Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מעקב סטנדרטי בהתנהגות in vivo של תאי גזע המושתלים במוח העכבר. זה מושג על ידי תיוג תאי הסטרומה שמקורם במח העצם, אשר מבטאים במשותף EGFP ולוציפראז עם חלקיקי תחמוצת ברזל בגודל מיקרון פלואורסצנטי. השלב השני הוא להזריק כראוי את ה-BMCs המסומנים MPIO לרקמת המוח של העכבר.

לאחר מכן, ההישרדות והלוקליזציה של שתלי תאים עוקבים באופן לא פולשני באמצעות הדמיית ביולומינסנציה והדמיית תהודה מגנטית. השלב האחרון הוא לאמת את תוצאות ההדמיה in vivo באמצעות ניתוח היסטולוגי לאחר המוות. שיטות אלה יכולות לספק תובנה לגבי התנהגות תאי גזע לאחר השתלה במוח העכבר, אך ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון אורגניזמים מודלים ומחקרים על מחלה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הטיפול בבעלי חיים מכיוון שהזרקות תוך ורידיות ותוך מוחיות קשות לביצוע ומכילות סיכונים מסוימים להישרדות בעלי החיים. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 75 כפול 10 לששת חלקיקי תחמוצת הברזל בגודל מיקרון כחול קרחוני לתרבית תאים הגדלה תת-קונפלואנט. דגרו אותם למשך 16 שעות נוספות כדי לאפשר ספיגת חלקיקים באמצעות אנדוציטוזיס, ואז שטפו את החלקיקים הנותרים.

אפשר לתאים לגדול במשך 24 שעות נוספות כדי להשיג שטף תאים ופיזור הומוגני של G-B-M-P-I-O. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת חזותית את ספיגת החלקיקים על ידי חישוב היחס בין תאים חיוביים של EGFP ותאים חיוביים G-B-M-P-I-O לכמות הכוללת של תאים חיוביים ל-EGFP. לאחר מכן, שטפו את תאי ה-G-B-M-P-I-O, המסומנים פעמיים ב-BMSC luciferase EGFP עם 10 מיליליטר.

PBS מטפל בתאים עם טריפסין EDTA וקוצר אותם לאחר מכן. לאחר מכן יש לשטוף את התאים ולהשעות אותם מחדש בריכוז סופי של 133 כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר ב-PBS. לבסוף, שמור את התאים על קרח עד להשתלה.

בהליך זה, יש להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של תערובת הקטמין ב-80 מיליגרם לק"ג וקסילזין ב-16 מיליגרם לקילוגרם. המתן חמש דקות עד שהעכבר יירדם, ולאחר מכן גלח את ראשו כדי לאפשר מניפולציות סטריליות. לאחר מכן, הניחו את העכבר במסגרת סטריאוטקטית, חטאו את העור באלכוהול.

לאחר מכן, יש למרוח משחה על עיניו כדי למנוע התייבשות. בצע חתך בקרקפת בקו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת על מנת למקד את ההיפוקמפוס. קדחו חור בגולגולת בשני מילימטרים אחוריים ושני מילימטרים לרוחב באמצעות מקדחה דנטלית.

בשלב זה, מערבול את תרחיף התאים לזמן קצר, ואז שואב את תרחיף התאים במזרק. לאחר מכן הורד את מזרק המחט לעומק של 2.5 מילימטרים מתחת לדורה ואפשר איזון לחץ למשך דקה אחת. לאחר דקה, החזר את המחט למצב של שני מילימטרים מתחת לדורה.

לאחר מכן הזרקו שלושה מיקרוליטרים של תרחיף תאים באמצעות משאבת הזרקת מיקרו אוטומטית במהירות של 0.70 מיקרוליטר לדקה. לאחר ההזרקה, המתן חמש דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת של תרחיף התאים המוזרק. לאחר מכן, משוך לאט את המחט.

לאחר מכן, יש לחטא את גבולות העור ואז לתפור את העור. יש להזריק 300 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלורי 0.9% תת עורית על מנת למנוע התייבשות. בסוף, הנח את העכבר מתחת למנורת חימום כדי לאפשר התאוששות מהרדמה לביצוע הדמיה ביולומינסנציה.

