Name: שימוש ביצים מ Schistosoma mansoni כמו ב-vivo דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: חקור דלקת ריאות ותגובות חיסוניות באמצעות ביצי Schistosoma mansoni בדגם עכברים. שיטה זו מאפשרת ניתוח גרנולומות, אאוזינופיליה והפעלת תאי חיסון בזיהום תולעים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב (NIH) AI091759 ו קרוהן קוליטיס קרן של ויליאם של אמריקה ואת שלבי Modell משפחה פרס קרן מחקר (ל MN). Schistosome נגועים עכברים סופקו על ידי מרכז המשאבים NIAID Schistosome (חוזה NIAID N01 A130026).

1. טיהור Schistosoma mansoni ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק שוויצרי-Webster עכברים עם cercariae schistosome, המהווה את הבמה זיהומיות במחזור החיים Schistosoma 8. לחלופין, לקבל schistosome נגועים עכברים ממשאב NIAID Schistosomiasis מרכז ( <a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/~~V</a> ). השאירו עכברים 6-7 שבועות לאחר ההדבקה, ועד אז נקודות, ביצים נמצאים בכבד ניתן לשחזר כמפורט להלן (ראו איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים עם CO 2, להרטיב עם אתנול 70%. מניחים על גבי העכבר. השתמש מלקחיים קהים ומספריים לחתוך העור הצפק הבסיסית. הכבד בלו, הממוקמת מתחת בית החזה והסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר טחון דק כבדי ולהוסיף 20 מ&quot;ל לכל הכבד של תערובת העיכול, המורכבת collagenase / dispase (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל), פניצילין (100 U / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS. שים mixtיור ב צינור פלקון 50 מ&quot;ל ו דגירה לילה 37 ° C שאכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת התערובת ב 400 דקות XG / 3/20 ° C. בעדינות יוצקים את הנוזל העודף למלא צינורית עם PBS. סרכזת שוב לחזור לשטוף PBS. לאחר צנטריפוגה האחרון, resuspend גלולה ב 25 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את גלולה resuspended דרך המטבח הסטנדרטי מתכתי מסננת (שימוש 50 מ&quot;ל במזרק הבוכנה לכתוש את חתיכות כבד אל תוך כוס זכוכית), ולאחר מכן להעביר את התערובת דרך מסננת דקה (להשתמש במזרק 10 מ&quot;ל לדחוף את התערובת דרך מסננת את הקנס לתוך כוס זכוכית 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים תערובת מתוחה של צינור פלקון 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 400 XG / 5 דקות / 20 ° C. בזהירות לשפוך את supernatant מבלי לאבד גלולה. Resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על שכבת Percoll 20%, 40 מ&quot;ל של צבע 8 מ&quot;ל Percoll ו 32 מ&quot;ל 0.25M סוכרוז (FW = 342.3 אז 8.56 גרם sucrose/100 מ&quot;ל H 2 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת 10 דקות / XG 800/20 ° C. פיפטה אתד לבטל את השכבה העליונה של דביקות בתאי הכבד. הסר ביצה גלולה בתחתית עם טפטפת העברת להכניס צינור פלקון 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף גלולה 3X ב 10 מ&quot;ל PBS / 1 mM EDTA / 1 מ&quot;מ EGTA הגדרות באמצעות צנטריפוגות: 3 דקות / 30 XG / 20 ° C. Resuspend ב 500 PBS μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת תערובת על Percoll 25% חדש, 10 מ&quot;ל שיפוע (2.5 מ&quot;ל Percoll ו -7.5 מ&quot;ל 0.25M סוכרוז) באמצעות הגדרות צנטריפוגות: 10 דק &#39;/ 800 XG / 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3X ב 10 מ&quot;ל PBS באמצעות הגדרות צנטריפוגות: 3 דקות / 30 XG / 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת לשטוף האחרון 10 מ&quot;ל, 100 μL להסיר לספור ביצים. ביצים ליישב במהירות, כך צינור פלקון חייב להיות מעורב גם לפני הוצאת המדגם. לדלל את מדגם 100 μL עם 900 PBS μL. 100 μL של תערובת יש לספור טיפות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ לנתח (01:10 דילול). רחב נשא טיפים פיפטה יש להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ביצים על 50,000 ביצים / מ&quot;ל ​​PBS. ביצים ניתן לאחסן במשך מספר חודשים ב -80 ° C, מופשר פעם או twicדואר לשימוש. לפני השימוש, לבדוק תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי ביצים הם עדיין שלם (ראה איור. 1). </li></ol> 2. רגישות Intraperitoneal עם ס &#39; mansoni ביצים: יום: 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ביצים על 5000 eggs/100 PBS μL בצינור מ&quot;ל 5 snapcap. להזרקה, מעריכים ביצים 50% יותר ממה שנחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט מד 3/4inch 23 ו מזרק 1 מ&quot;ל עם μL 100 ההשעיה ביצה לכל עכבר. ביצים להתיישב, אז המחט עומס עם ביצים בסמוך לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק מזרק הלוך ושוב לערבב ביצים לפני כל הזרקה, ולא להזריק 100 intraperitoneally μL של השעיה לכל עכבר. </li></ol> 3. רטרו מסלולית אתגר תוך ורידי עם ס &#39; mansoni ביצים: יום 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ביצים לעיל על μL eggs/100 5000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בתא מיוחד עם isoflurane (4%), או intraperitoneally עם xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) קטמין (120 מ&quot;ג / ק&quot;ג). עומק anesthesia נקבע על ידי צביטה של ​​שודד דרכים ולהבטיח שום תגובה פיזית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטעינה של מזרק 1 מ&quot;ל ו - 23 מחט מד 3/4inch עם ביצים, להשתמש במלקחיים כדי לכופף את המחט בזווית של 90 ° עם שיפוע כלפי מטה לתוך זווית. להבטיח כי בועות לא נוכחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם העכבר בצד אחד. לחזור בו העור ולכן העין לא לבלוט, וכן להזרים 100 μL לתוך כלי מאחורי גלגל העין ב 45 מעלות זווית לאף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת המחט להפעיל לחץ קל לשלוט בדימום. </li></ol> כל התהליכים האלה חייבת להיעשות בזהירות ועכברים חייב להיות במעקב עד שהם להתאושש מן ההרדמה. