Name: ויזואליזציה של Proprioceptors ב תסיסנית זחלים וגלמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למד הדמיית איברי מיתר חישה בזחלים וגלמים של Drosophila melanogaster באמצעות חיטוי נוגדנים ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות איברי תחושה בנוירוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות בנק מחקרים Hybridoma התפתחותית באוניברסיטת איווה לשליחת לנו נוגדנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק (מס &#39;29/08) מן הקרן הלאומית למדע. כפי נתמכת גם על ידי מענק מחקר של DFG (דויטשה Forschungsgemeinschaft).

לפני שתתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבויות לטוס הרצויות. שמור את צלוחיות צפופות (כ 30 זבובים בכל בקבוקון 50 מ&quot;ל). בואו הזבובים להטיל ביצים ליום אחד בלבד בבקבוקון אחד. זה יספק היצע מספיק זחלי המזון ולאפשר להם להגיע לגודל מקסימלי לפני לזחול החוצה של מזון. שמור את צלוחיות בטמפרטורה המתאימה עד 3 זחלים instar להתחיל לנדוד על הקיר את הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מלאי חדש של פוספט בופר סליין (PBS) וכן PBT (0.1% ב Tween PBS). שמור על 10 מ&quot;ל של PBS על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 1-5 מ&quot;ל של מקבע טרי (פורמלדהיד 4% PBT) ולשמור את זה על הקרח. אנו משתמשים פורמלדהיד 37-38% בבקבוקים כפתרון המניות. </li></ol> 1. דיסקציה ו קיבוע של הזחלים Instar השלישי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נדודים 3 הזחל instar מהקיר בקבוקון ולמקם אותו טיפה 50 μl של קר כקרח PBS על צלחת לנתיחה Sylgard (עשוי ערכת Sylgard 184 סיליקון אלסטומר, Dow Corning תאגידרקמת מנה התרבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק, זחל בצד הגב למעלה, ליד הפה ווים, באמצעות מלקחיים עדינים (דומונט # 5 מלקחיים), ולתקוע סיכה חרק (minutien, 0.1 מ&quot;מ, נירוסטה) דרך המוח של הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הקצה האחורי של הזחל עם המלקחיים, למשוך בעדינות למתוח את הזחל בעדינות לאורכו. מקל עוד סיכה חרק בין שני spiracles האחוריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האביב מספריים חותכים שני חתכים אופקיים הקיר הגוף (בניצב לציר הקדמי, האחורי), קרוב סיכות הקדמי וגם האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חותכים האביב הקיר גוף הזחל לאורך קו האמצע של הגב הקדמי כדי החתך האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של האיברים הפנימיים (המעיים, בלוטות הרוק, malpighian tubules וכו &#39;) ואת קנה הנשימה באמצעות מלקחיים עדינים. לשטוף בעדינות פעם או פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את קיר מדפים שתי הגוף עם מלקחיים, למתוח אותם ולהדק אותם לצלחת באמצעות שתי סיכות חרקים לכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את PBS ולהוסיף 50 μl של פתרון תיקון (פורמלין 4% PBT). דגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע. שטפו פעמיים עם PBS. משוך את הפינים חרקים. האביב מספריים חותכים את הראש והזנב הזחל ולהשאיר פילה מלבני. העברת רקמות קבוע צינור Eppendorf צונן עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מספר מספיק של הזחלים הם קבועים, אפשר להמשיך ישירות מכתים נוגדנים. אם מכתים מיידית אינו רצוי, הזחלים קבוע יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 95% אתנול ו מאוחסן אתנול 95% ב -20 ° C. </li></ol> 2. דיסקציה ו קיבוע של גלמים חלק א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתתף את צלוחיות כמו קיבעון הזחלים, עד 3 זחלים instar מתחילים pupariate. לבחון את צלוחיות כל הזחלים שעה סימן כי יש pupariated. אפשר גלמים ניכרת לפתח השעות 30-40 ב 24 ° C, או 24-27 שעות ב 29 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים עדינים לקחת 20-30 גלמים של הדואר בגיל המתאים ולשים אותם בצלחת חרסינה כהה רב גם לנתח. להיזהר לא לפגוע ברקמות של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ גלמים ממקרה גלמי. בגין על ידי קילוף operculum וממשיכים עד גולם ללא תשלום. שים את הגולם אל מלא גם עם PBT. המשך מיצוי כל גלמים. צעדים 2.4-2.6 צריך להיעשות בקבוצות קטנות של גלמים 5 בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 5 גלמים על משטח ישר בין הבארות של צלחת לנתח. בעזרת סכין דיסקציה מיקרו לחתוך את קצה הראש וקצה האחורי של הבטן (לחילופין, ניתן להשתמש בשני זוגות של מלקחיים לקרוע חורים בשני הקצוות של גלמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את גולם במקום באמצעות מלקחיים עדינים ולהשתמש מזרק 1 מ&quot;ל לשטוף את האיברים הפנימיים של גולם, על ידי הזרקת PBT דרך הפתח הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בקצרה גזור גולם על ידי טבילה אותו מילא היטב עם PBS והעבר אותו לתוך מקבע קר בצינור Eppendorf כל הזמן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בין לילה (ON) בשעה 4 ° C. </li></ol> חלק ב &#39; <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק מקבע ולשטוף את גלמים שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBT. שמור על גלמים דהוי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את שתי בארות של המנה לנתח עם PBT. שימוש פוליאתילן פסטר העברת פיפטה גלמים כמה לאחד הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז 1 גולם בכל פעם אל הבאר 2. באמצעות שני זוגות מלקחיים חדות עם טיפים מיושר לגמרי, לקלף את העור המת גלמי שקוף של האגף: להבטיח את הגולם אל החלק התחתון של זוג 1 גם באמצעות מלקחיים, בעדינות לקרוע את העור המת באמצעות זוג נוסף של מלקחיים. לאחר לציפורן נקרע, לקלף אותו באגף. היזהר שלא לנתק את הזרוע מן הגולם. לאחר קילוף העור המת מן הלהב כנף, להמשיך פילינג לציפורן של ציר הזרוע (שם ChOs כנף נמצאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קילוף העור המת האגף, אפשר לנסות לקלף את העור המת רגל באופן דומה.