שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב תסיסנית רימה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון נוציצפציה תרמית (תחושת כאב תרמית) בזחלי דרוזופילה. זאת משיגים על ידי איסוף זחלי דרוזופילה ולאחר מכן חשיפתם לגירויים תרמיים מזיקים. כשלב שני רחמש, ניתן להקרין את הזחלים ב-UV, דבר הגורם לנזק רקמתי ולרגישות נוציצפטית תרמית. לאחר מכן, ניתן לבחון את הזחליים באופן מקומי באמצעות גשש חום או באופן גלובלי באמצעות פלטת חימום, כדי לעורר תגובות נוציצפטיות שניתן למדוד כמותית.

גשש החום מראה כי לזחלים יש תקרת תגובה נוציצפטיבית לחום, וקשר מפתיע בין טמפרטורת הקלט לבין אמפליטודת התגובה שהופעלה. בדיקת פלטת החום מראה כי זחלים מציגים רצף סטריאוטיפי של התנהגויות נוציצפטיביות התלויות בטמפרטורת המים שמסביב ובפעילותם של הנוירונים התחושתיים הנוציצפטיביים. השיטות המתוארות כאן יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוציצפציה התרמית, כגון האם בעלי חיים מגיבים באופן שונה לגירויים תרמיים מזיקים המוצגים באופן מקומי או גלובלי.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בבדיקת גשש החום יתקשו בתחילה, מכיוון שהשליטה בבדיקה דורשת תרגול כדי למזער את השונות בלחץ, במיקום ובזווית ההחדרה של הגשש. הדגמה חזותית של בדיקת לוח החום היא קריטית, שכן כדי להבין באופן מיטבי את ההתנהגויות המתעוררות עם עליית הטמפרטורה, יש לראותן. כדי להשיג מספיק זחלי צאצאים של גנוטיפ מוגדר מתוך המאגר המבוקש, גדלו את המאגר הרצוי ישירות או בצעו הכלאות בבקבוקים המכילים מזון לזבובים, תוך שימוש ב-20 עד 30 נקבות בתולות ו-15 עד 20 זכרים. חמישה ימים לאחר הנחת הביצים, אספו ונקו זחלים בשלב מוקדם של הגיל השלישי (third instar) על ידי הוצאת מזון הזבובים הרך וסינון תחת זרם מים עדין דרך רשת בעלת גודל נקבים של 630 micron. העבירו את הזחלים בשלב המוקדם של הגיל השלישי למסדי מזון קטנים ולחים כדי למנוע הרעבה והתייבשות.

לאחר בניית תא ההרגעה, השתמשו בפינצטה או במברשת צבע כדי להניח בעדינות 10 זחלים בשלב מוקדם של הגוזירה השלישית לאורך הפנים של המכסה וסגרו אותו. בעבודה תחת מapay, הניחו את תא ההרגעה בתוך צנצנת חיבור המכילה כוס מדידה של 10 milliliter עם גדור צמר ספוג ב-1.5 milliliters של dathyl ether. סגרו את מכסה צנצנת החיבור כדי לחשוף את הזחלים לאדי האתר למשך שתי עד 2.5 דקות.

לאחר ההרדמה, הוציאו את תא ההרדמה מצנצנת ה-Coplan והמתינו מספר שניות תחת מ পোশাক מre-flow (מנדף) כדי ששאריות אדי האתר יתפזרו. השתמשו בבקבוק התזה של מים כדי לשטוף בעדינות את הזחלים מתא ההרדמה אל תוך צלחת פטרי קטנה. ייבשו את הזחלים המורדמים בעזרת נייר סופג ולאחר מכן הצמידו אותם בעדינות כאשר הצד הגבי up על רצועת סרט דביק דו-צדדי המודבקת לשקופית מיקרוסקופ מזכוכית בגודל של שלושה על einen אינץ'.

הניחו את השקופית על המשטח התחתון של תא הקרנה ב-UV וחשפו את הזחלים לאור UV למשך שש שניות בעוצמה של 20 millijoules per centimeter squared. לאחר ההקרנה, טבלו את השקופית במים כדי להפליט בעדינות את הזחלים מהסרט הדביק הדו-צדדי. השתמשו בפינצטה או במכחול כדי להעביר בעדינות את הזחלים שהוקרנו למכל בגודל 15 by 45 millimeter.