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​פנסילבניה בעלי חיים טיפול מוסדי ועדת שימוש (IACUC). 4. קציר הניסוי: 22 יום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים עם CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר רטוב עם אתנול 70%, ואת המקום על הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בוטה forcEPS, לתפוס את הבטן העכבר ולעשות חתך קטן בעור. מוציאים בזהירות את העור עם מספריים ולחשוף את בית החזה ואת הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לפתוח את הצפק. חותכים את אבי העורקים בבטן לשחזר את הדם עם פיפטה פסטר. אחסן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הכבד עד לחשוף את הסרעפת. שימוש במספריים עדינים לחתוך את הסרעפת. בזהירות לחתוך את בית החזה כדי לחשוף את רקמת הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור בלוטות הלימפה parathymic המנקזים ריאות עם מלקחיים עדינים. אלה תחוב תחת כלוב הצלעות, משני צדי התימוס 9. חנות על הקרח בתקשורת סטריליים 1mL (DMEM השלימו עם 10% חום מומת סרום עגלים עוברית, 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, כולם זמינים Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחזר את BAL, ו לנפח את הריאות לניתוח היסטולוגית, אינטובציה intratracheal יש לבצע. לחשוף את קנה הנשימה על ידי העברת בלוטות הרוק בצד, ואת placiמלקחיים עדינים נג תחת קנה הנשימה. שימוש במספריים עדינים, לחתוך חור באמצע קנה הנשימה, והכנס צינור לריאות. לאבטח את צינורות על ידי קשירת חוט כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף PBS-מלא 1 מ&quot;ל במזרק כדי צינורות ו לנפח את הריאות עם 1 מ&quot;ל PBS. בזהירות לאחזר לשטוף BAL עם מזרק. אחסן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS מזרק 1 מ&quot;ל כדי למלא צינורות ו לנפח את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות, ולהדק את החוט כירורגית, כדי למנוע דליפה של PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את רקמת הריאות ומכניסים 50 מ&quot;ל פלקון צינורית עם 5 מ&quot;ל PFA 4%. </li></ol> 5. אופן ההכנה של רקמות ששוחזרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרום: אחסון הבאה על קרח שעות 30 דקות ל 2 עבור לקרישת הדם, סרום הוא התאושש מן הדם על ידי צנטריפוגה (13,000 XG / 10 דקות / 4 ° C). סרום מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש ELISAs ציטוקינים או ס mansoni ביצה אנטיגן ספציפי IgG isotype ELISAs <sup&gt; 6, 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות הלימפה: המתלים תא בודד מוכנים וספירת התאים השתמשו כדי להעריך את עוצמת התגובה החיסונית. כדי לבחון את הקיטוב תא Th2, התאים מחדש מגורה עם ס &#39; mansoni אנטיגן הביצה במשך 72 שעות. מכתים ציטוקינים Intracellar ניתן לבדוק על ידי cytometry הזרימה, supernatants ניתן לשחזר ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס במשך ELISA של ציטוקינים Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BAL: תאים הם pelleted (400 XG / 5 דקות / 4 ° C). נוזל BAL הוא התאושש ומאוחסנים ב -20 ° C לניתוח של ציטוקינים Th2 ידי ELISA. של באל ספירת תאים משמשים readout לדלקת דרכי הנשימה. ההכנות Cytocentrifuge של 10,000-100,000 תאים (500 סל&quot;ד / 5 דקות / 4 ° C), ואחריו מכתים Diffquik תאפשר ספירה של דלקת לחדור 4, 6. לחילופין, תאים של באל ניתן לבדוק על ידי cytometry זרימה 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת הריאה: רקמת הריאה היא storאד בן לילה ב 4 ° C. רקמות קבוע הוא פרפין, מוטבע, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית ו immunofluorescence. </li></ol> 6. נציג תוצאות בפרוטוקול זה פרטים את כל הצעדים הדרושים כדי (א) להכין מטוהרים Schistosoma ביצים mansoni בשימוש עבור vivo (איור 1), (ii) לרגש ולאתגר עכברים עם ביצים אלה (iii) לשחזר איברים לבדיקה של תגובה דלקתית ריאות. זה במודל vivo reproducibly מניע תגובה דלקתית חזקה ריאות Th2. זה מוצג על ידי דלקת דרכי הנשימה ואת eosinophilia כמו דמיינו ידי ספירת תאים של באל ותכשירים cytocentrifuge (איור 2). H &amp; E-מוכתמים סעיפים הריאות ניתן לבדוק את הביצה הנגרמת גרנולומות (איור 3 א), וכן צביעה של חלקים immunofluorescent ריאה מאפשר הדמיה של מקרופאגים מופעל לחילופין ו Th2 ציטוקינים המושרה גנים כגון Resisכמו פח (RELM) מולקולה α (איור 3 ב). אנטיגן ספציפי CD4 בתגובה ציטוקינים Th2 נבדק על ידי ELISAs של IL-5, IL-4 ו IL-13 של אנטיגן, גירוי התאים הצומת parathymic הלימפה (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" /> איור 1 Schistosoma mansoni מודל הביצה הזרקת נציג תמונות של כבדי granulomatous, האופייניים S.mansoni, ביצה הנטל גבוהות, של ביצים S.mansoni מוצגים -.. הגודל הממוצע (L) 120 מיקרומטר ידי (W) 50 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" /> איור 2. ס הזרקת mansoni ביצה מניע דלקת דרכי הנשימה. א מספרים סלולריים של באל (X10 5) מתוך נאיביות (N) או S.mansoni (SM) ביצה הזריק לעכברים. * P &lt;0.05. ב &#39;הכנה Cytocentrifuge של תאים ראש. מק, מקרופגים, איוs, eosinophil; הלימפה, הלימפוציטים. בר, 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" /> איור 3. ויזואליזציה של גרנולומות ריאתי ומקרופגים מופעל לחילופין המקיפים את הביצה S.mansoni. א גרנולומה ריאתי סביב הביצה Sm (שחור חץ) היה דמיינו H &amp; E-מוכתמים סעיפים ריאה. ב &#39;מכתים immunofluorescence עבור RELMα (ירוק), הקולטן מנוז (אדום) DAPI (כחול) מגלה לחילופין מקרופאגים משופעלים (חץ לבן) גרנולומה סביב autofluorescent Sm ביצה (חץ שחור). בר, 50 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" /> איור 4. S.mansoni אנטיגן ספציפי ביצה ציטוקינים בתגובה Th2. ניקוז parathymic קשרי הלימפה תאים בעכברים תמימים (N) או SM ביצים מוזרק היו מגורה עם Sm &lt;/ Em&gt; אנטיגן הביצה במשך 72 שעות, ואחריו ELISA של supernatants של IL-4, IL-5 ו-IL-13. קנה מידה, ng / mL. * P &lt;0.05.