רגליים רבים עשויים ללכת לאיבוד בתהליך, אך למרות התשואה הנמוכה, שלב זה מומלץ ביותר שכן הוא משפר באופן משמעותי את צביעת ChOs הרגל. את ChOs של haltere והבטן ניתן דמיינו בלי יותר קילוף העור המת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את &quot;קלופים&quot; גולם בצינור Eppendorf מלא מתנול לשמור בטמפרטורת החדר. המשך לקלף את העור המת של גלמים הכל, ולהוסיף אותם הצינור אותו דבר. לפחות 10 גלמים קלופים יפה יש לאסוף את כל מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתנול לשטוף שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 95% אתנול. גלמים קבוע יכולים להישמר במשך תקופות זמן ארוכות באתנול 95% ב -20 ° C. </li></ol> 3. Immunostaining של זחלים וגלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הרקמה קבוע עם PBT שלוש פעמים, 30 דקות כל אחד, בטמפרטורת החדר. הזחלים ניתן לכבס עם טלטול עדין על צלחת מסתובבת. גלמים נשטפים בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBT עם חיץ חוסם (PBT + 5% nעז סרום ormal) ו דגירה על על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ חסימת דגירה עם נוגדנים ראשוניים (מדולל חסימת חיץ) ביום ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים עם PBT כמתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBT ו דגירה עם נוגדנים משניים (מדולל חסימת חיץ) ביום ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם PBT ופעם עם PBS כמתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS עם הרכבה בינונית (Dako בינוני פלורסנט הרכבה (Dako Cytomation, Glostrup, דנמרק) ואת דגירה על 4 מעלות צלזיוס ב. </li></ol> 4. הרכבה של הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחלים הם רכובים על שקופיות מיקרוסקופ בטיפת התקשורת גובר עם לציפורן שלהן פונה כלפי מטה וקיר שרירי הגוף כלפי מעלה. לשים טיפה קטנה של המדיום גובר על פיסת כיסוי נקי ולהשתמש בו כדי לכסות את ההכנה. אינן חלות על כל לחץ על זחלים עלה. </li></ol> 5. הרכבה של גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי שקופיות מיקרוסקופעם ירידה של המדיום גובר, 1 לנתיחה והשני עבור הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים כמה גלמים על אחת השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האביב באמצעות מספריים להסיר את הראש ואת חלקו האחורי של הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד 1/2 הגב של בית החזה מהמחצית הגחון על ידי חיתוך בין בכנפיים וברגליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חלקי גופות מבותרות של גולם בשקופית מיקרוסקופ השני ירידה של פתרון גובר. להבטיח את הכנפיים והרגליים מתוחות ולנסות למזער בכיסוי של רקמות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של המדיום גובר על פיסת כיסוי ומניחים אותו על המדגם. אל תפעיל לחץ על מדגם רכוב. </li></ol> 6. נציג תוצאות דוגמה חיסונית המוכתמים ChOs של הזחל instar 3 מוצג באיור 1. דוגמה זו מראה הבטן נמתח קטע יפה שבו 7 מתוך שמונת ChOs גלויים לעין. הנוירונים הם במעבדההופנו אליה עם MAb22C10 (01:20, המתקבל בנק Hybridoma מחקרים התפתחותית באוניברסיטת איווה), כובע, רצועה, מכסה, מצורף והקשר תאים ברצועות מסומנים עם אנטי αTub85E (01:10, קליין ואחרים. 2010). נוגדנים משנה של מכתים ניאון היו Cy3 או Cy5-מצומדות anti-mouse/rabbit (1:200, ג&#39;קסון Immunoresearch מעבדות). דוגמאות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ confocal (LSM 510, Zeiss). מקבץ של ChOs כנף על הווריד רדיאלי הגחון של 35 שעות בן גולם מוצג באיור 2. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> איור 1 (א) איור סכמטי של ששת סוגי התאים המרכיבים איבר יחיד: Ch. קבצים מצורפים שוק (CA), שוק (C), scolopale (S), תא עצב (N), רצועה (L) מצורף רצועה (LA ). איבר LCh5, שבו חמש ChOs מקובצים, נמתח על פני קבוצה של שרירים רוחביים לרוחב (LT1-4). שריר האורך לרוחב (LL1), שרירי האורך הגחון (VL1-4) שרירים אלכסונית לרוחב (LO1) באים לידי ביטוי גם. תאים גיד באים לידי כמו כדורים חומים (מתוך קליין et al., 2010). (ב) קטע אחד הבטן של הזחל instar 3 הנצפים בהגדלה של 10X. שבעה מתוך שמונה ChOs הנוכחי בכל מגזר בטן ניכרים: איברים צדדיים חמש שיחד יוצרות איברים pentascolopidial (LCh5), איבר אחד לרוחב (LCh1) ואחד משני ChOs הגחון (VChB). הנוירונים (N) של ChOs את מסומנים בטוש העצבית MAB 22C10 (אדום). רצועה (L), שוק (C) ותאי צירוף קובץ (לוס אנג&#39;לס, קליפורניה) מסומנים עם אנטי αTub-85E (כחול). התאים את המכסה רצועה מסומנים בנוסף עם כתב צ&#39;ו ספציפי GFP מחסה אלמנט הרגולציה מן לוקוס dei (נחמן et al., נתונים שלא פורסמו). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> איור 2. </sטרונג&gt; האיברים chordotonal כנף על הווריד רדיאלי הגחון נתפסים בהגדלה של 40X. הנוירונים (N) מסומנים עם 22C10 סמן עצביים (אדום, ב &#39;). את הרצועה (L) שווי שוק (C) התאים הם שיתוף התווית נגד αTub85E נוגדנים (כחול, C) ו צ &#39;ו ספציפי GFP כתב transgene (נחמן et al., נתונים שלא פורסמו).