מבחנה מזכוכית בנפח של dram אחד המכילה מיליליטר אחד של מזון לזבובים, לצורך התאוששות למשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת התרבית הרצויה לפני ההעברה למארח חדש. עבור בדיקות של nociception תרמית, הגדירו תחילה את טמפרטורת הגשש התרמי לנקודת היעד הרצויה. השתמשו במכחול או בפינצטה כדי להעביר בעדינות זחל בודד אל פלטפורמה שטוחה, תוך הבטחה שהזחל מכוסה בשכבה דקה של מים.

על מנת למזער את השונות בלחץ ולהבטיח מיקום וזווית נכונים של חיישן החום, תרגול הוא המפתח להצלחה. לחצו בעדינות את קצה החיישן על הפסולת בפלח A 4, תוך הפעלת לחץ קל כאשר הקצה נמצא בזווית של כ-45 מעלות בין החיישן לפני השטח של הפסולת. הלחץ אמור ליצור שקע קל על פני השטח של הפסולת ובדרך כלל יספיק כדי למנוע תנועה.

המשיכו לגרות את הזחלים עד להופעת תגובת נסיגה או עד להגעה לנקודת העצירה ה-22. זחלים המגיבים מראים בדרך כלל התנהגות ראשונית של הרמה של הראש והזנב, ולאחריה התנהגות נסיגה המאופיינת בגלגול של לפחות 360 מעלות. ברגע שהתחילה התנהגות הנסיגה, הפסיקו את המגע עם הגשש ורשמו את השיהוי או את הזמן שעד להתרחשות הנסיגה.

אם לא נצפתה התנהגות נסיגה בתוך 20 שניות, הזחל נחשב כמי שאינו מגיב. מקמו את מוליכי האור של הסיבים האופטיים כדי להבטיח תאורה בעלת ניגודיות גבוהה ומספקת. לצורך צפייה בזחלים, הניחו את בלוק החימום בתוך פלטת החימום כאשר הצד השטוח פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן הניחו את פלטת החימום על בסיס המיקרוסקופ.

הפעילו את פלטת החימום להגדרה הגבוהה והמתינו כ-15 דקות עד שהטמפרטורה תתייצב על 95 °C. מדדו 80 µL של מים מזוקקים והניחו את טיפת המים במרכזה של צלחת פטרי מפוליסטירן בגודל 60 על 15 מ"מ באמצעות מיקרופיפטור. השתמשו בפינצטה כדי להניח בעדינות זחלי גיל שלישי נקיים למרכז טיפת המים, תוך הכנסת מינימום של מים נוספים.

הניחו בעדינות את צלחת הפטרי על גבי בלוק החימום המוצק שעל פלטת החימום. כוונו במהירות את מיקום הצלחת כך שהזחלים והטיפה של המים ייראו במלואם. הפעילו את הטיימר.

בשלב זה, מניחים את צלחת הפטרי על גבי בלוק החימום המוצק של פלטת החימום ורושמים את זמן תחילתו של כל התנהגות. חמש. התנהגויות לוקומוטוריות סטריאוטיפיות נצפות בעת העברת הזחל הטבול במים לפלטת החימום. התנהגות נורמלית בהיעדר חום כוללת לוקומוציית שמשייה (parasol locomotion), הנלווית לתנועות ראש של חיפוש.

התנהגות של נעידת ראש (Head thrash) עשויה להופיע בשלב הבא, שבו הזחל מניע את ראשו במהירות בתנועה קדימה או הצידה. תנועה זו דומה לתנועתם הרגילה במים, אך היא מתרחשת בצורה תלושה יותר ובגלילה מתמדת. ההתנהגות נרשמת כאשר הזחל מתגלגל הצידה לפחות 360 מעלות מלאות.

דבר זה יכול להתרחש מספר משתנה של פעמים ולעיתים כולל גלגולים חלקיים. לצורך דירוג ההתנהגות, יש לספור רק גלגולים מלאים של 360 מעלות. התנהגות זו היא הדומית ביותר לסצנה עם יישום מקומי של גשש החום במהלך התנהגות שוט (whip behavior).

