Name: על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: למד את שיטת Isotachophoresis להפרדת יונים וטיהור חומצות גרעין בצ'יפ מיקרופלואידי. טכניקה אלקטרוקינטית זו מאפשרת ריכוז אנליטים ואיתור רגיש במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו בתודה להכיר במימון DARPA פוקוס בחסות מיקרו / ננו יסודות fluidics (MF3) מרכז תחת חוזה מספר N66001-10-1-4003, ומן DARPA מענק N660001-09-C-2082.

<ol><li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li>
<li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li>
<li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotachophoresis%3A+Theory%2C+instrumentation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science & Technology. , (1976).</li>
<li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconcentration%2C+separation%2C+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li>
<li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable%2C+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li>
<li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li>
<li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li>
<li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li>
<li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+extraction%2C+isolation%2C+preconcentration%2C+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li>
<li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li>
<li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li>
<li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li>
<li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I%3A+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li>
<li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+dispersion+in+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li>
<li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l%C3%96sungen+und+l%C3%96sungsgemischen%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li>
<li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li>
<li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li>
<li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

השיטות ITP שהוצג לאפשר זיהוי מהיר, רגיש, ויציב וטיפול מולקולות יוניים. האתגר העיקרי בשימוש ITP היא בחירה נכונה של מאגרים לה טמפ ו TE. ב ITP anionic, אנחנו בדרך כלל לבחור כלוריד כמו אניון מובילה כי היא חומצה חזקה עם הניידות המוחלטת גבוהה מאוד, ולכן יש מאפיינים מאוד לחיזוי. לכן, הבחירה חיץ anionic ITP הוא מופחת בדרך כלל בחירה נכונה TE counterion. עבור ניסויים התמקדות סלקטיבית, בחירה TE הוא קריטי כדי הרחקה של זיהום יונים. ביישומים שבהם מזהמים אינם נוכחים, נמוך ניידות TE יעיל מוביל לשיעור מהיר יותר של התמקדות. אנו ממליצים להשתמש הבאות, יחסית מחונך anionic יונים טה: MES, מגבים, HEPES, tricine. הבחירה של counterion משפיע הן pH מערכת וניידות TE יעיל. Counterions נפוצים הם טריס (pKa 8.1) ו-BIS טריס (pKa 6.4). מבחני הדורשים pH נמוך או גבוה, מומלץ פירידין (pKa 5.25) וethanolamine (pKa 9.5), בהתאמה. בלוחות 1 ו -2, עבור ITP anionic קטיוני, בהתאמה, אנו מסכמים כמה דוגמאות חיץ שימושיים. אנחנו לוקחים HCl כמו יון נתרן LE anionic וכפי קטיוני LE יון, ואנחנו מניחים 100 כוח יונית מ&quot;מ למאגר LE. הקורא יהיה לציין כי יונית מאגר כוח הפרוטוקולים שלנו (וגם לוחות 1-2) תמיד גדול או שווה ל 10 מ&quot;מ. אמנם באופן תיאורטי את הפיסיקה של ITP חל על כוח יונית נמוך 10 מ&quot;מ, מזהמים טבעיים (חומצה פחמתית למשל מתגובה בין מים דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה) ליד רמה 1 mM לעתים קרובות להגביל את השימוש המעשי של מאגרים נמוכים כוח יוניים. נציין, כי מנגנון התמרה האות אינו מוגבל מבחני שהוצגו בפרוטוקול זה. כפי שנאמר בקצרה חלק 5, במצב הרמה מטוהרים אזורי ניתן לאתר באמצעות שינוי המוליכות המקומי, absor UV, טמפרטורה bance, או אינדקס השבירה. בקבוצה שלנו, פיתחנו שיטה אשר מנצל ampholytes הספק ניאון לאיתור זיהוי רגיש של analytes ידוע. 5 בניסויים מצב שיא, בדיקות ספציפיות ניתן לתייג analytes ממוקדים. בדוגמה אחת, אנו משתמשים באלומות מולקולריות - בדיקות oligonucleotide כי לזרוח על ההכלאה רצף היעד שלהם - כדי לזהות DNA היעד או מולקולות רנ&quot;א עם סגוליות גבוהה 11,18. בעוד ITP היא איתנה יחסית פיזור הנגרמת על ידי זרימת הלחץ מונע EOF, EOF מוגזמת עלולה לגרום לקיפאון של ממשק ITP, שם מהירות EOF אומר הופך שווה למהירות ITP. 14 EOF חזקה כזו מתרחשת בעיקר בתנאים של pH גבוה וחוזק יוני נמוך. מסיבה זו, אנו ממליצים על שימוש מאגרים עם pH 8 או נמוך יותר ועם כוח