Name: שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב תסיסנית רימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למד שיטות להערכת נוקיצפציה תרמית בזחלי Drosophila באמצעות גירוי מקומי וגלובלי. הטכניקות מאפשרות מדידה כמותית של תגובות התנהגותיות ומספקות תובנות לגבי עיבוד תחושתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים כריסטיאן לאנדרי על עיצוב החללית חום, דניאל בבקוק לפיתוח חום הזחל בדיקה assay, שון סוויני עבור המצביע על הצלחת חום assay, תסיסנית Bloomington מרכז במלאי למניות לעוף, Galko חברי המעבדה של קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 NS069828 כדי MJG ואת מרק NIH U-STAR הדרכה גרנט (T34GM079088 לאוניברסיטת יוסטון-Downtown חוקרים באקדמיה) עבור גישה המיעוט לקריירות המחקר (ממוצע).

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

מבחני שתוארו כאן ניתן להעריך איכותית וכמותית הזחלים של גנוטיפים שונים של היענות לגירויים תרמית רעילים. התכונה העיקרית של assay בדיקה החום הוא הגירוי ניתנת רק מוקד אחד. זה כנראה מוביל ירי של תת היחידה הקטנה של המעמד הרביעי נוירונים-the אלה במגזר קשר עם החללית ואולי אלה מיד קטעים הסמוכים 11. בגלל גירוי מקומי, assay בדיקה החום מחקה את החוויה החושית משותף של גילוי גירוי מזיק, כי הוא מקומי לגוף מסוים באזור, כגון יד יצירת קשר עם תנור חם. החיסרון של assay בדיקה חום היא כי יש כמה לשונות המשתמש אל המשתמש יכול סביר לייחס לשלושה גורמים: א) את הלחץ שבו המשתמש חל בדיקה כדי הזחל, ב) את המיקום המדויק של החללית על הזחל יחסית לתאי העצב nociceptive הבסיסית, ו, ג) ang מדויקלה בו בדיקה קשרים פני השטח של הזחל. אנחנו קודם לכן דיווחו אסטרטגיה כמותית של הזחלים לסווג את המגיבים, שאינם מגיבים איטיים, המגיבים מהר המבוססים על זמן אחזור נסיגתם לטמפרטורה מסוימת 1. כאן אנו מדווחים על היענות הזחל לטמפרטורות גבוהות יותר אפילו. מעניין, אנו מוצאים כי קיימת תקרה הזחל תגובות nociceptive תרמית וכי התקרה זה נמצא בין 52 ו - 54 ° C. זה עשוי להצביע על כך הזחלים אינם בעלי פוטנציאל הקולטן חולף (TRP) ערוץ מסוגל gating בטמפרטורות גבוהות מ 52 ° C. לחלופין, הוא יכול להציע את הנוירונים או השרירים ליזום או לבצע את תגובת המנוע ניזוק לפני שהם יכולים גם לתפקד הנסיגה מרתיעה. כמו כן, אנו מדווחים על ניתוח שונה של משרעת של נסיגה בתגובה, או באמצעות מספר לחמניות אינדיקטור &quot;חוסן&quot; התגובה. בתמימות, 1היינו מצפים כי הפרמטרים הללו יגדילו את הטמפרטורה או הגדלת זמן של גירוי. למרבה ההפתעה, אנו מוצאים כי זה לא המקרה. הזחלים מגורה זמן רב יותר בטמפרטורה בקצה הנמוך של טווח מזיק (42 ° C) הצג לחמניות יותר ויותר זמן ביליתי מתגלגל מ הזחלים נחקר בטמפרטורות גבוהות (48-52 מעלות צלזיוס). הדבר מצביע על כך בתוך חלון הטמפרטורה מזיק זה בעיקר משך החשיפה הקובע את האמפליטודה של התגובה. מאז הזחלים חשופים לטמפרטורות רעילים מאוד (48-52 מעלות צלזיוס) להגיב בממוצע מהר מאוד, הם אינם מציגים כמו לחמניות רבים ככל זחלי נחשף לטמפרטורה מזיק פחות לאורך זמן ארוך יותר. אנליזה של משרעת התגובה דווח כאן מוסיף עוד מימד כמותי שלאורכו גנוטיפים שונים או מניפולציות סביבתיות ניתן להשוות. התכונה העיקרית של assay צלחת חום היא שזה כרוך בחשיפה גלובלית מזיקחום. ככזה, הוא דומה יותר לחיה יושב קלחת חימום מאשר לגעת בתנור חם. אם כי לא ברור מתי הזחל עשויה לחוות גירוי מזיק ברחבי העולם בטבע, במעבדה את תגובות התנהגותיות חשיפה