הזחל מראה תנועות התכווצות ושחרור מהירות לאורך הציר האנטרו-פוסטריורי (מהראש לכיוון הזנב), המקרבות את הראש לזנב לזמן קצר מאוד. תנועות צליפה נצפות לעיתים קרובות ברצף מהיר, שתיים מהן, או בו-זמנית עם התגלגלות. לבסוף, הזחל יפגין התנהגות של פרכוסים, שלעיתים קרובות מובילה לשיתוק. במהלך התנהגות הפרכוסים, הזחל נמתח לאורך הציר האנטרו-פוסטריורי ומפגין רעידות של כל הגוף בתדירות גבוהה.

התנהגות רעידה ללא שיתוק כפיפה מתרחשת כאשר הזחל מפסיק לנוע. בחלק מהזחלים מצב זה הוא קבוע, בעוד שאחרים מפגינים לאחר מכן תנועת פעימה בתדר נמוך. בגרף זה של אחוז המגיבים השייכים לכל קטגוריה, קיים רף עליון לתגובת הנוספציה התרמית של הזחלים. במבחן גשש החום, 100% מהזחלים הם מגיבים מהירים עד לטמפרטורת גשש של 52 degrees Celsius.

עם זאת, בטמפרטורה של 54 °C ומעלה, 90% או יותר מהזחלים אינם מגיבים גם לאחר 20 שניות של מגע. למרות שזחלים אלו ממשיכים לנוע לאחר נקודת החיתוך ה-22, ניתן למדוד ולשרטט גם את מספר הגלגולים או את הזמן שהושקע בהתנהגות של נסיגה מרתיעה. באופן מפתיע, נראה כי קיים קשר הפוך בין טמפרטורת הכניסה של הגשש לבין עוצמת התגובה, שכן טמפרטורות נמוכות יותר נראות כמעוררות מספר גבוה יותר של גלגולים.

חמישה התנהגויות תנועה סטריאוטיפיות נצפות בעת העברת הזחל הטבול במים ללוחית החימום. השהיות הממוצעות שבהן נצפו התנהגויות אלו מוצגות כאן, וכך גם טמפרטורות טיפות המים הממוצעות שנמדדו עבור כל השהיה תחת תנאי הבדיקה האופטימליים המוצגים כאן; אחוז הזחלים שהפגינו כל התנהגות נפרדת נע בין 77% ל-100%, אם כי לעיתים התנהגויות הגלגול וההצלפה מושמטות, חופפות או מתרחשות בסדר הפוך. אחוז הזחלים ששרדו לאחר תחילת התנהגות השיתוק בבדיקת לוחית החימום מוצג כאן. הזחלים חוממו עד לשיתוק ולאחר מכן הועברו לתנאי תרבית סטנדרטיים להתאוששות.

הזחלים שקיבלו טיפול דמה (mock treatment) עברו טיפול מקביל למעט החשיפה לחום, והיווצרות ה-PPE בבוגרים בריאים נמדדה כמותית ביום השביעי עד השלושה-עשר. כאן, MD G four מניע ביטוי של טרנסגנים המונחים על ידי UAS בכל ארבעת הסוגים של נוירונים תחושתיים פריפריים מרובי דנדריטים. UAS or one delta C מבטא גרסה שונה של תעלת אשומה פתוחה של אשלגן (open rectifier potassium channel) ב-drosophila, הדרושה להעברה סינפטית, ו-UAS orrc one delta NC מבטא גרסה שונה עוד יותר של אותה תעלה, שאינה מפריעה להעברה סינפטית.

שימו לב שרק זחליים הנושאים הן את הדרייבר MD GALF four והן את התראנסגן UAS ORC one delta C מראים השהיות מוגברות בארבעה מתוך חמשת ההתנהגויות שנצפו. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן למדוד תגובות מקומיות וגלובליות של זחלי GEs offal לגירויים תרמיים מזיקים. ניתן לשלב נהלים אלה עם שיטות אחרות, כגון אנליזה גנטית, כדי לזהות את הגנים הדרושים לנוציצפציה תרמית. בעת ביצוע בדיקת גשש החום, חשוב לזכור לצמצם ככל הניתן את השונות בלחץ, במיקום ובזווית המגע של הגשש.