יונית בסדר גודל של 100 מ&quot;מ, אם נוח. מניסיוננו, PVP הואביותר ציפוי יעיל לדיכוי EOF שבבי בורוסיליקט. עם זאת, בגלל המאפיינים שלה סנון, PVP לא יכול להיות מתאים עבור יישומים מסוימים, כגון התמקדות הדנ&quot;א הגנומי. בניסויים, אנו צופים כי התוספת של PVP יכול לצמצם במידה ניכרת את ניידות הדנ&quot;א הגנומי המוחלט (עד כדי כך שהוא לא מתמקד). במקרים אלה ציפוי silanol כגון Sigmacote ב conjuction עם פעילי שטח (למשל טריטון X-100) יכול להיות גם יעיל בהפחתת EOF. 10 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE אניון (pKa -1) </td></tr><tr><td> Counterion חציצה (pKa 1) </td><td> MES (6.10) </td><td> מגבים (7.20) </td><td> HEPES (7.50) </td><td> tricine (8.15) </td></tr><tr><td> ethanolamine (9.50) </td><td> 21.41 </td><td> 20.40 </td><td> 17.38 </td><td> 22.85 </td></tr><tr><td> טריס (8.08) </td><td> 21.00 </td><td> 19.23 &lt;/ Td&gt; <td> 15.84 </td><td> 17.56 </td></tr><tr><td> BIS-טריס (6.40) </td><td> 18.22 </td><td> 10.41 </td><td> 7.30 </td><td> 5.23 </td></tr><tr><td> פירידין (5.18) </td><td> 1.01 </td><td> 3.72 </td><td> 2.42 </td><td> 1.48 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ניידות גודל אפקטיבי (× 10 -9 מ &#39;2 / V / s) של אזור מותאם אנליטי טהור ITP anionic שם LE הוא 100 מ&quot;מ HCl ו 200 חציצה counterion מ&quot;מ. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE קטיון (pKa 1) </td></tr><tr><td> Counterion חציצה (pKa -1) </td><td> ethanolamine (9.50) </td><td> טריס (8.08) </td><td> BIS-טריס (6.40) </td><td> פירידין (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35.57 </td><td> 21.96 </td><td> 16.39 </td><td> 10.45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35.47 </td><td> 20.92 </td><td> 9.76 </td><td> 3.93 </td></tr><tr><td> HEPES (7.50) </td><td> 35.35 </td><td> 19.97 </td><td> 7.77 </td><td> 2.88 </td></tr><tr><td> Tricine (8.15) </td><td> 34.77 </td><td> 16.72 </td><td> 4.50 </td><td> 1.44 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. גודל ניידות אפקטיבית (× 10 -9 מ &#39;2 / V / s) של אזור מותאם אנליטי טהור ITP קטיוני שבו LE הוא 100 מ&quot;מ ו 200 נתרן חציצה counterion מ&quot;מ.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> ריאגנטים </td></tr><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מים מזוקקים </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNase / DNase חינם </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית (HCL) </td><td> EMD כימיקלים </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma הבסיס (טריס) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polyvinylpyrrolidone (PVP) </td><td> Polysciences בע&quot;מ </td><td> 06067 </td><td> MW 1000000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 488 חומצה carboxylic </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> BIS-טריס </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 100 x </td><td></td></tr><tr><td> ליזוזים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR ירוק II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> ethanolamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 6G </td><td> Acros Organics (Geel, בלגיה) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-חומצות אמינו </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> כוח SYBR גרין RNA ל-C T 1-Step קיט </td><td> יישומי Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR primers </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ציוד </td></tr><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שבב בורוסיליקט microfluidic </td><td> Caliper מדעי החיים בע&quot;מ </td><td> NS12A </td><td> מסופק עם או בלי נושא כלים מפלסטיק </td></tr><tr><td> משאבת ואקום </td><td> גאסט </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> Sourcemeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> קבועים שוטפים וקבועים פעולה מצבי מתח </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ epifluorescent הפוכה </td><td> אולימפוס </td><td> IX70 </td><td> השתמש כספית מנורה (אולימפוס) או LED (Thorlabs) לתאורה </td></tr><tr><td> מסנן הקוביה </td><td> אומגה </td><td> XF115-2 </td><td> עירור / פליטה: כחול / ירוק </td></tr><tr><td> בטוח, לנעול צינורות microcentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1.5 מ&quot;ל קיבולת </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> לוח 3. חומרים כימיים ספציפיים וציוד.