<ol><li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li>
<li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li>
<li>Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+the+vibes%3A+chordotonal+mechanisms+in+insect+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).</li>
<li>Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Johnston%27s+organ+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Johnston's organ in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+adhesion+in+the+Drosophila+wing+is+mediated+by+Delilah%2C+a+potent+activator+of+%CE%B2PS+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression.</a> Dev Biol. 351, 99-109 (2011).</li>
<li>Field, L. H., Matheson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordotonal+organs+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chordotonal organs of insects.</a> Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).</li>
<li>Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+interdependent+TRPV+channel+subunits%2C+inactive+and+Nanchung%2C+mediate+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).</li>
<li>Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+ectodermal+attachment+cells+via+an+EGFR-dependent+mechanism+during+the+organogenesis+of+Drosophila+proprioceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors.</a> Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).</li>
<li>Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atonal+is+a+proneural+gene+that+directs+chordotonal+organ+formation+in+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system.</a> Cell. 73, 1307-1321 (1993).</li>
<li>Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+proneural+gene%2C+atonal%2C+in+formation+of+Drosophila+chordotonal+organs+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors.</a> Development. 121, 2019-2030 (1995).</li>
<li>Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRPV+family+ion+channel+required+for+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila.</a> Nature. 424, 81-84 (2003).</li>
<li>Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+and+contractile+systems+in+Drosophila+are+both+patterned+by+the+EGR+family+transcription+factor+Stripe%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe.</a> Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).</li>
<li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila%3A+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments%2C+developing+muscle%2C+and+testis+cyst+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li>
<li>Okabe, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+induction+of+chordotonal+organ+precursors+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis.</a> Development. 124, 1045-1053 (1997).</li>
<li>Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li>
<li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li>
<li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