<ol><li>World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+Technical+Report+Series+912%22">WHO Technical Report Series 912</a>. , Geneva. (2002).</li>
<li>Pearce, E. J., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of schistosomiasis.</a> Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).</li>
<li>Sandler, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiles+during+acute+pathogen-induced+pulmonary+inflammation+reveal+divergent+roles+for+Th1+and+th2+responses+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair.</a> J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).</li>
<li>Perrigoue, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-31-IL-31R+interactions+negatively+regulate+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).</li>
<li>Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulomas+in+schistosome+and+mycobacterial+infections%3A+a+model+of+local+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses.</a> Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).</li>
<li>Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophage-derived+RELM-%7Balpha%7D+is+a+negative+regulator+of+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).</li>
<li>Dalton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+schistosome+eggs+and+miracidia+free+of+contaminating+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues.</a> Parasitology. 115, 29-32 (1997).</li>
<li>Lewis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+laboratory+maintenance+of+Schistosoma+mansoni%2C+with+observations+on+three+schistosome%2Fsnail+host+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations.</a> J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).</li>
<li>Tilney, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+in+the+adult+laboratory+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat.</a> J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19(2001).</li>
<li>Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+cells+are+required+for+the+Schistosoma+mansoni+egg-induced+granulomatous+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response.</a> J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li>
<li>Cheever, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+hepatic+fibrosis+and+granuloma+size+among+mouse+strains+infected+with+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