הגלובלי הזה הם מורכבים יותר מאשר אלו שנצפו על גירוי מקומי. כוחו של assay צלחת חום, ציין גם על ידי אחרים 3, היא כי יש שונות קטנה המשתמש אל המשתמש מאז נוגע הזחל אינו מרכיב של הפרוטוקול. השונות רק ניכר נראה בהגדרת כאשר התנהגות זו מתחילה וזה יכול להיות ממוזער עם צפייה חוזרת / היכרות. הבדל מעניין בין מבחני הוא הטמפרטורה שבה ההתנהגויות אברסיביים להתחיל. אלה הם הרבה יותר נמוך ב assay צלחת חום מאשר עם החללית חום. התנהגות ראשונית הוצגו על ידי הזחלים קשר עם החללית חום (ראש ולהעלות את הזנב) עשוי להיות מתאם של ת&#39;ראש ראש העיר ב ~ 27 ° C ב Plat חוםדואר assay. יתכן כי תגובה זו משקפת &quot;נוחות&quot; יותר &quot;כאב&quot;. אנחנו לא נצפה מתאם של הצלפה, פרכוסים, ושיתוק אפילו גבוהה (עד 48 מעלות צלזיוס) בטמפרטורות ב assay בדיקה חום וייתכן כי מסה קריטית של תא עצב תחושתי ירי מאזור אחד או יותר של הגוף היא צריך להביא על התנהגויות אלה. מעניין לציין, כי התנהגויות של תפיסה ושיתוק הם נצפו בטמפרטורות (~ 34-37 ° C) מתחת בסופו של דבר לסף התחתון של nociceptive ציין עם החללית חום המעיד כי גירוי העולמי עשוי לכלול סיכום של תגובות עצביות, כי הם לא מספיק כדי לעורר התנהגות עם המקומיים היישום של החללית חום. אלה הטמפרטורות נתפסים ממש כמו מזיק זחלי נתמך על ידי התבוננות כי זחלים שמתחילים התנהגות שיתוק מותר לאחר מכן לשחזר את האוכל זבוב לא ברוב המקרים לשרוד (איור 5 ג). יתר על כן התומכות בטענה כי החום PLassay אכלו קורא את התגובות nociceptive היא העובדה כי חסימת הולכה סינפטית ב הידועים עצב סנסורי nociceptive מגדיל את זמן האחזור של רוב ההתנהגויות הנצפות (איור 6). תצפית שאין עליה חביון על התנהגות גבוה יותר בטמפרטורה מתוקה עולה כי נוירונים חושיים אחרים שאינם מבטאים MD-Gal4 עשויות להידרש להתנהגות זו. לסיכום, שני מבחני כרוך בחשיפת הזחל הפרט לגירוי תרמי מזיק של הטמפרטורה מוגדר - עצה חמה של החללית מתכת קטן assay טבילה המקומית בטיפת מים במהירות חימום assay העולמי. תגובות התנהגותיות של הזחלים תסיסנית משתנה רקע גנטי ו / או חשיפה לתנאי סביבה משתנים (למשל פלוס או מינוס נזק לרקמות), ניתן ללמוד לכמת באמצעות אלה מבחני. בסופו של דבר, התוצאות של מבחני אלה יסייעו לנו להבין טוב יותר רשתות גנטיות השליטה NOCiception ב תסיסנית ו מינים קרובים אחרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Thermal Probe </td><td> Pro-dev הנדסה </td><td> שהותקן על פי דרישה </td><td> מידע ליצירת קשר ניתן לספק על פי בקשה </td></tr><tr><td> אמבט יבש החממה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 11-718 </td><td> 1 חימום גוש מוצק 1 בלוק חימום עם וולס 16 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> לייקה DFC290 12v/400mA צבע המצלמה </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> כל שווה ערך המצלמה תעשה. </td></tr><tr><td> לייקה MZ6 מיקרוסקופ </td><td> Leica Microsystems </td><td> מספר חלק של הגוף MZ6 זום (המוביל אופטיקה) הוא 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> שוט אייס יחידת Modulamp </td><td> שוט צפון אמריקה, Inc </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> שוט שולחן מתכווננת כפול 23 אינץ סיב אופטי אור מדריך </td><td> שוט צפון אמריקה, Inc </td><td> שוט A08575 </td><td></td></tr><tr><td> יחידת הבקרה התרמית </td><td> TSCI קורפ. </td><td> מותאמים אישית, שנבנו </td><td> פרטים ניתן לספק על פי בקשה </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000 מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> כל שווה ערך מיקרוסקופיעשה. </td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm רשת </td><td> Genesee מדעי </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> מכחול </td><td> דיק Blick אמנות חומרים </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV crosslinker </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin צנצנות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל הגביע </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl האתר </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 מ&quot;מ פוליסטירן צלחת פטרי </td><td> בז </td><td> 351008 </td><td> אנחנו עדיין לא נבחנה חלופיות הכלים. </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ זכוכית נושאת </td><td> קורנינג </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> תרמי </td><td> אומגה הנדסה בע&quot;מ </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> חתיכת ויניל </td><td> אופיס דיפו </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge צינור </td><td> Denville מדעיבע&quot;מ </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception תרמית הזחלים תסיסנית. אחת assay כולל גירוי מרחבית, מוגבלת (מקומי) של 1,2 nociceptors תרמית ואילו השני כולל הפעלת הסיטונאי (העולמי) של רוב או את כל הנוירונים כאלה 3. יחד טכניקות אלה מאפשרות הדמיה וכימות של פונקציות התנהגות של נוירונים חושיים תסיסנית nociceptive. הזחל תסיסנית היא מערכת מודל הוקמה ללמוד nociception תרמית, תגובה חושית לטמפרטורות מזיקים, כי הוא שמור באבולוציה על פני 1,2 מינים. יתרונותיה של תסיסנית עבור מחקרים כאלה הם הפשטות היחסית של מערכת העצבים ואת התחכום של טכניקות גנטיות שניתן להשתמש בהם כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של הביולוגיה הבסיסית 4-6 ב תסיסנית, כמו כל metazoans, respons אתדואר לגירויים תרמית רעילים בדרך כלל כרוך בנסיגה &quot;nocifensive&quot; מרתיעה לגירוי המוצג 7. גירויים אלה מזוהים באמצעות קצות עצבים או nociceptors חופשיות משרעת התגובה האורגניזם תלוי במספר nociceptors שקיבלו גירוי מזיק 8. ב תסיסנית, זה arborization את המעמד הרביעי הדנדריטים עצב סנסורי המזהים גירויים תרמי מכני רעילים 9 בנוסף לתפקיד לאחרונה גילו שלהם photoreceptors 10. אלו נוירונים, אשר נחקרו היטב ברמה התפתחותית, arborize על דף את מחסום האפידרמיס וליצור קשרים עם כמעט כל התאים אפידרמיס 11,12. האקסון אחת של כל אחד הרביעי פרויקטים ברמה נוירונים לתוך חוט העצב הגחון של מערכת העצבים המרכזית 11 שבו הם יכולים להתחבר 2 מסדר נוירונים הפרויקט למוח. בתנאי הבסיס, נוירו חושית nociceptiveNS לא יפטר עד לסף גבוהה יחסית הוא הגיע. מבחני המתוארים כאן לאפשר לחוקר לכמת תגובות התנהגותיות או הבסיס, יש להניח, כי רגישות מתפתח נזק לרקמות הבאות. Assay זה מעורר נפרדים אך קשורים תגובות התנהגותיות locomotory לגירויים תרמית רעילים ומאפשר לחוקר לחזות ולכמת היבטים שונים של nociception תרמית הזחלים תסיסנית. מבחני ניתן להחיל את הזחלים של גנוטיפים הרצויות או זחלים העלה בתנאים סביבתיים שונים שעשויים להשפיע nociception. מאז nociception תרמית נשמרת בין זנים, הממצאים שלוקטו לנתיחה גנטי תסיסנית צפויה להודיע ​​הבנתנו nociception תרמית של מינים אחרים, כולל בעלי חוליות.

במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception תרמית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים. אחת assay כולל גירוי מרחבית, מוגבלת (מקומי) של nociceptors תרמית<sup&gt; 1,2</sup&gt; ואילו השני כולל הפעלת הסיטונאי (העולמי) של רוב או את כל הנוירונים כאלה<sup&gt; 3</sup&gt;. יחד טכניקות אלה מאפשרות הדמיה וכימות של פונקציות התנהגות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי nociceptive.

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

במאמר זה אנו מציגים בדיקות למחקר של נוציספציה תרמית בזחלי דרוזפילה. בדיקה אחת כוללת גירוי מוגבל מרחבית (מקומי) של...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון נוציספציה תרמית בזחלי דרוזופילה. זאת מושג על ידי איסוף זחלי דרוזופילה ולאחר מכן חשיפתם לגירויים תרמיים מזיקים. כשלב שני רשות, ניתן להקרין את הזחלים ב-UV, דבר הגורם לנזק לרקמה ולרגישות נוציספטיבית תרמית. לאחר מכן, ניתן לבחון את הזחל באופן מקומי באמצעות גשש חום או באופן גלובלי באמצעות פלטת חימום, כדי לעורר תגובות נוציספטיביות שניתן למדוד באופן כמותי.גשש החום מראה כי לזחלים יש תקרת גג לתגובה הנוציצפטיבית לחום, וקשר מפתיע בין טמפרטורת הקלט לבין עוצמת התגובה שהושרה. בדיקת פלטת החום מראה כי זחלים מציגים רצף סטריאוטיפי של התנהגויות נוציצפטיביות התלויות בטמפרטורת המים שמסביב ובפעילותם של הנוירונים התחושתיים הנוציצפטיביים. השיטות המתוארות כאן יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוציצפציה התרמית, כגון האם בעלי חיים מגיבים באופן שונה לגירויים תרמיים מזיקים המוצגים באופן מקומי או גלובלי.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בבדיקת גשש החום יתקשו בתחילה, שכן השליטה בבדיקה דורשת תרגול כדי למזער את השונות בלחץ, במיקום ובזווית ההנחה של הגשש. הדגמה חזותית של בדיקת פלטת החום היא קריטית, כיוון שכדי להבין באופן מיטבי את ההתנהגויות המופעלות עם עליית הטמפרטורה, יש לראותן. כדי להשיג מספר מספיק של זחלי דור הבא מגנוטיפ מוגדר מתוך עניין, גידלו את המאוכלוסייה הרצויה באופן ישיר או בצעו הכלאות בבקבוקים המכילים מזון לזבובים, תוך שימוש ב-20 עד 30 נקבות בתולות וב-15 עד 20 זכרים. חמישה ימים לאחר הנחת הביצים, קצרו ונקו זחלי גיל שלישי מוקדם על ידי הוצאת מזון הזבובים הרך וסינון תחת זרם עדין של מים דרך רשת בעלת גודל נקבים של 630 micron. העבירו את זחלי הגיל השלישי המוקדם לרפידה קטנה ולחה של מזון כדי למנוע רעב והתייבשות.לאחר בניית תא ההרגעה, השתמשו בפינצטה או במברשת צבע כדי להניח בעדינות 10 זחלים בשלב השלישי המוקדם לאורך החלק הפנימי של המכסה וסגרו אותו. בעבודה תחת מapay, הניחו את תא ההרגעה בתוך צנצנת חיבור המכילה כלי מדידה של 10 מיליליטר עם פתיל צמר ספוג ב-1.5 מיליליטר של dathyl ether. הברגו את מכסה צנצנת החיבור כדי לחשוף את הזחלים לאדי האתר למשך 2 עד 2.5 דקות.לאחר ההרדמה, הוצא את תא ההרדמה מצנצנת ה-Coplan והמתן מספר שניות בתוך המנדף עד לפיזור שאריות אדי האתר. השתמש בבקבוק התזת מים כדי לשטוף בעדינות את הזחלים מתא ההרדמה אל תוך צלחת פטרי קטנה. ייבש את הזחלים המורדמים באמצעות נייר סופג, ולאחר מכן הצמד אותם בעדינות כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה על רצועת סרט הדבקה דו-צדדי המקובעת לזכוכית של תג מיקרוסקופ בגודל של שלושה על אינץ' אחד.