלמה הוא שבידוד תאים בודדים מאפשר גישה לאוכלוסיות קטנות מאוד של תאים המהוות חלק מהרקמה כולה.

תאים אלו יכולים להיות כל דבר, מסוגים שונים של נוירונים ועד לאוכלוסיות קטנות של תאי גזע. מה שטכניקת התא הבודד מאפשרת לנו לעשות עבור תאים אלו הוא לזהות הן את סוגי התאים, הן סממנים ספציפיים לאוכלוסיות קטנות אלו של תאים, ולזהות רשתות גנים המבטאות את עצמן בתתי-אוכלוסיות נדירות ביותר אלו של תאים. בנוסף, טכניקת הפרופילינג של תא בודד מאפשרת לנו לזהות את רשתות הגנים המבטאות את עצמן באופן זמני במהלך מעברים התפתחותיים דינמיים מאוד בתתי-אוכלוסיות קטנות מאוד של תאים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגנטיקה ההתפתחותית, כגון המועד שבו תאי אב מתחילים לבטא רשתות גנים הקשורות להבחנה, וכיצד תאי אב אלו נבדלים זה מזה. להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על טיפולים תאיים למחלות נוירודגנרטיביות כגון גלאוקומה, מכיוון שבאמצעות פענוח רשתות המפתח בהתפתחותם של תאים בודדים, אנו קרובים צעד אחד יותר ליכולת לייצר תאים אלו לשימוש בטיפול להחלפת תאים. התחילו את ההליך על ידי הנחת רשתית של עכבר בתוך צלחית מלאה ב-PBS.

בשלב הבא, הסיר את הזגוגית ואת העדשה. לאחר מכן, הסר את כל האפיתל הפיגמנטרי של הרשתית. דגור את הרשתית בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliters בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הקישו בעדינות על המבחנה כדי לשחרר תאים ששקעו. לאחר מכן, בצעו טריטורציה עדינה, 10 עד 20 פעמים, באמצעות פ pipette P 1000. אם נותרים גושים גדולים של רקמה, דגרו אותם למשך 10 דקות נוספות ב-37 °C ובצעו טריטורציה שוב, 10 עד 20 פעמים.

בשלב הבא, הוסף חמישה מיקרוליטרים של dna, ביחס של 10 units per microliter לרטינה, והדגר אותה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ערבב בעדינות שוב באמצעות פיפט P 1000 למשך 10 עד 20 פעמים נוספות. סבב במערבל צנטריפוגי במהירות של 3000 RPM למשך שלוש דקות.

לאחר מכן יש להסיר את הנוזל העליון ולהשאיר 100 עד 200 µL של נוזל בתחתית. טפח על המבחנה כדי לשחרר את המשקע. לאחר מכן, הוסף 1 mL של HBSS ותלה את המשקע באמצעות ערבוב עדין.

סובב את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 3000 RPM למשך שלוש דקות. עם סיום התהליך, הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, השCה את הדגימה ב-450 µL של PBS המכיל 0.1% BSA. בשלב הבא, הכן שתי צלחות בקוטר ששה סנטימטרים המכילות 5 mL של PBS בתוספת 0.1% BSA.

בשלב הבא, זרע את התאים המופרדים בתוך צלחית אחת. אפשר לתאים לשקוע למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, הנח את הצלחית עם התאים המופרדים תחת מיקרוסקופ הפוך.

השתמשו בפיפט בעל קצה דק עם צינור שאיבה כדי לאסוף תא בודד. לאחר מכן, מקמו את המיקרו-פיפט קרוב לתא והוא יישאב בקלות לתוך המיקרו-פיפט באמצעות פעולת נימיות. לאחר מכן, העבירו את התא לצלחנית שנייה וודאו שרק תא אחד נאסף לצורך ניתוח פרופיל ביטוי גנים.

פעולה זו מבוצעת על ידי הסרת תאים מיותרים או העברת התא המבוקש למיקום אחר באמצעות מיקרו-פיפט חדש. כאשר תא בודד מבודל לחלוטין מהתאים השכנים, השתמש במיקרו-פיפט חדש כדי לשאוב את התא המבוקש. לאחר מכן, פלוט אותו ישירות לתוך מבחנת PCR של 0.2 milliliter המכילה 4.5 microliters של בופר לליזה של תאים.

סובב את הדגימה לזמן קצר במיקרו-צנטריפוגה כדי להטביע את התא במאפר ליזיס. בצע סבוב זה לאחר כל תא חמישי ושוב בסיום האיסוף. זכור להשאיר את המבחנה על קרח למשך כל תהליך בידוד התאים הבודדים, ואסוף את התאים הבודדים בתוך חלון זמן של שעתיים לאחר הדיסוציאציה כדי להשיג תוצאות אופטימליות בפרוצדורה זו; סובב את הדגימה לזמן קצר במיקרו-צנטריפוגה כדי לוודא שהתא הבודד מוטבע במאפר ליזיס התאים.