כאן, מודל העסקת Schistosoma ביצים mansoni לגרום לדלקת ריאות מסוג 2 מתואר. התכונות האופייניות של הדגם הזה כוללות את התגובה החיסונית חזקה Th2, דלקת דרכי הנשימה היווצרות גרנולומה ריאתי. מאז פרמטרים אלה נשענים על תגובות מסוג CD4 סלולריים Th2 11, זהו מודל שימושי כדי לחקור את ההשפעות של מחיקות חלבונים ספציפיים או שושלת ספציפית על תגובות התא Th2. כאן readouts תכלול וכימות של אנטיגן ספציפי ציטוקינים Th2, ניתוח של חדירת תא דרכי הנשימה, והגודל של גרנולומות ריאתי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> גודל / תיאור </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> 500 מ&quot;ג </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11 097 113 001 </td></tr><tr><td> הבדל במרכול המה 3 כתמים </td><td> לארוז </td><td> פישר סיינטיפיק ושות LLC </td><td> 122-911 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> נוזל </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> פלקון 50 מ&quot;ל </td><td> לארוז </td><td> בז </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> Intramedic Tubing PE </td><td> 0.58 מ&quot;מ </td><td> בקטון דיקינסון ושות&#39; </td><td> 427410 </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> 250 מ&quot;ל </td><td> אבוט לבריאות בעלי חיים </td><td> 52600405 </td></tr><tr><td> קטמין </td><td> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Fort Dodge, לבריאות בעלי חיים </TD&gt; <td> N / A </td></tr><tr><td> הקולטן נוגדנים מנוז </td><td> ביוטין </td><td> עבד Serotec </td><td> MCA2235B </td></tr><tr><td> מסננת מתכת </td><td> מטבח רגיל מסננת </td><td> יעד </td><td> לורנטיס </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 16% </td><td> אלקטרונים Microsc. מדעי </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> 100x </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 1 ליטר </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 0891 17 01 </td></tr><tr><td> RELMα נוגדן </td><td> 50 מיקרוגרם </td><td> Peprotech </td><td> 500-P214 </td></tr><tr><td> כירורגי נושא </td><td> 2.0 USP 100 yds </td><td> כירורגי Specialties קורפ </td><td> SP118 </td></tr><tr><td> מחט המזרק </td><td> 23g, 3/4 אינץ&#39; </td><td> BD Vacutainer מעבדה. מד. </td><td>305143 </td></tr><tr><td> ארה&quot;ב תקני בדיקה Sieve </td><td> 150 מיקרומטר, 0.0059 &quot; </td><td> WS טיילר, Inc </td><td> ASTME-11, Spec. מס &#39;100 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> שר המשקים </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

