שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב תסיסנית רימה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון כאב תרמי בזחלי דרוזופילה. זה מושג על ידי קצירת זחלי דרוזופילה כדי לחשוף אותם לאחר מכן לגירויים תרמיים מזיקים כשלב שני אופציונלי ניתן להקרין זחלים UV, מה שגורם לנזק לרקמות ולרגישות תרמית נוסיספטיבית. לאחר מכן ניתן לחקור את הזחל באופן מקומי באמצעות בדיקת חום או באופן גלובלי באמצעות לוח חום על מנת לעורר תגובות נוסיספטיביות שניתן למדוד כמותית.

בדיקת החום מראה שלזחלים יש תקרה לתגובה הנוסיספטיבית לחום, וקשר מפתיע בין טמפרטורת הכניסה למשרעת התגובה המעוררת. בדיקת לוח החום מראה שהזחלים מציגים רצף סטריאוטיפי של התנהגויות נוסיספטיביות התלויות בטמפרטורת המים שמסביב ובפעילות הנוירונים החושיים הנוסיספטיביים. השיטות המתוארות כאן יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוסיספציה התרמית, כגון האם בעלי חיים מגיבים בצורה שונה לגירויים תרמיים מזיקים המוצגים באופן מקומי או גלובלי.

בדרך כלל אנשים חדשים בבדיקת בדיקת החום יתקשו מכיוון ששליטה בבדיקה דורשת תרגול כדי למזער את השונות בלחץ, במיקום ובזווית ההולכה של הבדיקה המיושמת הדגמה חזותית של בדיקת לוחית החום היא קריטית. מכיוון שהתנהגויות הנובעות מעליית הטמפרטורה צריכות להיראות מוערכות בצורה הטובה ביותר. כדי להשיג מספיק זחלי צאצאים בעלי גנוטיפ מוגדר מעניין, גדלו את המלאי הרצוי ישירות או הציבו הכלאות בבקבוקים המכילים מזון זבובים באמצעות 20 עד 30 נקבות בתולות ו-15 עד 20 זכרים חמישה ימים לאחר הטלת הביצים קציר ונקו את זחלי הכוכב השלישי המוקדמים על ידי גריפת מזון הזבוב העסיסי וסינון עם מים זורמים בעדינות דרך רשת בגודל נקבוביות של 630 מיקרון העבירו את זחלי הכוכב השלישי המוקדמים ל כרית מזון קטנה ולחה למניעת רעב והתייבשות.

לאחר בניית תא הרשאה, השתמש במלקחיים או במכחול כדי להניח בעדינות 10 זחלי כוכב שלישי מוקדם לאורך החלק הפנימי של המכסה ולסגור. עבדתי במכסה אדים, הנחתי את תא ההרשאה בתוך צנצנת צימוד המכילה של 10 מיליליטר הנושאת כדור צמר גפן ספוג ב-1.5 מיליליטר של אתר דתיל. הברג את מכסה צנצנת הקופלן כדי לחשוף את הזחלים לאדי אתר למשך שתיים עד 2.5 דקות.

לאחר אישור e, הסר את תא ההרשאה האלקטרוני מצנצנת קופלן ותן לו כמה שניות במכסה המנוע כדי שכל אדי האתר שנותרו יתפזרו. השתמש בבקבוק שפריץ מים כדי לשטוף בעדינות זחלים מתא האישור לתוך צלחת פטרי קטנה. כתם את הזחלים המורדמים יבשים ולאחר מכן הדביק אותם בעדינות עם הצד הגבי כלפי מעלה על רצועת סקוטש דו צדדית מהודקת לשקופית מיקרוסקופ זכוכית בגודל 3 אינץ' על אינץ'.

הנח את המגלשה על המשטח התחתון של תא הקרנת UV וחשוף את הזחלים לאור UV למשך שש שניות בעוצמה של 20 מילי-ג'אול לסנטימטר מרובע. לאחר ההקרנה, טבלו את המגלשה במים כדי לצוף בעדינות את הזחלים מהסקוטש הדו-צדדי. השתמש במלקחיים או במכחול כדי למקם בעדינות את הזחלים המוקרנים בגודל 15 על 45 מילימטר.