פרוטוקול המתואר בסרט הזה מספק דרך לדמיין ChOs פרופריוצפטיביות בשלבי הזחל ו גלמי. מחקרים על מבנה ופיתוח של ChOs פרופריוצפטיביות היה מוגבל עד כה בעיקר בשלבים עובריים וכן דיסקים דמותי הזחל. כך, היבטים רבים של בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, של ChOs הן הזחל ומבוגרים, אינם ידועים ברובם. הפרוטוקול המתואר, בשילוב עם כלים גנטיים משותפים תסיסנית, יכול להיות מנוצל כדי ללמוד לזהות גנים חדשים ושבילים כי תפקיד בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ChOs. פרוטוקול זה מותאם במיוחד להדמיה של צ &#39;ו, אבל זה יכול להיות מותאמים עבור צביעה של רקמות אחרות, כגון כנפיים גלמי 6.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / כלי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> דומון # 5 (או # 55) מלקחיים, biologie עצה </td><td> FST </td><td> 11252-20 או 11252-10 (או מלקחיים דומות) </td><td></td></tr><tr><td> אוסטרליץ נירוסטה סיכות חרקים, minutiens 0.1mm </td><td> Roboz Co כלי כירורגי </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 אלסטומר סיליקון ערכת </td><td> חברת Dow Corning </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas מיקרו מספריים (ישר, 7.5 ס&quot;מ, להב 3mm) </td><td> כפי Mdeizintechnik בע&quot;מ </td><td> 11-590-00 </td><td> מספריים Vannas אביב עם מפרט זהה ניתן לרכוש Roboz כלי ושות כירורגי </td></tr><tr><td> Orbital שאכר - Rotamax-120 </td><tד&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako פלורסנט הרכבה בינונית </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, דנמרק </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 ניסוח PBS </td><td colspan="2"> 2 גר &#39;/ מואר KCl, 2 גר&#39; / מואר KH 2 PO 4, 80 גר &#39;/ מואר NaCl, 21.7 גר &#39;/ מואר Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> איכות PBS הוא קריטי להצלחה של פרוטוקול זה </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0.1% Tween 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