על שבב isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

טכניקות Electrokinetic הם מרכיב עיקרי של יישומים microscale בגלל היכולת הייחודית לבצע מגוון של תהליכים fluidic ו electrophoretic ב, מערכות קומפקטיות פשוטות ללא חלקים נעים. Isotachophoresis (ITP) היא טכניקה electrokinetic פשוט מאוד חזקים שיכולים להשיג הפרדה של פי 1,2 מיליון preconcentration ויעיל והפקת המבוסס על ניידות יוניים. 3 לדוגמה, אנו הוכיחו את היישום של ITP להפרדה וזיהוי רגיש ללא תווית מולקולות יוניים (רעלים כגון DNA, rRNA, מירנה) עם מעט או ללא הכנה מדגם 4-8 ו מיצוי וטיהור של חומצות גרעין של מטריצות מורכבות כולל תרבית תאים, שתן ודם. 9-12 ITP משיגה מיקוד ההפרדה באמצעות שדה חשמלי היישומי שני מאגרים במערכת ערוץ fluidic. עבור analytes anionic, מובילה את האלקטרוליט (LE) חיץ נבחר שלuch כי אניונים שלה יש יותר ניידות electrophoretic יעיל יותר אניונים של אלקטרוליט נגרר (TE) חוצץ (ניידות אפקטיבית מתאר את מהירות סחיפה הנצפה של יון ולוקח בחשבון את המדינה יינון של יון, כפי שתואר על ידי Persat ואח&#39; בפירוט . 13). לאחר כינון הממשק בין TE ולה, שדה חשמלי מוחל כך יונים לה טמפ להתרחק מהאזור הכבוש על ידי יוני te. יונים לדוגמה גזע ביניים ניידות יעילה לקראת יוני טה אבל אני לא מצליח לעקוף יונים לה טמפ, ולכן הם מתמקדים בממשק LE-TE (להלן &quot;ממשק ITP&quot;). יתר על כן, TE ואזורים לה טמפ טופס של מוליכות נמוכה בהתאמה גבוהה, אשר להקים שיפוע תלול שדה חשמלי על הממשק ITP. זה שיפוע בתחום preconcentrates מינים המדגם כפי שהן להתמקד. בחירה נכונה של תוצאות טה LE להתמקד וטיהור של מינים שאינם יעד ממוקד מינים אחרים, ובסופו של דבר ההפרדההפרדה ד מינים לדוגמה. אנחנו כאן לסקור ITP עקרונות פיסיקליים בבסיס ולדון בשני מצבים סטנדרטיים של המבצע: &quot;השיא&quot; מצבי &quot;מישור&quot;. במצב שיא, יחסית לדלל יונים מדגם להתמקד יחד בתוך חופפים פסגות צרים על הממשק ITP. במצב הרמה, יונים מדגם שופע יותר להגיע לריכוז המצב היציב ואת לבודד את הרמה, כמו אזורים סמוכים שהוזמנו על ידי ניידות יעילה שלהם. מצבי שיא הרמה נובעים מתוך פיזיקה בסיסית אחת, אלא לייצג משטרים שונים הנבדלות ריכוז אנליטי הראשונית ו / או את משך הזמן המוקצב הצטברות המדגם. אנחנו הראשונים לתאר בפירוט השיא מודל הניסוי מצב ואז להראות assay מצב שיא החילוץ של חומצות גרעין מ - א &#39; תא קולי התרבות. אנו מסיקים על ידי הצגת מצב assay הרמה, שבה אנו משתמשים שאינם מתמקדים נותבים (NFT אזור) מינים לדמיין את ההפרדה ליוצרים quantitation של חומצות אמינו.