בקבוקון תרבית זכוכית דראם אחד המכיל מיליליטר אחד של מזון זבובים להתאוששות במשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס או טמפרטורת התרבית הרצויה לפני שמארחים אותם מחדש. עבור מבחני כאב תרמיים, הגדר תחילה מראש את הטמפרטורה של הגשושית התרמית לנקודת ההגדרה הרצויה. השתמש במכחול או במלקחיים כדי להעביר בעדינות זחלים בודדים על משטח שטוח, וודא שהזחלים מכוסים בשכבה דקה של מים.

על מנת למזער את השונות בלחץ, כמו גם כדי להבטיח את המיקום והזווית הנכונים של בדיקת החום, התרגול הופך למושלם. לחץ בעדינות את קצה הגשושית כנגד הזחלים בקטע A ארבע, והפעיל לחץ קל עם הקצה בזווית של כ-45 מעלות בין הגשושית לפני השטח של הזחלים. הלחץ אמור לגרום לשקע קל על פני הזחלים ולרוב יספיק כדי למנוע תנועה.

המשיכו לעורר את הזחלים עד שתוצג תגובת נסיגה או עד שתגיע לניתוק ה-22. זחלים מגיבים בדרך כלל מראים תחילה התנהגות ראשונית של הרמת הראש והזנב, ואחריה התנהגות נסיגה של גלגול של לפחות 360 מעלות. לאחר תחילת התנהגות הנסיגה, שחרר קשר עם הגשושית ורשום את ההשהיה או הזמן שלקח לנסיגה.

אם לא נצפתה התנהגות נסיגה תוך 20 שניות, אז הזחלים אינם מגיבים. מקם את מכווני האור של הסיבים האופטיים כדי להבטיח שיש תאורה מספקת בניגודיות גבוהה. לצפייה בזחלים, הנח את בלוק החימום לתוך צלחת החום עם משטח ישר כלפי מעלה ולאחר מכן הנח את לוחית החום על בסיס המיקרוסקופ.

הפעל את צלחת החום להגדרה הגבוהה ואפשר כ-15 דקות להתייצבות הטמפרטורה על 95 מעלות צלזיוס. מדוד 80 מיקרוליטר מים מזוקקים והניח את טיפת המים באמצע צלחת פטרי פוליסטירן בגודל 60 על 15 מילימטר עם מיקרו פיפטר. השתמש במלקחיים כדי להניח בעדינות זחלים נקיים באמצע טיפת המים, ולהכניס כמה שפחות מים נוספים.

הנח בעדינות את צלחת הפטרי על גוש החימום המוצק על צלחת החום. התאם במהירות את מיקום המנה כך שכל הזחלים וטיפת המים יהיו גלויים. הפעל את הטיימר.

כרגע, צלחת הפטרי מונחת על גוש החימום המוצק של צלחת החום ומתעדת את זמן ההופעה של כל התנהגות. חמש. התנהגויות קטר סטריאוטיפיות נצפות בעת העברת הזחל השקוע במים לצלחת החום. התנהגות נורמלית בהיעדר חום כרוכה בתנועת שמשיה, המלווה בתנועות ראש מחפשות.

התנהגות חבטת ראש יכולה להתרחש לאחר מכן כאשר הזחל מזיז את ראשו במהירות בתנועה קדימה או לרוחב. תנועה זו דומה לתנועתם הרגילה במים, אך מתרחשת בצורה קופצנית יותר וגלגול מתמשך. התנהגות מתרחשת כאשר הזחלים מתגלגלים לרוחב לפחות 360 מעלות מלאות.

זה יכול להתרחש מספר משתנה של פעמים ולפעמים כרוך בגלילים לא שלמים. לצורך ניקוד ההתנהגות ספרו רק גלגולים מלאים של 360 מעלות. התנהגות זו היא הדומה ביותר לאותה סצנה עם יישום מקומי של בדיקת החום במהלך התנהגות שוט.