שימוש ביצים מ<em&gt; schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

טפילים Schistosoma הם תולעים דם להדביק כ 200 מיליון אנשים ברחבי העולם 1. זיהום כרוני עם Schistosoma, פתולוגיה חמורה, לרבות סיסטיק הכבד splenomegaly, נגרמת על ידי התגובה החיסונית את הביצים טפיל ולא הטפיל עצמו 2. ביצי הטפיל לגרום תגובה Th2 מאופיינת בייצור IL-4, IL-5 ו-IL-13, הפעלה חלופית של מקרופאגים ועל גיוס של אאוזינופילים. כאן אנו מתארים זריקת ביצים Schistosoma mansoni כמודל לבחון טפיל ספציפיים תגובות ציטוקינים Th2 בריאה ובלוטות לימפה וניקוז, היווצרות של גרנולומות ריאתי המקיפים את הביצה, ודלקות בדרכי הנשימה. בעקבות רגישות intraperitoneal ואתגר תוך ורידי, ש &#39; ביצים mansoni מועברים אל הריאות באמצעות עורקי הריאה שם הם כלואים בתוך parenchyma ריאותגרנולומות על ידי המורכבות של לימפוציטים, אאוזינופילים ומקרופגים מופעל לחילופין 3-6. קשורה להיווצרות דלקת, גרנולומה של broncho-מכתשיים מקומות, הרחבת קשרי הלימפה מסוג CD4 ו מרוקנים הפעלת תא T ניתן לצפות. כאן בפירוט את הפרוטוקול לבידוד Schistosoma ביצים mansoni מ כבדי נגועים (שונה מ 7), רגישות ומאתגרת עכברים, לשחזר את אברי (broncho-מכתשיים שטיפה (BAL), ריאות ובלוטות לימפה וניקוז) לניתוח. אנו גם נציג היסטולוגית ונתונים חיסוניות והצעות חיסוניות ניתוח נוסף. באופן כללי, שיטה זו מספקת במודל vivo לחקור helminth המושרה תגובות חיסוניות בריאה, שהוא החלים רחב המחקר של מחלות דלקתיות, כולל דלקת Th2 helminth, מחלות fibrotic, דלקת אלרגית ואסטמה. היתרונות של מודל זה לחקר typה 2 דלקת ריאות כוללים שחזור של תגובה דלקתית חזקה Th2 בריאה ובלוטות לימפה וניקוז, להקל על הערכה של דלקת בבדיקה היסטולוגית של גרנולומות המקיפים את הביצה, והוא חסר יכולת אחסון לטווח ארוך של הטפיל ביצים.

Schistosoma ביצים mansoni הם לגירוי חזק מסוג T helper 2 (Th2) בתגובה החיסונית, מאפיין של דלקת טפיל, אסטמה ודלקת אלרגית. פרוטוקול זה מנצל ס mansoni ביצה הזרקת ליצור CD4 תגובה ציטוקינים Th2-Induced דלקת בריאה, המאופיינת היווצרות גרנולומה ריאות סביב הביצה, eosinophilia והפעלה מקרופאג חלופי.

