Name: טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: למד שיטת הפקה מימית-פנולית לטיהור LPS מחיידקים גראם שליליים. השיטה מאפשרת ניתוח באמצעות SDS-PAGE וויזואליזציה ב-Western blot לחקר פתוגנזה חיידקית ותגובות חיסוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות וקרן סיסטיק פיברוזיס.

1. הכנת חיידקים להפקת LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל התרבות לילה 5 מ&quot;ל של מרק לוריא (LB), השלימו עם אנטיביוטיקה במידת הצורך. לגדול בתרבות לילה (12-18 שעות) בעוד כמה רועדות החממה ב 37 מעלות צלזיוס ו -200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את 1:10 עם התרבות LB ולקחת קריאה 600 OD ב ספקטרופוטומטר. בהתבסס על קריאה OD 600, להפוך את ההשעיה 1.5 מ&quot;ל של חיידקים שלך OD של 600 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה החיידקים microcentrifuge על 10,600 X גרם במשך 10 דקות. הסר וזורקים supernatant. גלולה ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס, אם LPS לא הולך להיות מופק באופן מיידי. </li></ol> 2. הפקת LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להכין מאגר 2x SDS. הפוך את הפתרון 50 מ&quot;ל של 4% β-mercaptoethanol (BME), SDS 4% ו גליצרול 20% ב 0.1 M Tris-HCl, pH 6.8. הוספת קמצוץ כחול bromophenol לצבוע את הפתרון. הפוך את המניות SDS-חיץ 1x ידי דילול של 2Xטוק 01:01 ב סטרילית מזוקקים H 2 O. זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן שלוש נפרדות 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל פתרונות של DNase אני, RNase, ו proteinase K ב סטרילית מזוקקים H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend החיידקים pelleted משלב 1.3 ב 200 μl של 1x-SDS המאגר. ודא גלולה הוא resuspended לחלוטין pipetting הפתרון מעלה ומטה באיטיות. אל המערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את החיידקים מושעה באמבט מים במשך 15 דקות. אפשר פתרון להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של שניהם אני DNase פתרונות RNase ערוכים 2.2. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. * שלב זה הוא אופציונלי, יש הבדל מזערי באיכות LPS בין דגימות nuclease שטופלו ולא טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של הפתרון K proteinase ערוכים 2.2. דגירה דגימות ב 59 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. שלב זה יכול להתבצע בין לילה, אם יש אילוצי זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מודעה המדגם,ד 200 μl של קר כקרח טריס רווי פנול (מים רווי פנול ניתן להשתמש כתחליף אם טריס רווי פנול אינו זמין). להבטיח את המכסים על צינורות סגורים בחוזקה, מערבולת כל דגימה של כ 5 עד 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, vortexing מדי פעם. לאחר דוגרים מצננים לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 1 מ&quot;ל של האתר בטמפרטורת החדר diethyl למדגם כל המערבולת במשך 5 עד 10 שניות. הקפידו לבצע אתר ידית במנדף, כפי שהוא הפכפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות מדגמים על 20,600 X גרם במשך 10 דקות. מוציאים בזהירות את דגימות צנטריפוגות ולחלץ את השכבה התחתונה כחולה. יש להקפיד למנוע את השכבה העליונה, ברור. משאירים מאחוריהם כמות קטנה של שכבת כחול עדיף על זיהום בשכבה העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ מחדש את הדגימות על ידי חזרה על שלבים 2.7-2.9. שתי עקירות מספיקים בדרך כלל. אם הדגימות מופיעות מעונן, עקירות יותר עשוי להיות performeד. הוסף 200 μl של חיץ-SDS 2x לכל אחד דגימות שנלקחו לפני הפרדה על ידי-SDS. דוגמאות ניתן להפעיל על 8% -15% SDS-polyacrylamide ג&#39;ל. חמש עד 15 μl של LPS שהוכנו בשיטה זו הוא בדרך כלל מספיק להדמיה. </li></ol> 3. נציג תוצאות דגימות תקליטים שהוכנו לעיל ניתן דמיינו ידי צביעה ישירה לאחר ההפרדה על עמוד SDS באמצעות פרוטוקול סטנדרטי כסף מכתים או LPS זמינים מסחרית ערכת צביעה. לחלופין, LPS המופרדים על ג&#39;ל polyacrylamide ניתן להעביר קרום nitrocellulose ו נתון המערבי immunoblotting באמצעות LPS ספציפי נגד סרה. עבור פרוטוקול זה, השתמשנו Pro-Q אמרלד 300 ג&#39;ל Lipopolysaccharide ערכת הכתם (בדיקות מולקולריות), ועקב אחר הוראות היצרן. שמוצג באיור 1 הוא Pro-Q אמרלד 300 12% צבעונית SDS-polyacrylamide ג&#39;ל. הנתיב מכיל 15 μl של LPS שהוכנו difזנים ולבניית של Burkholderia dolosa מבודד דגימות כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס. LPS שונות שהתקבצו דפוסי הסולם, שיקוף של מספרים שונים O-אנטיגן חוזר יחידות המחוברות הליבה oligosaccharide, ניכרים בשיטה זו, לדוגמה, דגימות במסלול 1 ו 6 יש דפוסי שהתקבצו דומים זה לזה (מסגרת אדומה). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" /> באיור 1. Pro-Q אמרלד 300 LPS מוכתם מבודד Burkholderia dolosa קליניים. LPS של 7 ב &#39; זנים dolosa מ פרוץ בחולי סיסטיק פיברוזיס בודדו כמתואר בפרוטוקול זה. חמש עשרה μl הופרדו על ג&#39;ל SDS-polyacrylamide 12%, ומוכתמים Pro-Q אמרלד 300, לפי הוראות היצרן. LPS הליבה מצוין החץ ולאחר LPS מראה דפוסי שהתקבצו דומים של O-אנטיגן חוזר הם מסגרת אדומה. M = משקל מולקולרי הסמן.