הזחל מפגין תנועות שחרור התכווצות מהירות לאורך ציר האנטיו האחורי המביאות את הראש קרוב מאוד לזנב הצלפה נצפית לעתים קרובות ברצף מהיר שניים או במקביל לגלגול. לבסוף, הזחל יפגין התנהגות התקפית ואחריה שיתוק. במהלך התנהגות ההתקף, הזחל נמתח לאורך הציר האחורי של האינטראופ ומפגין גוף שלם בתדירות גבוהה.

התנהגות טלטול ללא שיתוק כיפוף מתרחשת כאשר הזחלים מפסיקים את תנועתם בחלק מהזחלים, זה קבוע, בעוד שאחרים מציגים תנועת פעימה בתדר נמוך. בתרשים זה של אחוז המגיבים השייכים לכל קטגוריה, יש תקרה לתגובת הכאב התרמית של הזחל. בבדיקת בדיקת החום, 100% מהזחלים הם מגיבים מהירים עד לטמפרטורת בדיקה של 52 מעלות צלזיוס.

עם זאת, בטמפרטורה של 54 מעלות צלזיוס ומעלה, 90% או יותר מהזחלים אינם מגיבים גם לאחר 20 שניות של מגע. למרות שזחלים אלה ממשיכים לנוע לאחר החתך ה-22, ניתן גם למדוד ולשרטט את מספר הגלגול או הזמן המושקע בהתנהגות נסיגה של סלידה. באופן מפתיע, נראה שיש קשר הפוך בין טמפרטורת כניסת הגשושית לבין חוסן התגובה שכן נראה שטמפרטורות נמוכות יותר מעוררות מספר גבוה יותר של גלילים.

חמש התנהגויות סטריאוטיפיות של קטר נצפות בעת העברת הזחל השקוע במים לצלחת החום. ההשהיה הממוצעת שבה נצפות התנהגויות אלה מוצגות כאן כמו גם טמפרטורות טיפת המים הממוצעות שנמדדו עבור כל חביון בתנאי הבדיקה האופטימליים המוצגים כאן, אחוז הזחלים המראים כל התנהגות מובחנת נע בין 77 ל-100% אם כי מדי פעם התנהגויות הגלגול וההצלפה מושמטות, חופפות או מתרחשות בסדר הפוך. אחוז הזחלים ששרדו לאחר התחלת התנהגות השיתוק בבדיקת לוחית החום מוצג כאן. הזחלים חוממו עד לשיתוק ואז הוסרו לתנאי תרבית סטנדרטיים כדי להתאושש.

הזחלים שטופלו בדומה קיבלו טיפול שווה ערך למעט חשיפה לחום והיווצרות PPE בבוגרים ברי קיימא הייתה כמותית ביום השביעי עד ה-13. כאן, MD G ארבעה מניע ביטוי של טרנסגנים מווסתים כטב"מים בכל ארבעת המחלקות של נוירונים חושיים היקפיים רב-דנדריטיים. UAS או דלתא C אחת מבטאת גרסה שונה של תעלת האשלגן מיישר פתוח של דרוזופילה הנדרשת להעברה סינפטית ו-UAS orrc דלתא NC אחד מבטא גרסה שונה נוספת של אותו ערוץ שאינה מפריעה להעברה סינפטית.

שימו לב שרק זחלים הנושאים גם את ה-MD GALF 4 וגם את ה-UAS ORC 1 דלתא C טרנסגן מראים חביון מוגבר עבור ארבע מתוך חמש ההתנהגויות שנצפו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד תגובות מקומיות וגלובליות של זחלי פסולת GEs לגירויים תרמיים מזיקים. ניתן לשלב הליכים אלה עם שיטות אחרות כמו ניתוח גנטי כדי לזהות את הגנים הנדרשים לכאב תרמי בזמן ניסיון בדיקת בדיקת החום, חשוב לזכור למזער את השונות והלחץ, המיקום וזווית המגע של הגשושית.