הניחו את השקופית על המשטח התחתון של תא הקרנה ב-UV וחשפו את הזחלים לאור UV למשך שש שניות בעוצמה של 20 millijoules per centimeter squared. לאחר ההקרנה, טבלו את השקופית במים כדי להצוף בעדינות את הזחלים מהסרט ההדבקה הדו-צדדי. השתמשו בפינצטה או במברשת צבע כדי להעביר בעדינות את הזחלים שהוקרנו לתוך מכל של 15 by 45 millimeter.מבחנה מזכוכית בנפח דרם אחד המכילה מיליליטר אחד של מזון לזבובים, להשבחה למשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius או בטמפרטורת התרבית הרצויה לפני ההחזרה למארח. עבור בדיקות נוציפציה תרמית, הגדירו תחילה את טמפרטורת הגשש התרמי לנקודת היעד הרצויה. השתמשו במברשת צבע או בפינצטה כדי להעביר בעדינות זחל בודד אל פלטפורמה שטוחה, תוך וידוא שהזחל מכוסה בשכבה דקה של מים.על מנת למזער את השונות בלחץ וכן להבטיח את המיקום והזווית הנכונים של גשש החום, תרגול הוא המפתח להצלחה. לחצו בעדינות את קצה הגשש כנגד הלרווה בפלח A 4, תוך הפעלת לחץ קל כאשר קצה הגשש נמצא בזווית של כ-45 מעלות בין הגשש לפני השטח של הלרווה. הלחץ אמור לגרום לשקיעה קלה על פני השטח של הלרווה ובדרך כלל יספיק כדי למנוע תנועה.המשיכו לגרות את הזחלים עד להופעת תגובת נסיגה או עד להגעה לנקודת החיתוך ה-22. זחלים המגיבים מפגינים בדרך כלל תחילה התנהגות מקדימה של הרמת הראש והזנב, ואחריה התנהגות נסיגה של גלגול של לפחות 360 מעלות. ברגע שהתנהגות הנסיגה החלה, הפסיקו את המגע עם הפרובה ורשמו את השיהוי או את הזמן שנדרש לנסיגה.אם לא נצפתה התנהגות נסיגה תוך 20 שניות, הזחל נחשב כמי שאינו מגיב. מקמו את סיבי ההולכה של האור האופטי כדי להבטיח תאורה מספקת בעלת ניגודיות גבוהה. לצורך צפייה בזחלים, הכניסו את גוש החימום לתוך פלטת החימום כאשר הצד השטוח פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן הניחו את פלטת החימום על בסיס המיקרוסקופ.הפעילו את לוח החימום על הגדרה גבוהה והמתינו כ-15 דקות עד שהטמפרטורה תתייצב על 95 °C. מדדו 80 µL של מים מזוקקים והניחו את טיפת המים במרכזה של צלחת פטרי מפוליסטירן בגודל 60 על 15 מילימטר באמצעות מיקרופיפטה. השתמשו בפינצטה כדי להניח בעדינות זחל נקי בשלב גוזל שלישי (mid third instar) למרכז טיפת המים, תוך הכנסת כמות מינימלית של מים נוספים.הניחו בעדינות את פטרי הפטרי על גבי בלוק החימום המוצק שעל פלטת החימום. כווןו במהירות את מיקום הכלי כך שהזחלים כולם וטיפת המים יהיו בשדה הראייה. הפעילו את הטיימר.בשלב זה, מניחים את צלחת הפטרי על גבי בלוק החימום המוצק של פלטת החימום ומתעדים את זמן תחילתו של כל התנהגות. חמש. התנהגויות לוקומוטוריות סטריאוטיפיות נצפות עם העברת הזחל הטבול במים אל פלטת החימום. התנהגות נורמלית בהיעדר חום כוללת לוקומוציה מסוג parasol, הנלווית לתנועות ראש של חיפוש.התנהגות של רעידת ראש (Head thrash) עשויה להתרחש בשלב הבא, כאשר הלרבה מניעה את ראשה במהירות בתנועה קדימה או הצידה. תנועה זו דומה לתנועתם הרגילה במים, אך היא מתרחשת באופן קטוע ועקבי יותר תוך כדי גלגול. התנהגות זו נרשמת כאשר הלרבה מתגלגלת הצידה לפחות 360 מעלות מלאות.