כדי לעודד ליזיס של התאים, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 70 °C למשך 90 שניות בטרמוסייקלר. לאחר מכן, העבירו מיד את המבחנה בחזרה לקרח למשך שתי דקות. לצורך ביצוע השעתוק ההפוך, הוסיפו 0.33 µL.

Superscript three בריכוז של 200 units per microliter, כמות של 0.05 microliters מעכב בריכוז של 40 units per microliter ו-0.07 microliters של T four gene 32 protein למבחנה. דגרו את תערובת התגובה למשך 50 דקות בטמפרטורה של 50 °C בטרמוסייקלר; לאחר 50 דקות, נטרלו את הפעילות של האנזים בטמפרטורה של 70 °C למשך 15 דקות נוספות.

בסיום הפעולה, החזירו את המבנהת לקירור על קרח. להסרת הפריימר החופשי, הוסיפו למבנהת 0.1 µL של 10 x exonuclease buffer, 0.8 µL של H2O מזוקק ו-0.1 µL של Exonuclease, בריכוז של 20 units/µL. דגרו את המבנהת בטרמוסייקלר בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, נטרלו את הפעילות של האנזים על ידי דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורה של 80 °C למשך 25 דקות. בסיום, החזירו את המבנהת אל הקרח. לאחר מכן, הוסיפו שש µL מתערובת תגובת ה-tailing לדגימה.

דגרו את הדגימה בתרמוסייקלר ב-37 °C למשך 20 דקות, ב-70 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן שמרו אותה ב-4 °C. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL מהדגימה עם הזנב (tailed sample) לתערובת התגובה של ה-PCR. בצעו סינתזה של הגדיל השני והגברה באמצעות PCR כדי לסמן את ה-CDNA.

על מנת להשיג היברידיזציה חזקה במערכי מיקרו-מטריצות iMatrix, ראשית יש לפרגמנט את ה-CD NA על ידי הוספת 10 עד 20 µL של ה-CD NA מתא בודד ל-8 µL של תמיסת 1x forall buffer. לאחר מכן, יש להוסיף 1 µL של DNA מדולל זה לתמיסת תגובה בנפח של 80 µL. לאחר מכן, יש להוסיף לכך 20 µL של 5X TDT buffer, 2.5 µL של biotin-dATP ו-1 µL של TDT מדולל.

בשלב הבא, הוסיפו לתערובת 20 µL של XTDT buffer, 2.5 µL של biotin, 6 µL של D-D-A-T-P ו-1 µL של TDT. דגרו את התערובת במשך 90 דקות ב-37 °C, ולאחר מכן למשך חמש דקות ב-65 °C.

לאחר מכן אחסן את הדגימה בטמפרטורה של 20°C- או בצע היברידיזציה מיידית למערך a iMatrix. להלן דוגמה מייצגת של מריחות cDNA מתא בודד ו-PCR ספציפי לגנים; נתיבים A-F-G-N-H מכילים מריחות cDNA חזקות, בעוד שנתיבים B, C, D ו-E פחות חזקים באופן משמעותי. ה-cDNAs בודדו מתאי גנגליון של הרשתית הפלואורסצנטיים, ונבדקו לאחר מכן באמצעות פריימרים של PCR ספציפיים לסממני תאי גנגליון של הרשתית, BRN3B ו-PAC6, ו-PCR ספציפי לגן עבור סמן הפוטורספטור.

CRX שימש לקביעת רמת הזיהום בתא הבודד. cDNA ותתי-קבוצות של תאי ganglion ברשתית זוהו על ידי סריקה לאיתור נוכחותו של הגן tachy kinin one. תוצאות המיקרומערך עבור גנים נבחרים שהובעו ב-22 תאים בודדים שונים מוצגות בפורמט של מפת חום (heat map).

עוצמות האותים מהמערך המזערי (microarray) נורמלו כך שיתאימו לעוצמת הצבע האדום, בעוד שצבע שחור מעיד על היעדר אות במערך המזערי. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כגון QPCR כדי לאשש את תבנית ביטוי הגנים שנצפתה במערך המזערי. ניתן להשתמש בתוצאות ההכלאה (hybridization) ב-C גם כדי לענות על שאלות נוספות שעשויות לעלות לגבי מיקומם של תאים המבטאים גנים מסוימים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של אופן הדיסוציאציה של רשתית העין, בידוד תאים בודדים והפקת cDNA מאותם תאים בודדים, לצורך היברידיזציה על מערך מיקרוarrays.