Isotachophoresis (ITP) היא הפרדה electrokinetic חזקים בטכניקה preconcentration עם יישומים החל איתור הרעלן הכנת המדגם. אנו בודקים את עקרונות פיסיקליים של ITP ו המתודולוגיה של יישום טכניקה זו שני יישומים דוגמה ספציפית: הפרדה וזיהוי של מולקולות קטנות וטיהור של חומצות גרעין מ lysate תרבית תאים.

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

טכניקות אלקטרוקינטיות הן מרכיב מרכזי ביישומים בקנה מידה מיקרוסקופי בשל יכולתן הייחודית לבצע מגוון של פעולות פלואידיות ואלקטרופורטיות...

המטרה הכללית של סרטון זה היא להציג טכניקה אלקטרוקינטית הנקראת איזוטופורזיס (Isotapheresis), המקוצרת כ-ITP, ואת יישומיה במיקרופלואידיקה לזיהוי והפרדה רגישים של יונים. ראשית, העקרונות הפיזיקליים העומדים בבסיס ה-ITP נדונים, בנוסף לשני מצבי הפעולה הסטנדרטיים, כלומר מצב שיא (peak mode) ומצב מישור (plateau mode). לאחר מכן מוצגת ITP על גבי שבב (on-chip ITP) באמצעות שלושה ניסויים, המתחילים בפרוטוקול פשוט לריכוז מקדים של דגימה, שבו Fluorophores מזוהים על ידי מיקודם בשיא חד. שנית, מוצגת בדיקת ITP המשמשת להכנת דגימה על גבי שבב, שבה DNA ו-RNA מופקים באופן סלקטיבי מליסאט של תאי חיידקים.לבסוף, נעשה שימוש במערך זיהוי ללא סימון (label-free) לטיהור וכימות של חומצות אמינו באמצעות ITP במצב מישורה (plateau mode). בסופו של דבר, ניתן להשיג טיהור של חומצות אמינו, ריכוז מוקדם של אנליטים וסריקה סלקטיבית של חומצות גרעיניות באמצעות ITP. היום נכיר את הפיזיקה הבסיסית ואת המתודולוגיה של טכניקה אלקטרוקינטית ורסטילית הנקראת Isot Apheresis.הקבוצה שלנו הובילה את פיתוח שיטות ITP לזיהוי ללא סימון, להכנת דגימות ולבדיקות היברידיזציה מהירות. נשתף עמכם שלוש בדיקות מייצגות המדגימות את יכולתו של ITP לרכז מראש אנליטים, לחלץ חומצות ליטיות, ולטהר ולזהות חומצות אמינו. בדיקות אלו מדגישות את הרב-גוניות של ITP וממחישות את השלבים הפשוטים הנדרשים כדי להבטיח ניסויים הניתנים לשחזור.במעבדה. בדגימת ITP, יונים מתמרכזים באופן סלקטיבי בממשק שבין אלקטרוליט מוביל לאלקטרוליט עוקב, המסומנים כ-LE ו-TE בהתאמה. יוני הדגימה נעים דרך המיקרו-ערוץ במהירות קבועה הנקבעת על ידי מהירות היונים המובילים.יוני הדגימה מתמקדים אם הניידות האלקטרופורטית האפקטיבית שלהם חסומה בין הניידות של יוני ה-LE לזו של יוני ה-TE, כאשר ניידות מוגדרת כיחס בין מהירות הסחף של היון לשדה החשמלי המקומי. יוני דגימה המעורבבים ב-TE נעים מהר יותר מיוני ה-TE שסביבם ולכן מצטברים בממשק ה-LE-TE. יתרה מכך, ממשק ה-ITP הוא בעל השחזה עצמית; יוני LE, העשויים לדפף אל אזור ה-TE, חווים שטף שחזור חזק וחוזרים לאזור המוביל. הדבר נכון גם לגבי יוני TE באזור ה-LE.תכונות השחזירה העצמית והמיקוד של I two P תורמות לחסנות של טכניקה זו והופכות אותה לבלתי רגישה להפרעות בממשק, כגון זרימה מונעת לחץ. במצב שיא (peak mode), ריכוזי יוני הדגימה נמוכים משמעותית מאלו של יוני LE ו-TE. לפיכך, יוני הדגימה תורמים במידה זניחה למוליכות המקומית תחת תנאים אלו.מיקוד של אנליטים מרובים בתוך אזור הממשק של ה-ITP מתבטא ברוב המקרים בשיאים חופפים. בסופו של דבר, יוני הדגימה עשויים להגיע לריכוז גבוה מספיק כדי להיפרד ולהתמקד במצב פלטו (plateau mode). במצב פלטו, יוני הדגימה נפרדים ומזוקקים לאזורים בעלי ריכוז אחיד וקבוע מקומית, בסדר הנקבע על פי הניידות האלקטרופורטית שלהם.