דבר זה עשוי להתרחש מספר משתנה של פעמים ולעתים כולל גלגולים חלקיים. לצורך דירוג ההתנהגות, ספרו רק גלגולים מלאים של 360 מעלות. התנהגות זו היא הדומית ביותר לסצנה שבה מיושם גשש חום מקומי במהלך התנהגות שוט (whip behavior).הזחל מראה תנועות כיווץ ושחרור מהירות לאורך הציר הקדמי-אחורי, המביאות את הראש קרוב מאוד לזנב לזמן קצר מאוד. תנועות צליפה נצפות לעיתים קרובות ברצף מהיר, או במקביל לתנועות גלגול. לבסוף, הזחל יראה התנהגות של פרכוסים, שלעיתים קרובות אחריהם שיתוק. במהלך התנהגות הפרכוסים, הזחל נמתח לאורך הציר הקדמי-אחורי ומראה רעידות בתדירות גבוהה של כל הגוף.התנהגות רעידה ללא שיתוק כפיפה מתרחשת כאשר הזחלים מפסיקים לנוע. בחלק מהזחלים מצב זה הוא קבוע, בעוד שאחרים מפגינים לאחר מכן תנועת פעימה בתדר נמוך. בגרף זה של אחוזי המגיבים השייכים לכל קטגוריה, ניתן לראות תקרת מקסימום לתגובת הנוספציה התרמית של הזחלים. בבדיקת גשש החום, 100% מהזחלים הם מגיבים מהירים עד לטמפרטורת גשש של 52 °C.עם זאת, בטמפרטורה של 54 °C ומעלה, 90% או יותר מהזחלים אינם מגיבים אפילו לאחר 20 שניות של מגע. למרות שזחלים אלו ממשיכים לנוע לאחר נקודת החיתוך ה-22, ניתן למדוד ולשרטט גם את מספר הגלגולים או את הזמן שהוקדש להתנהגות נסיגה של סלידה. באופן מפתיע, נראה כי קיים קשר הפוך בין טמפרטורת הכניסה של הגשש לבין עוצמת התגובה, שכן טמפרטורות נמוכות יותר נראות כמעוררות מספר רב יותר של גלגולים.חמש התנהגויות תנועה סטריאוטיפיות נצפות בעת העברה של הזחל הטבול במים ללוחית החימום. זמני השהייה הממוצעים שבהם נצפו התנהגויות אלו מוצגים כאן, וכך גם טמפרטורות טיפות המים הממוצעות שנמדדו עבור כל זמן שהייה בתנאי הבדיקה האופטימליים המוצגים כאן; אחוז הזחלים שהפגינו כל התנהגות נפרדת נע בין 77% ל-100%, אם כי לעיתים התנהגויות הגלגול והצליפה מושמטות, חופפות או מתרחשות בסדר הפוך. אחוז הזחלים שנישרו לאחר תחילת התנהגות השיתוק בבדיקת לוחית החימום מוצג כאן. הזחלים חוממו עד לשיתוק ואז הועברו לתנאי תרבית סטנדרטיים כדי להתאושש.הזחלים שקיבלו טיפול דמה (mock) עברו טיפול זהה למעט החשיפה לחום, והיצירה של PPE בבוגרים חיים נמדדה כמותית ביום השביעי עד ה-13. כאן, MD G four מניע ביטוי של טרנסגנים המוסדרים על ידי UAS בכל ארבעת הסוגים של נוירונים תחושתיים פריפריים מולטי-דנדריטיים. UAS or one delta C מבטא גרסה משופרת של תעלת אשלגן פתוחה (open rectifier potassium channel) של דרוזופילה, הדרושה להעברה סינפטית, ו-UAS orrc one delta NC מבטא גרסה משופרת נוספת של אותה תעלה, שאינה מפריעה להעברה סינפטית.שימו לב שרק זחלים הנושאים הן את הדרייבר MD GALF four והן את הטרנסגן UAS ORC one delta C מראים השהיות מוגברות בארבעה מחמשת ההתנהגויות שנצפו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן מדידת התגובות המקומיות והגלובליות של זחלי GEs לגירויים תרמיים מזיקים. ניתן לשלב הליכים אלה עם שיטות אחרות, כגון ניתוח גנטי, כדי לזהות את הגנים הדרושים לנוציצפציה תרמית. בעת ביצוע בדיקת הגשש התרמי, חשוב לזכור למזער את השונות בלחץ, במיקום ובזווית המגע של הגשש.