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

טפילים מסוג Schistosoma הם תולעי דם המדביקים כ-200 מיליון בני אדם ברחבי העולם 1. בזיהום כרוני ב-Schistosoma, המצב החמור...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור דלקת ריאתית ותגובות של תאי מערכת החיסון. מטרה זו מושגת על ידי ניקוי ביצי תולעי מעיים (helminths) מכבדים שנדבקו ב-shta. כשלב שני, עכברים מחסונים ונחשפים לביצים מנוקות, דבר המביא להקמת תגובה דלקתית עוצמתית בריאות.בשלב הבא, מבודלים את הריאות ואת האיברים הלימפואידיים המנקזים מהעכברים כדי להעריך את עוצמת התגובה הדלקתית לקסדה. התוצאות שהתקבלו מראות דלקת ריאות חזקה המושרית על ידי קסדה, המבוססת על גיוס תאים דלקתיים לריאות ותצפית על פתולוגיית ריאות המושרית על ידי הביצים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את הטכניקה הזו יתקשו מעט, שכן נדרשת דיוק וזהירות בנתיחה של הריאות וקשרי הלימפה, כמו גם בהזרקת הביצים.עם זאת, שכלול טכניקה זו הוא מתגמל, שכן היא מאפשרת ויזואליזציה של תגובה דלקתית חזקה בריאות לביצים של ה-helminth. מדגימות של הטכניקה הן קארן וטכנאיים במעבדה של Nyer ו-Greenberg. הניחו עכבר שהורדמו והודבק ב-Schistosoma circ על גבו, ובצעו חתך דרך העור כדי לחשוף את הפריטונאום; הוציאו את הכבד, הממוקם מתחת לכלוב הצלעות ולסרעפת. קצצו את הכבדים לדוגמאות קטנות והוסיפו 20 milliliters לכל כבד של תערובת עיכול, המורכבת מ-collagenase, DNase, base, penicillin ו-streptomycin ב-PBS. העבירו תערובת זו למבחנה מסוג Falcon של 50 milliliter והדגרירו למשך לילה ב-37 degrees Celsius במכשיר ניעור.ביום למחרת. סובבו את התערובת בצנטריפוגה. שפכו את עודפי הנוזלים, מלאו את המבחנה ב-PBS וסובבו שוב בצנטריפוגה; חזרו על שטיפת ה-PBS לאחר הסבוב האחרון בצנטריפוגה.ששעוב את המשקע ב-25 milliliters של PBS. לאחר מכן, סנן את המשקע המששוב דרך מסנן מתכתי, ולאחריו העבר אותו דרך נפה. העבר את התערובת המסוננת למסנורת Falcon בנפח 50 milliliter ובצע סנטריפוגה.שפכו את הנוזל העליון (supernatant) וסננו. השעו את המשקע בשלושה מיליליטר של PBS. הניחו בעדינות את התערובת מעל גרדיאנט של 40 מיליליטר המורכב משמונה מיליליטר של 8% ו-32 מיליליטר של 0.25 molar sucrose; סובבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-800 G בטמפרטורה של 20 °C.בשלב הבא, הסו את השכבה העליונה של תאי הכבד באמצעות פיפט העברה. הוצא את משקע הביצים מהתחתית והעמדו אותו בתוך מבחנה מסוג falcon בנפח 50 milliliter. שטוף את המשקע שלוש פעמים ב-10 milliliters של PBS המכיל EDTA ו-EGTA, ובצע צנטריפוגה.שחזר את המשקע ב-500 µL של PBS. הוסף את התערובת הזו מעל גרדיאנט חדש של 10 mL המכיל 2.5 mL של per call ו-7.5 mL של 0.25 M סוכרוז, וסבב בצנטריפוגה. שטוף את המשקע שלוש פעמים ב-10 mL.PBS וצנטריפוגה. ודאו שתוכן מבחנת הפלקון מעורבב היטב והוציאו 50 µL משטיפה הסופית. כדי לספור את הביצים, דללו את ה-50 µL.ערבב עם 450 µL של PBS והוסף 100 µL מתערובת זו על גבי סמפיסלה על במה של מיקרוסקופ דיסקציה כדי לספור את הטיפות. השהה מחדש את הביצים בריכוז של 50,000 ביצים למשמליטר ב-PBS. ניתן לאחסן את הביצים למשך מספר חודשים בטמפרטורה של -80 °C ולהפשיר אותן פעם אחת או פעמיים לשימוש. לפני השימוש, בדוק את הביצים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהן עדיין שלמות בתוך מבחנה עם מכסה סגור (snap cap) בנפח של 5 mL.הכינו את הביצים בריכוז של 5,000 ביצים ל-100 µL של PBS לצורך ההזרקה. העריכו כ-50% יותר ביצים מהכמות הדרושה. טענו מחט במידה 23 gauge ובאורך 5/8 אינץ' ומזרק של 1 mL עם 100 µL של תרחיף ביצים לכל עכבר.