יונים במצב מישור (plateau mode) קובעים את המוליכות המקומית. יונים בריכוז נמוך מאוד עשויים עדיין להתרכז במצב שיא (peak mode) בין אזורי המישור. עבור הבדיקות המוצגות בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בשבב מיקרופלואידי מזכוכית שעברה תכליל רטוב איזוטרופי בעיצוב תעלות מוצלבות.עם זאת, ניתן לבצע ITP גם בערוצים ישרים פשוטים או בנימיות ללא צמתים או חיבורים. יש לבצע את הליך הניקוי הבא לפני הניסויים כדי להבטיח הדירות בין הרצות ויישום מוצלח של ציפויים דינמיים המשמשים לדיכוי זרימה אלקטרו-אוסמוטית. כדי לחטא את הערוץ, מלא את המאגרים הצפוניים, המזרחיים והדרומיים ב-10 עד 20 µL של תמיסת אקונומיקה בריכוז 10%.אם משתמשים במעמד שבב סטנדרטי של Caliper, הצמידו את הקצה הרחב של טיפ פ pipette בנפח 200 microliter למאגר המערבי של השבב וחברו את קו הוואקום לצינור בעל קוטר פנימי של 2 mm. הפעילו ואקום למשך שתי דקות, ולאחר מכן רוקנו את המאגרים ונקו אותם ביסודיות על ידי מילוי המאגרים במים דאיוניים וריקונם באמצעות קו הוואקום. בצעו את שטיפת ה-DI מספר פעמים.חזור על תהליך זה עם נתרן הידרוקסיד בריכוז one molar. פני השכבה של התעלות יעברו תחקור עדין, דבר שייצור פני שטח נקיים של bora silicate כדי לסייע ביצירת תכונות שטח אחידות. נקה את המאגרים עם DI ולאחר מכן שטוף את התעלות עם le.במהלך תקופה זו, תכונות הפנים והציפויים הדינמיים יגיעו לשיווי משקל בתוך התעלות. כדי להתחיל בניסוי, הכינו מיליליטר אחד של אלקטרוליט מוביל ומיליליטר אחד של אלקטרוליט עוקב. לאחר מכן, ערבבו 90 µL של TE עם 10 µL של ריכוז של 1 µM.Alexa Fluor 488. לאחר השטיפה ב-le, רוקנו את מאגר המערב ושטפו את המאגר מספר פעמים ב-di water כדי לדלל באופן משמעותי כל LE שנותר במאגר. לבסוף, מלאו מאגר זה ב-20 µL של TE המכיל צבע.מקם את האלקטרודה החיובית במאגר המזרחי ואת האלקטרודה המארקת או השלילית במאגר המערבי, והפעל זרם קבוע של 2 µA. שיא הדגימה ינדוד במהירות קבועה והמתח בין המאגרים יעלה ככל שתתמלא ה-TE בעלת המוליכות הנמוכה יותר. ניתן לטהר חומצות גרעין מליזאט של תאים לא מטופלים באמצעות ITP על ידי בחירה של אניון גורר בעל ערך ניידות אלקטרופורטית נמוך יותר מהחומצה הגרעינית המטרה, אך גבוה יותר ממעכבי PCR אניוניים.מעכבי PCR טעונים שלילית נעים בכיוון ההפוך ולכן נשארים מאחור. כדי להתחיל, השביה מחדש את משקע תאי ה-e coli המכיל 10⁸ יחידות יוצרות מושבות (colony forming units) ב-80 µL של מים נקיים מ-RNA, והוסף 10 µL של תערובת חומר ליזיס; ערבב בעדינות והדגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, הוסף 10 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 1 M כדי להעלות את ה-pH של הליזט לכ-12.5. הפעל בעדינות את הפ pipette מעלה ומטה עד שהתמיסה הופכת לשקופה, שלב זה מסמן את השלמת הליזיס.בשלב הבא, הוסיפו 10 µL של ליזאט ל-90 µL של 50 mM Racine ו-100 mM bis triss. ניתן להשתמש בתמיסה זו כעת כ-te. הכינו בנוסף 1 mL של LE המכיל צבע SYBR Green כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, והשתמשו ב-LE למילוי השבב המיקרופלואידי כפי שהודגם קודם לכן. לאחר השטיפה, החליפו את התוכן של מאגר המזרח בחומר התואם ל-PCR.