רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

אוסף של hemolymph לתקתק נגוע, בלוטות הרוק, ורוק חשוב ללמוד איך לתקתק נישאים פתוגנים לגרום למחלה. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לאסוף את בלוטות הרוק hemolymph ו מ האכלה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף, קרציות, המו, בלוטות רוק לימפה ורוק מהאכלה פעילה של קרציות שכמה לשעבר ODI. זה מושג על ידי כריתה ראשונה של רגל הקרצייה במפרק הדיסטלי כדי להוציא את צליעת ההמו. לאחר מכן, בלוטות הרוק נאספות על ידי ניתוח הקרצייה במי מלח עם פוספט, איתור בלוטות הרוק והעברתן לבריכה נקייה של PBS.

הרוק נאסף על ידי מריחת פילוקרפין על גב הקרציות של המיקרו פיפטה, החדרת חלק הקרצייה לתוך צינור נימי מאוגד ומאפשר לקרצייה לרייר לתוך הצינור. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות מיקרואורגניזמים הנמצאים בבלוטות הלימפה או הרוק באמצעות אימונופלואורסצנציה או חלבון. אינטראקציות חלבון עם חלבוני רוק בין תוצאות אחרות.

בדרך כלל, אנשים חדשים באיסוף לימפה המו יתקשו מכיוון שקשה לשתק את הקרצייה מבלי לקרוע את המעי האמצעי, ובכך לזהם את לימפה ההמו. באופן כללי, אנשים עשויים להיאבק באיסוף רוק מכיוון שלא כל הקרציות יזילו ריר. לכן, חשוב לנסות לאסוף רוק מקרציות שנמצאות במילוי או קרוב למילוי.

בדרך כלל, אנשים חדשים באיסוף בלוטות הרוק יתקשו מכיוון שקשה לאתר את בלוטות הרוק בין שאריות הקרציות. וברגע שהם מאותרים, בלוטות הרוק הללו נקרעות בקלות ואובדות במהלך שלבי הכביסה. לאחר הסרה עדינה של קרציות המאכילים באופן פעיל מבעל חיים, הניחו אותן במי חמצן מקומיים של 3% למשך חמש דקות.

העבירו את הקרציות ל-70% אתנול למשך 10 דקות לפני השטח, עקרו אותן. הסר את הקרציות מאתנול 70% על ידי שפיכתן על נייר מרה בעזרת עט פאפ. ציירו עיגול על מיקרוסקופ מצופה שפוי.

החלק והנח קרצייה בתוך עיגול עט הטפיחה מתחת למיקרוסקופ מנתח. השתמש במלקחיים כדי לדחוף בעדינות כלפי מטה את הגב של הקרצייה. להציג את רגלי הקרצייה ולשתק אותה.

לאחר מכן, בעזרת אזמל חד פעמי דק, קטעו את הרגל או הרגליים של הקרצייה במפרק הדיסטלי. לאחר חיתוך הרגל או הרגליים, המשיכו להפעיל לחץ על הגב של הקרצייה כדי שלימפה ההמה תפריש החוצה מהרגליים. אל השקופית.

הזיזו בעדינות את הקרצייה על המגלשה כדי לפזר את ליפת ההמה כדי להסיר את בלוטות הרוק מנקודת הקרצייה. כמה משיכות של 25 מיקרוליטר של פוספט חצצו מי מלח על מיקרוסקופ. החלק והנח קרצייה לתוך אחת מבריכות ה-PBS מתחת למיקרוסקופ הניתוח.

השתמש במלקחיים עדינים כדי לייצב את הקרצייה על ידי החזקת חלקי הפה או החלק האחורי של הקרצייה. הכניסו את המלקחיים העדינים לחלק האחורי של הקרצייה וחתכו את הגב של הקרצייה כדי לחשוף את האיברים. מצא את זוג בלוטות הרוק הממוקמות דו-צדדיות לצד רגלי הקרצייה.