הרדמו את העכבר בתערובת של 3% איזו, פלואור וחמצן. לאחר מכן הנח את העכבר בתמונת הפוטון. הפחת את רמת ההרדמה על ידי התאמת איזוף הפלואור ל-1.5%לאחר מכן, הזריק d לוציפר תוך ורידי ב-150 מיליגרם לק"ג משקל גוף.

רכוש תמונה למשך חמש דקות באמצעות תוכנת Photo Vision. לאחר מכן, בצע עיבוד תמונה באמצעות תוכנת הראייה M three וכימת את האות הנצפה באמצעות אזורי עניין קבועים. כדי לבצע הדמיית תהודה מגנטית, יש להרדים את העכבר עם 3% ISO פלואור בתערובת של חמצן ותחמוצת החנקן.

לאחר מכן הנח את העכבר במרסנת של מערכת MR אופקית של 9.4 טסלה. הפחת את רמת ההרדמה על ידי התאמת איזוף הפלואור ל-1%לאחר מכן, מרחו משחה על עיני העכבר כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, השתמש בבדיקה רקטלית כדי לפקח על טמפרטורת הגוף.

לאחר מכן הנח חיישן מתחת לבטן העכבר כדי לנטר את קצב הנשימה. שמרו על קצב נשימה של 110 פלוס מינוס 10 פעמים בדקה, ושמרו על טמפרטורת גוף קבועה בטווח צר של 37 פלוס מינוס 0.5 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הנח את סליל ה- RF המשטח על גבי ראש העכבר.

מקם את העכבר באמצע המגנט. לאחר מכן, פתחו את ParaVision 5.1: קבעו פרמטרים של רצף בהתאם לכתב היד הנלווה. לאחר מכן רכוש קבוצה של 10 תמונות הד ספין עטרה T משוקלל על מנת לקבל מידע אנטומי ספציפי.

NT תמונות הד שיפוע משוקלל של שני כוכבים על מנת לחקור נדידת תאי גזע ברזולוציה רגילה של 70 מיקרומטר בריבוע. בשלב זה, הקריבו את העכבר והסירו את המוח. קבעו את רקמת המוח בטמפרטורת החדר ב-4% פרלדהיד ב-PBS למשך שעתיים.

אחרי שעתיים. ייבשו את רקמת המוח על ידי הצבתה בשיפועים שונים של סוכרוז בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הקפיאו את רקמת המוח באמצעות חנקן נוזלי ואחסנו את הרקמה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לחיתוך כשהיא מוכנה.

חתכו את רקמת המוח למקטעים בעובי 10 מיקרומטר באמצעות קריוסטט. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מסננים את קטעי הקריו הלא מוכתמים לפלואורסצנטיות כחולה מחלקיקי G-B-M-P-I-O ופלואורסצנטיות ירוקה מהתאים המבטאים EGFP. לאחר מכן סנן את קטעי הקריו הלא מוכתמים עבור פלואורסצנטי רקע אדום ירוק מהתאים הדלקתיים.

הליך תיוג MPIO כחול קרחוני המתואר מביא לתיוג יעיל ביותר של תאי BMSC, לוציפראז EGFP, שניתן לאמת בקלות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר מכן, עם השתלת תאי G-B-M-P-I-O, המסומנים BMSC, לוציפראז EGFP במערכת העצבים המרכזית של עכברים, ניתן לעקוב אחר הישרדות השתל התאי על ידי הדמיה ביולומינסנציה in vivo המבוססת על פעילות לוציפראז. בנוסף, ניתן לנטר את הלוקליזציה המדויקת של תאים מושתלים על ידי הדמיית תהודה מגנטית in vivo המבוססת על תכולת הברזל של ה-MPIO הכחול הקרחוני.

לבסוף, ניתוח היסטולוגי מראה את אימות התוצאות המתקבלות על ידי הדמיית ביולומינסנציה והדמיית תהודה מגנטית. הישרדות יציבה אושרה על ידי ביטוי EGFP יציב בזמן לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההדמיה המולקולרית לחקור אירועים תאיים ומולקולריים לאחר השתלת תאי גזע במודלים שונים של בעלי חיים למחלות ניווניות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע הדמיה מולקולרית, יישום הדמיית ביולומינסנציה ותהודה מגנטית, ולאמת כראוי תוצאות in vivo באמצעות הערכה היסטולוגית לאחר המוות.