ויזואליזציה של Proprioceptors ב תסיסנית זחלים וגלמים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין איברי קורטון פרופריוספטיביים בזחלים ובפובי של דרוזופילה. זה מושג על ידי גידול ראשון ואיסוף שלישי בזחלי כוכב או פובי לאחר נתיחה של הזחלים או הגולם. הם קבועים לצביעה חיסונית.

לאחר מכן, הזחלים הקבועים או הגולם הם כתם חיסוני עם הנוגדנים המתאימים. השלב האחרון הוא הרכבת הדגימות המוכתמות למיקרוסקופיה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת להמחשת איברי הקורטונים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי התפתחות פוסט-סימביונית ודפוס של קולטני אביזרים ב-oph. למרות שהליך זה עשוי לספק תובנה לגבי התפתחות קולטני אביזרים, ניתן ליישם אותו גם על איברים אחרים כגון סוגים אחרים של איברי חישה וגידים. ראשית, הרכיבו את הכלים, הפתרונות הדרושים ובקבוקון שוטטות.

שלישי בזחלי כוכבים, שמור את תמיסות PBS ו-FIXATIVE על קרח. בחרו שליש נודד בזחלי כוכבים מקיר הבקבוקון והניחו אותו בטיפה של 50 מיקרוליטר של PBS קר כקרח על צלחת חיתוך עשויה אלסטומר סיגר בצלחת תרבית רקמות. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, מחזיקים את הזחלים, הצד הגבי כלפי מעלה ליד הפה, ווים בעזרת מלקחיים עדינים ותוקעים סיכת חרקים דרך המוח.

תפוס את הקצה האחורי של הזחלים בעזרת המלקחיים. משוך בעדינות ומתח את הזחלים בעדינות לאורך. הדביקו סיכת חרקים נוספת בין שני הכדורים האחוריים בעזרת מספריים קפיציים.

חותכים שני חתכים אופקיים בדופן הגוף בניצב לציר האחורי הקדמי, תוך שמירה על קרוב לפינים הקדמיים והאחוריים. לאחר מכן, חתוך את דופן גוף הזחל לאורך קו האמצע הגבי מהחתך הקדמי לאחורי. הסר את האיברים הפנימיים ואת קנה הנשימה בעזרת מלקחיים עדינים.

לאחר מכן יש לשטוף בעדינות פעם או פעמיים עם PBS. תפוס את שני דשי דופן הגוף בעזרת מלקחיים. מתחו אותם והצמידו אותם לצלחת בעזרת שני סיכות חרקים לכל צד.

הסר את ה- PBS והוסף 50 מיקרוליטר של תמיסה מקבעת. דוגרים 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הקיבוע ושטיפה פעמיים עם PBS, משוך את סיכות החרקים בעזרת מספריים קפיציות.

חותכים את ראש הזחל והזנב ומשאירים פילה מלבני. העבירו את הרקמה הקבועה לצינור עינור מקורר עם PBS. לאחר תיקון מספר מספיק של זחלים, ניתן להמשיך ישירות לצביעת נוגדנים.

אם אין צורך בכתמים מיידיים, יש לשטוף את הזחלים הקבועים שלוש פעמים בחמש דקות כל אחד עם אתנול 95% ואז לאחסן באתנול במינוס 20 מעלות. טפל בבקבוקונים כמו לקיבוע הזחלים עד שזחלי הכוכב השלישי מתחילים לאכול. בדקו את הבקבוקונים כל שעה וסמנו זחלים שאכלו.

אפשר לגולגולת המסומנת להתפתח במשך 30 עד 40 שעות ב-24 מעלות צלזיוס, או 24 עד 27 שעות ב-29 מעלות צלזיוס באמצעות מלקחיים עדינים. בחרו 20 עד 30 פוב בגיל המתאים והכניסו אותם לכלי פורצלן כהה לניתוח בארות. היזהר לא לפגוע ברקמות המעניינות.

לאחר מכן, חלץ את הגור מאריזות האישונים שלו. התחל בקילוף האופרקולום והמשך עד שהגולם חופשי. מחלצים את כל הגורים ומכניסים אותם לבאר מלאה ב-PBT.

מניחים חמישה פוי על משטח ישר בין בארות כלי החיתוך בעזרת סכין מיקרו חיתוך. חותכים את קצה הראש ואת הקצה האחורי של הבטן. החזיקו את הגולם במקומו באמצעות מלקחיים עדינים והשתמשו במזרק של מיליליטר אחד כדי לשטוף את האיברים הפנימיים של הגולם על ידי הזרקת PBT דרך הפתח הקדמי.

שוטפים את הגולם המנותח לזמן קצר על ידי טבילתו בבאר מלאה ב-PBS ומעבירים אותו לקיבוע הקר בצינור עינור השמור על קרח. דגרו את הפוי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת.

השליכו את הקיבוע ושטפו את הפובי עם PBT שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל כביסה. שמור את פובי הכביסה על קרח. ממלאים שתי בארות של צלחת החיתוך ב- PBT.