הפרופריוספציה היא היכולת לחוש את התנועה, או מיקום של חלקי הגוף על ידי להגיב לגירויים שמקורם בתוך הגוף. בפריזבוב וחרקים אחרים הפרופריוספציה מסופק על ידי אברי החישה מיוחדות המכונות איברים chordotonal (ChOs) 2. כמו איברים רבים אחרים תסיסנית, ChOs לפתח פעמיים במהלך מחזור החיים של הזבוב. ראשית, ChOs הזחל לפתח במהלך embryogenesis. לאחר מכן, את ChOs מבוגרים מתחילים להתפתח הדיסקים דמותי הזחל ולהמשיך להבדיל במהלך המטמורפוזה. הפיתוח של ChOs הזחל במהלך embryogenesis נחקרה בהרחבה 10,11,13,15,16. במרכזו של כל צ&#39;ו היא יחידה חושית המורכבת נוירון ו תא scolopale. היחידה החושית נמתח בין שני סוגים של תאים אביזר זה לצרף לציפורן באמצעות תאים מיוחדים התקשרות אפידרמיס 1,9,14. כאשר זחל זבוב מהלכים, תזוזה יחסית של דוארתאים מצורפים pidermal מוביל מתיחה של יחידת חושי פתיחת הסוגר של ספציפיים חולפים פוטנציאליים הקולטן vanilloid (TRPV) ערוצים בקטע החיצוני של 8,12 דנדריט. האות עורר הוא הועבר לאחר מכן במעגל מחולל מרכזי של תנועה דפוס במערכת העצבים המרכזית. ChOs מספר תוארו הזבוב הבוגר 7. אלה ממוקמים ליד המפרקים של הנספחים זבובים בוגרים (רגליים, כנפיים מטפחת) והן בית החזה והבטן. בנוסף, כמה מאות ChOs ביחד ליצור איברים של ג&#39;ונסטון אנטנה הבוגרת כי אקוסטית transduce לאנרגיה מכנית 3,5,17,4. בניגוד ידע רב על התפתחות ChOs בשלבים עובריים, מעט מאוד ידוע על המורפולוגיה של איברים אלה בשלבי הזחל. יתר על כן, למעט ChOs הירך 18 ועוגב של ג&#39;ונסטון, knowled שלנוGE על התפתחות ומבנה ChOs של הזבוב הבוגר הוא חלקי מאוד. כאן אנו מתארים שיטה מכתים באופן חזותי ChOs ב זחלים וגלמים instar השלישי. שיטה זו יכולה להיות מיושם יחד עם כלים גנטיים כדי לאפיין טוב יותר את המורפולוגיה ולהבין את התפתחותם של ChOs שונים לטוס.

שיטה immunostain ולדמיין איברים chordotonal ב זחלים וגלמים של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; מתוארת.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