שטפו את המאגר המערבי ב-DI ומלאו אותו ב-20 microliters של te. הפילו 1000 volts בין המאגרים המזרחי והמערבי כדי להתחיל את הניסוי. הזרם בין מאגרים אלו יפחת בסוף הניסוי.המדגם נשטף אל תוך מאגר ה-LA יחד עם תמיסה זו. הזרם לעומת הזמן של המערכת מגיע בדרך כלל לערך של מישורה (plateau). ערבב בעדינות את תכולת המאגר על ידי הפעלת הפ pipette למעלה ולמטה מספר פעמים.לאחר מכן, הוציאו נפח של 5 µL לצורך אנליזה באמצעות quantitative R-T-P-C-R-I-T-P, שניתן להשתמש בו גם כדי להפריד ולמקד יונים קטנים במישורים סמוכים וניתנים לזיהוי בין ה-TE ל-LE, מה שמאפשר זיהוי המבוסס על תכונות פיזיקו-כימיות שהוכרחו. להלן בדיקת סמן (tracer assay) ללא מיקוד, שבה מין יוני פלואורסצנטי מתווסף ל-le.המין הפלואורסצנטי אינו מרוכז, אך ריכוזו מסתגל לשדה חשמלי מקומי ובכך מאפשר ויזואליזציה של אזורי פלטו (plateau) מטוהרים. התחילו בהכנת מיליליטר אחד של אלקטרוליט מוביל המכיל Fluor 4 rod Domine 6 G קטיוני ומיליליטר אחד של אלקטרוליט עוקב. לאחר מכן, ערבבו 90 µL של TE עם 10 µL של ארגנין בריכוז 50 mM ו-10 µL של ליזין בריכוז 50 mM כדי להטעין את הדגימה להזרקה סופית.העבר 20 µL של Ellie למאגרים המערבי והצפוני, והעבר את דגימת חומצת האמינו למאגר המזרחי. לאחר מכן, החל ואקום במאגר הדרומי למשך דקה אחת. לאחר שטיפת המאגר המזרחי ב-DI water, החלף את תוכנו ב-te.כשלב סופי, הגשם 500 volts בין המאגרי המזרחי והמערבי בניסויי מצב שיא (peak mode) עם החלבון הזוהר Alexa Fluor 4 88. ניתן לבצע אינטגרציה לעוצמת הפלואורסצנציה הכוללת ולהשוואתה לעקומת כיול כדי לקבל ריכוז כמותי. המידע המוצג כאן הוא של ניסויים על פני טווח של זרמים שהופעלו, החושפים את הדגימה.רוחב השיא נמצא ביחס הפוך לזרם. זוהי דוגמה להפקה של חומצות גרעיניות מליזאט של תאים שלמים באמצעות ITP במצב שיא. שיא ה-ITP של סך חומצות הגרעיניות מקבל לעיתים קרובות צורה שאינה אידיאלית.בניסויי מיצוי חומצות גרעין, הדגימה נשארת להשקיה למאגר ה-LE ונשאבת באמצעות פיפטה לניתוח על ידי תוצאות qPCR של שעתוק הפוך כמותי. ה-PCR מאמת טהרה מוצלחת של RNA ריבוזומלי 16 s ושל DNA ריבוזומלי 16 s מתרבית חיידקים; מחזורי הסף של ביקורת השלילה עבור RNA ריבוזומלי 16 s ו-DNA ריבוזומלי 16 s היו מעל 30 מחזורים עבור כל אחד, כפי שצפוי. ITP במצב Plateau בוצע עבור שתי חומצות אמינו, ארגינין וליזין, תוך שימוש בבדיקת NFT עם RUMINE six G כסמן פלואורסצנטי תת-מהיר.כאן, ניתן להשתמש בעוצמת הפלואורסצנציה ביחס לעוצמת אזורי ה-LE או ה-TE לצורך זיהוי האזורים, בעוד שרוחב האזורים מאפשר כימות. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה פיזיקלית טובה של ITP ושל המתודולוגיה העומדת מאחורי שלוש בדיקות שונות המבוססות על ITP. בפרט, הראינו כיצד להשתמש ב-ITP לטיהור חומצות אמינו, לריכוז מוקדם של אנליטים ולמיצוי סלקטיבי של חומצות גרעיניות.אל תשכחו שעבודה עם מתח גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר. עליכם תמיד לנקוט באמצעי זהירות, כגון שימוש בציוד המגביל את הזרם ושמירה על מרחק מספיק מהאלקטרודות.