בעזרת פיפטה פסטי פוליאתילן. מעבירים כמה פובי לאחת הבארות. לאחר מכן העבירו גולם אחד בכל פעם לתוך השני. ובכן.

בעזרת שני זוגות מלקחיים חדים עם קצוות מיושרים בצורה מושלמת, הצמידו את הגולם לתחתית הבאר ולאחר מכן קרעו בעדינות את הציפורן. הסרת ציפורן הכנף היא ההיבט הקשה ביותר בהליך זה. אנו תמיד מאבדים חלק מהכנפיים בשלב זה, וזו הסיבה שאנו מתחילים את ההליך עם מספר גדול יחסית של גולמים.

לאחר שהציפורן נקרעת, קלף אותה מהכנף. היזהר לא לנתק את הכנף מהגולם. לאחר קילוף הקוטיקולה מלהב הכנף, יש להמשיך לקלף את הקוטיקולה של ציר הכנף.

לאחר קילוף ציפורן הכנף, ניתן לנסות לקלף את ציפורן הרגל באופן דומה. רגליים רבות עשויות ללכת לאיבוד בתהליך, אך למרות התשואה הנמוכה, שלב זה מומלץ מאוד מכיוון שהוא משפר מאוד את הכתמת איברי הקורטונים ברגליים. מניחים את הגולם בצינור עינור מלא במתנול ושומרים אותו בטמפרטורת החדר.

המשיכו לקלף את הציפורן של כל הפוי והוסיפו אותם לאותה שפופרת בסך הכל לפחות 10 פוי קלופים יפה. עבור כל מכתים, הסר את המתנול ושטוף שלוש פעמים חמש דקות כל אחת עם 95% אתנול. ניתן לשמור PUY קבוע לפרקי זמן ארוכים ב-95% אתנול במינוס 20 מעלות לפני צביעה חיסונית.

כדי להרכיב את הזחלים, הניחו טיפה של חומר הרכבה על שקופית מיקרוסקופ ולאחר מכן מקמו את הזחלים כשהציפורניים פונות כלפי מטה ושרירי דופן הגוף פונים כלפי מעלה. שים טיפה קטנה של מדיום הרכבה על החלקת כיסוי נקייה והשתמש בה כדי לכסות את התכשיר מבלי להפעיל לחץ על הזחלים המותקנים. כדי לעלות על הערווה.

ראשית, הכינו שתי שקופיות מיקרוסקופ עם טיפת מדיום הרכבה, האחת לדיסקציה והשנייה להרכבה. הניחו כמה pu על אחת המגלשות ולאחר מכן השתמשו במספריים הקפיציים כדי להסיר את הראש ואת החלק האחורי של הבטן. לאחר מכן, הפרד את החצי הגבי של בית החזה מחצי הגחון על ידי חיתוך בין הכנפיים לרגליים.

הנח את חלקי הגוף המנותחים של הגולם בטיפת מדיום ההרכבה. בשקופית השנייה, וודאו שהכנפיים והרגליים מתוחות ונסו למזער ככל האפשר את שכבת הרקמות. לבסוף, הנח טיפה של מדיום הרכבה על החלקת כיסוי והנח אותה מעל הדגימה מבלי להפעיל לחץ מוגזם.

מיקרוגרף קונפוקלי זה של איברי קורטון של כתמים חיסוניים בזחלי כוכב שלישי מראה קטע בטן מתוח יפה שבו שבעה מתוך שמונת איברי הקורטונים נראים בבירור. ניכרים חמשת האיברים הרוחביים היוצרים יחד את איבר השומנים של פנאסקו, איבר רוחבי יחיד ואחד משני איברי קורטון גחוניים. תאי העצב של איבר הקורטונים מסומנים בסמן העצבי, נוגדן חד-שבטי 22 C 10, ומוצגים באדום.

מכסה הרצועה ותאי החיבור מסומנים באנטיפה טובולין 85 E ומוצגים בכחול. תאי הכובע והרצועה מסומנים בנוסף באיבר קורטי טונאלי. כתב GFP ספציפי המכיל אלמנט רגולטורי עבור לוקוס דלילה.

כאן, האיברים הטונאליים של קורטי הכנף בווריד הרדיאלי הגחוני מוצגים במיקרוגרף קונפוקלי זה של גולם בן 35 שעות. תאי העצב מסומנים בסמן העצבי 22 C 10, ומוצגים באדום ובפאנל B.תאי הרצועה והכובע מסומנים יחד עם נוגדנים אנטיפה טובולין 85 E המוצגים בכחול ובפאנל C, כמו גם איבר קורטי טונאלי. טרנסגן מדווח GFP ספציפי מוצג בירוק.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין איברי קורטון פרופריוספטיביים הן בזחל והן בגולם ב-oph. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהוא עבר אופטימיזציה לשימוש בנוגדנים המתוארים. נוגדנים שונים עשויים לדרוש תנאי קיבוע וצביעה שונים במקצת.

לפיכך, כאשר משתמשים בהליך זה עם נוגדנים שונים, יש למצוא את התנאים האופטימליים לנוגדנים הנמצאים בשימוש.