פרופריוצפציה (Kinaesthesia) היא היכולת לחוש את התנועה, או המיקום, של חלקי גוף באמצעות תגובה לגירויים הנוצרים בתוך הגוף. בזבובים ו...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את איברי הקורטון (cortone organs) הפרופריוצפטיביים בזחלים ובבובנאות של הדרוזופילה. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול ואיסוף של זחלים בשלב השלישי או בובנאות, ולאחר מכן ביצוע דיסקציה של הזחלים או הבובנאות. אלו מקובעים לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית.בשלב הבא, הזחלים או הבובות המקובעים עוברים צביעה אימונוהיסטוכימית עם הנוגדנים המתאימים. השלב הסופי הוא הרכבת הדגימות הצבועות לצורך מיקרוסקופיה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקאלית כדי להדמות את איברי הקורטון.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע להתפתחות לאחר הסימביוזה ולדפוס הפריסה של קולטני prop ב-oph. אף על פי שפרוצדורה זו עשויה לספק תובנות לגבי התפתחות קולטני prop, ניתן להחילה גם על איברים אחרים, כגון סוגים אחרים של איברי חיש וגידים. ראשית, הכינו את הכלים הדרושים, את התמיסות ואת בקבוקון של wandering.בשלב הלמיס של זחלים בשלב השלישי, שמרו את תמיסות ה-PBS וה-FIXATIVE על קרח. בחרו זחל בשלב השלישי שנמצא בתנועה מדופן הבקבוק והניחו אותו בטיפה של 50 microliter של PBS קר מאוד על לוחית ניתוח העשויה מאלסטומר סיגריה בתוך צלח לתרבית רקמות. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, החזיקו את הזחלים כאשר הצד הגבי פונה למעלה, קרוב לוויי הפה, בעזרת פינצטה עדינה, ודקרו סיכת חרקים דרך המוח.תפסו את הקצה האחורי של הזחלים באמצעות פינצטה. משכו בעדינות ומתחו את הזחלים בעדינות לאורכם. תקעו סיכה לאנטומיה של חרקים נוספת בין שני הכדורים האחוריים באמצעות מספרי קפיץ.בצעו שתי חתכים אופקיים בדופן הגוף בניצב לציר הקדמי-אחורי, תוך שמירה על קרבה לפינים הקדמיים והאחוריים. לאחר מכן, חתכו את דופן גוף הזחל לאורך קו האמצע הגבי, מהחתך הקדמי ועד האחורי. הסירו את האיברים הפנימיים ואת הקנה בעזרת פינצטה עדינה.לאחר מכן שטפו בעדינות פעם אחת או פעמיים ב-PBS. אחזו בשני השטחים של דופן הגוף באמצעות פינצטה. מתוחו אותם והצמידו אותם ללוח בעזרת שני סיכות חרקים לכל צד.הסיר את ה-PBS והוסף 50 µL של תמיסות קיבוע. דגרה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת תמיסת הקיבוע ושטיפה פעמיים עם PBS, שלוף את סיכות החרקים באמצעות מספרי קפיץ.יש לחתוך את ראשו וזנבו של הזחל כך שתישאר פרוסה מלבנית. העבירו את הרקמה המקובעת לשפופרת ainor מקוררת המכילה PBS. לאחר שמספר מספיק של זחלים קובע, ניתן להמשיך ישירות לצביעה בנוגדנים.אם לא מעוניינים בצביעה מיידית, יש לשטוף את הזחלים המקובעים שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם ב-95% ethanol ולאחר מכן לאחסנם באתנול בטמפרטורה של minus 20 degrees. יש לעקוב אחר המבחנות כפי שנעשה בקיבוע הזחלים עד שתזחלי השלב השלישי (third instar) יחלו לבקוע. יש לבחון את המבחנות בכל שעה ולסמן את הזחלים שבקעו.אפשרו לבוצק המסומן להתפתח במשך 30 עד 40 שעות ב-24 degrees Celsius, או 27 עד 24 שעות ב-29 degrees Celsius. בעזרת פינצטה עדינה, בחרו 20 עד 30 בוצקים בגיל המתאים והניחו אותם בתוך צלוחית נתיחה מפורצלן בעלת מספר בארות, בחשיכה. היזהרו לא לפגוע ברקמות המדוברות.בשלב הבא, הוציאו את הגלגולים מתוך נרתיקי הגלגול. התחילו בקילוף ה-operculum והמשיכו עד שהגלגול ישתחרר. הוציאו את כל הגלגולים והניחו אותם בבאר ממולאת ב-PBT.הנח חמש בובות על משטח שטוח בין בארותיו של כלי הנתיחה באמצעות סכין מיקרו-דיסקציה. חתוך את קצה הראש ואת הקצה האחורי של הבטן. החזק את הבובה במקומה באמצעות פינצטה עדינה והשתמש במזרק של 1 mL כדי לשטוף החוצה את האיברים הפנימיים של הבובה על ידי הזרקת PBT דרך הפתח הקדמי.שטפו את הגלגל (pupa) המנותח קצרה על ידי טבילה בבאר מלאה ב-PBS והעבירו אותו למקבע קר בתוך מבחנת איבנור (einor tube) הנשמרת על קרח. דגרו את הגלגל למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת.שפכו את המקבע ושטפו את ה-puby עם PBT שלוש פעמים, למשך חמש דקות לכל שטיפה. שמרו את ה-puby השטוף על קרח. מלאו שני בארות של צלחת הניתוח ב-PBT.באמצעות פיפטה מפלטילין. העבירו מספר בובות לאחת מבארות הבאר. לאחר מכן, העבירו בובה אחת בכל פעם לבאר השנייה.באמצעות שני זוגות של פינצטות חדות בעלות קצוות מיושרים לחלוטין, קבעו את הבבואה לתחתית הבאר ולאחר מכן קרעו בעדינות את הקוטיקולה. הסרת קוטיקולת הכנף היא השלב המאתגר ביותר בפרוצדורה זו. אנו תמיד מאבדים חלק מהכנפיים בשלב זה, וזו הסיבה שאנו מתחילים את הפרוצדורה עם מספר גדול יחסית של בבואות.לאחר קריעת הקוטיקולה, קלפו אותה מהכנף. היו זהירים שלא לנתק את הכנף מהבובנאי. לאחר קילוף הקוטיקולה מלהב הכנף, המשיכו לקלף את הקוטיקולה מציר הכנף.לאחר קילוף הקוטיקולה של הכנף, ניתן לנסות לקלף את הקוטיקולה של הרגליים באופן דומה. סביר להניח שחלק מהרגליים יאבדו בתהליך, אך למרות התנובה הנמוכה, שלב זה מומלץ מאוד כיוון שהוא משפר משמעותית את הצביעה של איברי ה-cortone ברגליים. הנח את הגולם במבחנה מסוג einor מלאה במתנול ושמור אותה בטמפרטורת החדר.המשיכו לקלף את הקוטיקולה מכל ה-puy והוסיפו אותם לאותה מבחנה, עד להגעה למספר כולל של לפחות 10 puy שקולפו היטב. עבור כל צביעה, הסירו את המטנול ושטפו שלוש פעמים, חמש דקות בכל פעם, עם 95% ethanol. ניתן לשמור puy מקובעים למשך תקופות זמן ממושכות ב-95% ethanol בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לפני צביעה אימונוהיסטוכימית.כדי להכין את הזחלים להצגה, טפטפו טיפה של חומר קיבוע (mounting media) על תבנית מיקרוסקופ, ואז מקמו את הזחלים כך שהקוטיקולות פונות כלפי מטה ושרירי דופן הגוף פונים כלפי מעלה. טפטפו טיפה קטנה של חומר קיבוע על כיסוי זכוכית נקי והשתמשו בו כדי לכסות את הדגימה ללא הפעלת לחץ על הזחלים המקובעים. כדי להכין את ה-puby.ראשית, הכינו שתי זכוכיתית מיקרוסקופ עם טיפה של מדיום קיבוע, אחת עבור הדיסקציה והשנייה עבור הקיבוע. הניחו מספר גלגולים (pu) על אחת הזכוכיתיות, ולאחר מכן השתמשו במספרי קפיץ כדי להסיר את הראש ואת החלק האחורי של הבטן. לאחר מכן, הפרידו את החצי הגבי של החזה מהחצי הבטני על ידי חיתוך בין הכנפיים לרגליים.הניחו את חלקי הגוף המפוצלים של הגולם בתוך טיפה של מדיום קיבוע. בפריסה השנייה, ודאו שהכנפיים והרגליים פרושות ונסו לצמצם ככל האפשר את חפיפת הרקמות. לבסוף, הניחו טיפה של מדיום קיבוע על לוחית כיסוי והניחו אותה מעל הדגימה ללא הפעלת לחץ מוגבר.מיקרוגרף קונפוקאלי זה של צביעה אימונולוגית של איברי ה-cortone בזחלים בשליש של כוכב מראה סגמנט בטןי מתוח היטב, שבו שבעה משמונת איברי ה-cortone נראים בבירור. ניתן להבחין בחמישה איברים צדיים שמרכיבים יחד את ה-penasco lipid organ, באיבר צדי בודד ובאחד משני איברי ה-cortone הוונטרליים. הנוירונים של איבר ה-cortone מסומנים בעזרת המארקר הנוירונלי, נוגדן מונוקלונלי 22 C 10, ומוצגים בצבע אדום.כיפת הרצועה ותאי ההיצמדות מסומנים באמצעות Antifa tubulin 85 E ומופיעים בכחול. הכיפה ותאי הרצועה מסומנים בנוסף באמצעות corti tonal organ. רפורטר GFP ספציפי הנושא אלמנט רגולטורי עבור הלוקוס Delilah.כאן, איברי ה-chordotonal של הכנף בווריד הרדיאלי הגבתי מוצגים במיקרוגרף קונפוקאלי זה של בובנאי בן 35 שעות. הנוירונים מסומנים באמצעות הסמן הנוירונלי 22 C 10, ומוצגים בצבע אדום ובפאנל B. תאי הרצועה והכיסה מסומנים יחד עם נוגדני Anti-fatubulin 85 E המוצגים בצבע כחול ובפאנל C, כמו גם איבר chordotonal. טרנסגן רפורטר ספציפי של GFP מוצג בצבע ירוק.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לוויזואליזציה של איברי קורטון (campaniform organs) פרופריוצפטיביים הן בזחלה והן בבובנה ב-oph. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי היא עברה אופטימיזציה לשימוש בנוגדנים המתוארים. נוגדנים שונים עשויים לדרוש תנאי קיבוע וצביעה מעט שונים.לפיכך, בעת שימוש בנוהל זה עם נוגדנים שונים, יש למצוא את התנאים האופטימליים עבור הנוגדנים שבשימוש.