on-chip-isotachophoresis-for-separation-ions-purification-nucleic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בראיון זה, ד"ר Klapperich דן תרמופלסטיים ייצור של מכשירים microfluidic ויישומם לפיתוח של כלי אבחון חדשים.

יישומים Microfluidic עבור אבחון פנויה

כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של חילופי אניונים לטיהור S100A12 חלבון קושר סידן אנושי בהתבסס על מטען פני השטח נטו של החלבון מתרבית Escherichia coli.

טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של Anion-Exchange: טכניקת הפרדה לבידוד חלבון מעניין מליזט חיידקי על בסיס מטען נטו

סרטון זה מתאר את טכניקת האלקטרופורזה הקפילרית המיקרופלואידית להפרדת אמפליקונים PCR בהתבסס על גודלם. טכניקה זו מסייעת בגודל השבר באמצעות צבעים פלואורסצנטיים וסמני גודל מולקולריים סטנדרטיים.

אלקטרופורזה נימית מיקרופלואידית לגודל מקטעים של מוצרי PCR: טכניקת הפרדה אלקטרופורטית מבוססת שבב להפרדת מקטעי DNA על בסיס גודל

אנו מציגים מערכת מבוא מדגם אגל דיסקרטית לספקטרומטריית מצמידים אינדוקטיבי פלזמה המונית (ICPMS). הוא מבוסס על שבב microfluidic זול וחד פעמי שיוצר טיפות monodisperse ביותר בטווח גודל של 40-60 מיקרומטר בתדרים בין 90 ל -7,000 הרץ.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

המטרה היא לאנגיופלסטיקה ולבודד אקטיביים מולקולות קטנות, פפטידים מתוך תמצית צמח מורכב, חלבונים של חיידקים פתוגניים על ידי שימוש בשיטת מיקוד בשלב נוזלי (הארה ב) שיטה. יתרה מזאת, המולקולות המופרדות זוהו ופעילותם הביוביולוגית אושרה.

הפרדת מולקולות ביו-אקטיביות קטנות, פפטידים ממקורות טבעיים וחלבונים מחיידקים על ידי שיטת התמקדות איזואלקטריים

טכניקת iChip עושה שימוש במכשיר בידוד זול ופשוט באתרו המגביר את שיעורי גילוי המיקרואורגניזמים החדשים מהאדמה. ניתן להשתמש במיקרואורגניזמים חדשים למחקר נוסף הנוגע למיקרוביום הקרקע או לגילוי מוצרים טבעיים, בין היתר.

בידוד מיקרואורגניזמים בקרקע באמצעות טכנולוגיית iChip

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

"ה-DNA" חיישנים, reagentless, biosensors אלקטרוכימיים כי ביצועים טובים גם כאשר תיגר ישירות בדם מטריצות מורכבות אחרות, הותאמו זיהוי של מגוון רחב של חומצת גרעין חלבון, ו analytes מולקולה קטנה. כאן אנו מציגים הליך כללי עבור ייצור ושימוש של חיישנים כאלה.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

Lensfree טומוגרפיה אופטית היא טכניקה תלת מימדי מיקרוסקופיה המציע רזולוציה מרחבית של &lt;1 מיקרומטר × &lt;1 מיקרומטר × &lt;3 מיקרומטר ב X, Y ו-Z ממדים, בהתאמה, מעל נפח הדמיה גדול של 15-100...

Lensfree על שבב טומוגרפית מיקרוסקופית העסקת רב זווית תאורה פיקסל סופר רזולוציה

למד את שיטת Isotachophoresis להפרדת יונים וטיהור חומצות גרעין בצ'יפ מיקרופלואידי. טכניקה אלקטרוקינטית זו מאפשרת ריכוז אנליטים ואיתור רגיש במעבדה.

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

גלה סרטונים נוספים