אם הבלוטות אינן נראות בין פסולת הקרציות, העבירו את החלק העיקרי של הקרציות שעדיין מכיל את הבלוטות למאגר חדש של PBS כדי להפחית את ההפרעה והאובדן של בלוטות הרוק בעזרת מלקחיים עדינים עם קצה עדין. הסר את בלוטות הרוק מהקרצייה והניח אותן בבריכה טרייה של PBS. העבירו את הבלוטות לבריכת PBS נקייה נוספת של 25 מיקרוליטר וחזרו בעדינות על שטיפה זו.

שלב שלוש עד ארבע פעמים נוספות כדי להסיר מיקרואורגניזמים חיצוניים ופסולת קרציות. הניחו את הבלוטות בבריכה נקייה של PBS על מגלשה מצופה שפויה. לאחר הסרת קרצייה כמעט גודשת מפונדקאי בעל חיים, הדביקו אותה לקצה אחד של שקופית מיקרוסקופ זכוכית.

יש למקם את הקלטת כשלושת רבעי הדרך למעלה. הגב של הקרצייה לכיוון הראש, ומשאיר את חלקי הפה של הקרצייה חשופים במקום שבו הסרט פוגש את הקצה הקדמי של פיפטת פני השטח הגביים של הקרצייה, חמישה מיקרוליטרים של תמיסת פילוקרפין. אפשרו לסרט לנדף את הפילוקרפין מעל הגב של הקרצייה מבלי לאפשר לפילוקרפין לבוא במגע עם חלקי הפה של הקרצייה.

הנח חתיכת חימר דוגמנות לא רעיל על המיקרוסקופ. יש להחליק כסנטימטר אחד מחלקי הפה של הקרצייה באמצעות מלקחיים בעלי קצה עדין. נתק את קצה צינור הנימים הנמשך לקוטר הרצוי.

לאחר מכן, תוך כדי צפייה בקרצייה תחת מיקרוסקופ מנתח, הכנס בעדינות את אבן ההיפר של הקרצייה לתוך צינור הנימים, ואפשר למוך הלסת העליונה לשכון לצד החלק החיצוני של צינור הנימים. לחץ את הקצה הנגדי של צינור הנימים לתוך חימר הדוגמנות כדי להחזיק את צינור הנימים במקומו. לאחר מכן, הנח את קרצית הרוק המותקנת בתוך תא חשוך עם לחות גבוהה.

הטה את השקופית כך שאבן ההיפר תצביע לתחתית המיכל, מה שמאפשר לכוח הכבידה לסייע באיסוף הרוק. הניחו את המיכל בטמפרטורת החדר ועקבו מקרוב אחר קרציות הרוק במשך השעה הראשונה. הסר את צינור הנימים מאבן ההיפר של הקרציות ואסוף רוק תוך כדי יצירתו.

שימוש בנורת פיפטה פסטה על ידי הוצאתה מצינורות הנימים. החזירו את צינור הנימים לאבן ההיפר ובדקו את ההצטברות כל שעה למשך ארבע שעות לפחות והמשיכו לאסוף רוק בזמן שהוא נוצר. אם הקרציות אינן רוק או אם נדרש יותר רוק.

לגרום לרוק על ידי שימוש בצינור הנימים כדי לעסות את אבן ההיפר. לבסוף, הוסיפו 0.1 נפחים של קוקטייל מעכב פרוטאז לרוק ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך. איור זה מציג דוגמה ללימפה המו לא מזוהמת.

לאחר כריתת הרגליים, מופרש נוזל צלול. אם המעי האמצעי נקרע, ליפת ההמו נראית עכורה ונחשבת מזוהמת כפי שמוצג כאן. מוצגת כאן תמונה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית של בלוטות רוק מוכתמות עבור Borrelia burgdorferi עם 10 מיקרוגרם למיליליטר.

חיצי ארנב מצומד איזונט פלואורסצנטי אנטיב בורגדורפרי מציינים בברג דרה בבלוטות הרוק. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה כיצד לנתח קרצייה גודשת לבלוטות הרוק ולאסוף לימפה המה. תהיה לך גם הבנה כיצד לאסוף רוק מנקבה בוגרת של exo scapularis.