visualization-of-proprioceptors-in-drosophila-larvae-and-pupae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הזחלים תסיסנית melanogaster לספק מערכת מודל אידיאלי לחקור את המנגנונים של תחבורה axonal בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. באמצעות הליך זה, 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות ניתן להשוות את הזחלים סוג בר.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

בסרטון הזה, אנו מתארים שיטת הדמיה של תא חי להתחלק סימטרית חושי אבי איברים ותאי אפידרמיס ב...

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

מקור: Jeong, S. הדמיה של דפוס ההקרנה האקסונלי של נוירונים מוטוריים עובריים ב-Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הקרנות אקסונליות בעוברים Drosophila. תיוג חיסוני של נוירונים מוטוריים, דיסקציה מדויקת לחשיפת מבנים עצביים ומיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות חושפים ביחד ארכיטקטורה עצבית מפורטת, תוך שימת דגש על דפוסי ההקרנה האקסונלית.

הדמיה של דפוסי הקרנה אקסונליים של נוירונים מוטוריים עובריים בדרוזופילה

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, קיבעון, ו immunostaining של איברי steroidogenic אצל נשי זחלים בוגרים דרוזופילה ללמוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. בנוסף לאיברים steroidogenic, אנו לדמיין את העצבוב של איברים steroidogenic כמו גם תאי היעד steroidogenic כגון תאי גזע germline.

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשימוש, רב-תכליתי לביצוע חי הדמיה של תהליכים התפתחותיים מורפוגנזה הכללי של גיד השריר בפרט חי הגלמים דרוזופילה .

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את מיקוד עצב עם חלבון נמכרות ברגליים למבוגרים של זבוב החומץ על ידי קיבוע, הרכבה, הדמיה, ההדמיה שלאחר צעדים.

דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים

כאן, מוצג פרוטוקול להדמיה חיה ארוכת טווח של רגל הדרוזופילה בשלב הגולם, הכולל הסרה מלאה של הגולם. ניתן ליישם פרוטוקול זה גם על רקמות אחרות.

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

למד הדמיית איברי מיתר חישה בזחלים וגלמים של Drosophila melanogaster באמצעות חיטוי נוגדנים ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות איברי תחושה בנוירוביולוגיה.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב

גלה סרטונים נוספים