נענעו את המזרק קדימה ואחורה כדי לערבב את הביצים לפני כל הזרקה, והזריקו 100 µL של התרחופה לכל עכבר באופן תוך-פריטוני (intraperitoneal) 14 ימים לאחר הרגישציה. הכינו את הביצים כפי שנעשה קודם לכן בריכוז של 5,000 ביצים ל-100 µL, ומלאו מזרק של 1 ml עם מחט במידה 23 בביצים. השתמשו בפינצטה כדי לכופף את המחט בזווית של 90 מעלות וודאו שאין בועות אוויר.הרדמו את העכבר והניחו אותו על צדו. הזריקו 100 µL של תמיחה לוורידים שמאחורי העין בזווית של 45 מעלות לאף. שמונה ימים לאחר האתגר תוך-ורידי, הפקירו את העכבר ובצעו חתך קטן בעור הבטן.חתכו את הפריטונאום (Kperitoneum) ואתרו את אבי העורקים הבטני. חתכו את אבי העורקים כדי לאסוף דם באמצעות פיפטת פסטור ושמרו אותו על קרח. הסיטו את הכבד כלפי מטה כדי לחשוף את הסרעפת.השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את הסרעפת ובצעו את החיתוך בזהירות. פתחו את כלוב הצלעות כדי לחשוף את רקמת הריאה. קשרי הלימפה פרה-תימיים (para thymic lymph nodes) ממוקמים מתחת לכלוב הצלעות מעל הריאות ובשני צדי התימוס.חלצו את קשרי הלימפה באמצעות פינצטה עדינה ואחסנו אותם על קרח במיליליטר אחד של מצע סטרילי. כדי להתחיל את הליך האינטובציה, הזיזו את בלוטות הרוק הצידה כדי לחשוף את הקנה. מקמו פינצטה עדינה מתחת לקנה והשתמשו במספריים עדינים.חתכו חור במרכז הקנה והחדירו צינורית לתוך הריאות. אבטחו את הצינורית על ידי קשירה בחוט כירורגי. כעת חברו לצינורית מזרק של 1 mL מלא ב-PBS ונפחו את הריאות עם 1 mL של PBS.שאבו בזהירות את שטיפת ה-BAL באמצעות המזרק ואחסנו אותה על קרח. לאחר מכן, חברו למערכת צינורות מזרק בנפח של מיליליטר אחד הממולא ב-4% para formaldehyde ב-PBS ונפחו את הריאות. לאחר מכן, הסירו את הצינור והדקו את החוט הכירורגי כדי למנוע דליפה של ה-PFA.לבסוף, הוציאו בזהירות את רקמת הריאה והניחו אותה בתוך מבחנה מסוג פלקון (Falcon) בנפח 50 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של 4% PFA ב-PBS. לאחר דגירה של 0.5 עד שתי שעות על קרח, סבבו בצנטריפוגה את הדם שנאסף כדי להפריד את שכבת הסרום; ניתן להשתמש בסרום עבור בדיקות ELISA של איזוטייפ IgG ספציפי לאנטיגן של ביצי *S. mansoni*. ניתן להפעיל מחדש קשרי לימפה פראוואליים שהוצאו באמצעות אנטיגן של ביצי *S. mansoni* כדי לנתח ציטוקינים של TH2 הספציפיים לאנטיגן. לאחר סבוב בצנטריפוגה ושקיעת התאים, אספו את נוזל ה-BAL לניתוח ציטוקינים של TH2 באמצעות ELISA. תאי BAL נאספים לצורך הכנת ציטוספין (cytospin).רקמת ריאה שקובעה למשך לילה עבור אנליזה היסטולוגית ואימונופלורסצנטית המוצגת כאן היא תמונות של כבדים גרנולומטוזיים, המאפיינים עומס גבוה של ביצי esman. מוצגות כאן גם ביצי esman. איור זה מייצג דלקת בדרכי הנשימה שנגרמה על ידי הזרקת ביצי essman sooni.הגרף משמאל מראה כי מספר התאים ב-BAL גבוה בהרבה בעכברים שהוזרקו ביצי של s mansoni בהשוואה לעכברים נאיביים. התמונות משמאל הן דגימות מייצגות של cyto centrifuge. ניתן לראות כאן בבירור את ההכנות של תאי BAL ואת החלחול הדלקתי המורכב ממקרופאגים,אוזינופילים ולימפוציטים.גרנולומה ריאתית המקיפה את ביצת ה-esson מוצגת בחתך ריאה שנצבע ב-H and E. תמונה זו מציגה צביעה אימונופלואורסצנטית עבור realm alpha המוצגת בירוק. קולטן ה-mano המוצג באדום וצבע DPI המוצג בכחול, אשר חושפים מקפגוים מופעלים באופן חלופי הנראים באמצעות החץ הלבן.התגובה של ציטוקיני TH2 הספציפיים לאנטיגן ביצי S. mansoni בקשרי הלימפה הפראאיקליים של עכברים נאיביים ועכברים שהוזרקו S. mansoni מוצגת כאן. תאי קשרי לימפה מכל קבוצה עוברו גירוי עם אנטיגן ביצי S. mansoni למשך 72 שעות. לאחר מכן, בוצע מבחן Eliza של העל-נוזל עבור IL-4, IL-5 ו-IL-13.ריכוזיהם של שלושת הציטוקינים הדלקתיים היה גבוה בהרבה בעכברים שהוזרקו esman לאחר התפתחותו. טכניקה זו מספקת דרך קלה לחוקרים בתחומי האלרגיה וזיהומי תולעים לחקור תאי מערכת חיסון המגויסים בתגובה לזיהום בתולעי טפילים ולאלרגיה באורגניזם של מודל עכברים.