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים הליך אמין ופשוט מהירה כדי לקבוע את הטמפרטורה הנמוכה ביותר שבה חולדות או עכברים מראים התנהגות...

קביעה מהירה של סף nociceptive תרמי בעכברים סוכרתיים

לזחלי דרוזופילה יש נוירונים חושיים ייעודיים – nociceptors – שתגובתם לגירויים תרמיים שעלולים להיות מזיקים מעוררת התנהגויות מרתיעות – או מה שמכונה "nocifensive" – אצל החיה. סרטון זה מתאר שיטה להערכת נוסיספטציה תרמית על ידי רישום התנהגות הזחל בתגובה ליישום מקומי של בדיקת חום על הקוטיקולה. שיטה זו נקראת, אם כן, בדיקת חום מקומית.

בדיקת חום מקומית: שיטה להערכת נוסיספטציה של טמפרטורות גבוהות בזחלי דרוזופילה

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן אוטומטי את ביצועי גינקולוגיות דרוזופילה -שינוי הטמפרטורות באמצעות לתכנות מבוקרי טמפרטורה ארנה שמייצר שינויי טמפרטורה מהירים ומדויקים בזמן ובמרחב.

שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

מגבלות תרמיות יכולות לחזות את סביבות אורגניזמים לסבול, שהוא מידע בעל ערך לנוכח שינוי האקלים המהיר. מתואר כאן פרוטוקולים בתפוקה גבוהה כדי להעריך מינימה תרמית קריטית וזמן נוקאאוט חום בחרקים. שני הפרוטוקולים ממקסמים את התפוקה וממזערים את עלות ההתייענות.

תפוקה גבוהה של מגבלות תרמיות קריטיות בחרקים

מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

הערכה וטיפול של כאב אצל תינוקות קשה בגלל שתינוקות לא יכולים לדווח מילולית הניסיון שלהם. בסרט זה אנו מתארים שיטות אלקטרו כמותיים וטכניקות ניתוח זה יכול לשמש כדי למדוד את התגובה לאירועים הרעילים ממערכת העצבים התינוק.

מדידות אלקטרו וניתוח Nociception אצל תינוקות אדם

תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

למד שיטות להערכת נוקיצפציה תרמית בזחלי Drosophila באמצעות גירוי מקומי וגלובלי. הטכניקות מאפשרות מדידה כמותית של תגובות התנהגותיות ומספקות תובנות לגבי עיבוד תחושתי.

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב

גלה סרטונים נוספים