using-eggs-from-schistosoma-mansoni-as-an-vivo-model-helminth-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

זיהום Trichuris muris הוא מודל מעיים של חסינות Th2 שבו עכברים עמיד ליצור תגובת Th2 מגן עכברים רגישים ליצור תגובה פתולוגית Th1.

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה ' מחזור החיים polygyrus.

טיפוח<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד axenic בקנה מידה גדול ואוסף של miracidia free-swimming של הלוויתן דם אנושי עלקת הבילהרציה mansoni ועיבוד עוקבות שלהם עבור מבוא לתרבות במבחנה .

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

כאן, סיפקנו שיטה כדי להשיג שינוי יציב של העוף Eimeria טפילים על-ידי נוקלאונופיטים sporozoites או הדור השני merozoites. טפילים מהונדסים גנטית שונה ביטוי הטרוולוגי הגנים ניתן להשתמש ככלי משלוח החיסון.

נוקלאופלוט ובהפצת Vivo של העופות האימריריה טפילים

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

תאי T ו-ILC2 המבטאים IL-9 מושרים במהלך זיהום ב-N. brasiliensis , אך האפיון שלהם התעלם במידה רבה במעי הנגוע בשל התדירות הנמוכה והקינטיקה הדיפרנציאלית שלהם. פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאים אלה מאיברי מטרה שונים ואישור זהותם באמצעות ציטומטריית זרימה בשלבי זיהום שונים.

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis

סטרונגילואידס ראטי היא נמטודה טפילית הגורמת לזיהומים חולפים בעכברי מעבדה, ומציגה שלבי נדידת רקמות וחיי מעיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשמירה על מחזור הטפילים בחולדות והדבקה ניסיונית בעכברים, כולל כימות טפילים בראש, בריאות ובמעי.

זיהום ניסיוני של עכברים בנמטודה הטפילית Strongyloides ratti

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

מחקר זה העריך את הפעילות הביולוגית של תמציות Tithonia diversifolia באמצעות שיטות מבוססות רדיקלים ובדיקת בקיעת ביצים במבחנה (EHA) כדי להעריך את השפעותיהן על נמטודות במערכת העיכול במעלי גירה קטנים. המתודולוגיה והממצאים העיקריים מתוארים, ומדגישים את הפוטנציאל של תמציות אלה להדברת טפילים.

הערכת תכונות נוגדות חמצון ואנטלמינטיות של תמציות Tithonia diversifolia כנגד ביצי נמטודות במערכת העיכול באמצעות מבחני מבחנה

חקור דלקת ריאות ותגובות חיסוניות באמצעות ביצי Schistosoma mansoni בדגם עכברים. שיטה זו מאפשרת ניתוח גרנולומות, אאוזינופיליה והפעלת תאי חיסון בזיהום תולעים.

שימוש ביצים מ

גלה סרטונים נוספים