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תיארנו שיטה לטיהור LPS הרחק מרכיבים תאיים אחרים, כולל חומצות גרעין וחלבונים. שיטה זו מספקת באיכות גבוהה LPS כי ניתן להשתמש במספר שיטות הדמיה שונות, כולל צביעה של פחמימות SDS-עמוד ג&#39;לים, כפי שמוצג באיור 1. שיטה זו יכולה לשמש סרוטיפ LPS ממגוון רחב של זנים, תוך שימוש ספציפי נגד סרה, או להציג התייחסות בין מבודד על ידי ראיה ישירה. לדוגמה, הפרויקט האחרון הגנום כולו רצף בשילוב עם אפיון LPS מן התפרצות ב dolosa הובילו לגילוי של פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNP) כי בקורלציה עם נ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DNase אני רקומביננטי, RNase ללא </td><td> רוש </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> רוש </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> דיג </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> טריס רווי פנול </td><td> דיג </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Diethyl Ether </td><td> תומאס מדעי </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q אמרלד 300 ג&#39;ל Lipopolysaccharide הכתם Kit </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

טיהור ויזואליזציה של lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) מהווה מרכיב מרכזי של גראם שליליים הקרומים החיצוניים חיידקים. זוהי מולקולה משולשת המורכבת השומנים, אשר מוטבע קרום חיצוני, ליבה oligosaccharide וחזרה O-אנטיגן יחידות להאריך החוצה מפני השטח של התא 1, 2. LPS הוא מולקולה immunodominant כי חשוב ארסיות ו בפתוגנזה של מיני חיידקים רבים, כולל Pseudomonas aeruginosa, מיני סלמונלה, אשריכיה קולי ו 3-5, וההבדלים בצורת O-אנטיגן הרכב LPS בסיס serotyping של זנים. LPS הוא מעורב מצורף לארח תאים על תחילתו של זיהום ומספק הגנה מפני הרג השלמה בתיווך, זנים חסרי LPS יכול להיות נחלש עבור ארסיות 6-8. מסיבות אלו, חשוב לדמיין LPS, בעיקר קליני מבודד. LPS חזותי שהתקבצו דפוסי הכרה על ידי ספציפיתntibodies יכול להיות כלי שימושי לזיהוי השושלות להתאמץ כדי לאפיין מוטנטים שונים. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים שיטה חמה מימית, פנול עבור בידוד וטיהור של LPS של גראם שליליים תאים חיידקיים. פרוטוקול זה מאפשר מיצוי של LPS הרחק חומצות גרעין וחלבונים שיכול להפריע ויזואליזציה של LPS המתרחשת עם, שיטות קצרות יותר החילוץ פחות אינטנסיבית 9. LPS מוכן בדרך זו יכול להיות מופרדים על ידי נתרן גופרתי dodecyl (SDS), ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד) ומוכתמת ישירות באמצעות פחמימות / גליקופרוטאין כתמים או צביעה רגילה ושיטות כסף. רבים נגד סרה כדי LPS מכיל נוגדנים צולבות להגיב עם חלבונים בממברנה החיצונית או מטרות אנטיגני אחרות שיכולות להפריע תגובתיות שנצפו בעקבות immunoblot המערבי של SDS-PAGE מופרד lysates סלולריים הגולמי. טיפול פרוטאז של lysates תא גולמי בלבד לא תמיד הדרך היעילה של הסרת זורקע שימוש או שיטות הדמיה אחרות. יתר על כן, הטיפול פרוטאז נרחב בניסיון להסיר את הרקע יכול להוביל LPS באיכות ירודה אשר לא נפתרה היטב בכל אחת מהשיטות הנ&quot;ל. מסיבות אלו, אנו מאמינים כי הפרוטוקול הבא, עיבוד Westpahl ו ג&#39;אן 10, הוא אידיאלי להפקת LPS.

אנו מתארים שיטה שונה חמה מימית, פנול החילוץ לטיהור lipopolysaccharide (LPS) של חיידקים גראם שליליים. חילוץ פעם, LPS ניתן לנתח לאחר מכן על ידי SDS-PAGE ו דמיינו ידי צביעה ישירה או immunoblot המערבי.

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

ליפופוליסכריד (LPS) הוא מרכיב עיקרי של ממברנות חיצוניות של חיידקים גרם-שליליים. זהו מולקולה תלת-חלקית המורכבת מליפיד A, אשר הוא...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק LPS מחיידקים גרם-שליליים. הדבר משיג תחילה על ידי גידול של תרבית חיידקים של חמישה מיליליטרים במהלך הלילה במצע מתאים, והתאמה של צפיפות התרבית (optical density) ב-600 ננומטר לערך של 0.5. לאחר מכן, החיידקים משקעים באמצעות מיקרו-צנטריפוגציה והתאים מושעים מחדש בבופר tris המכיל SDS ו-beam או capto ethanol.לאחר מכן, מרתיחים את ליסאטי התאים ומטפלים בהם באמצעות פרוטאז ונוקלאז. לבסוף, מבצעים שתי חילוצים רצופים עם פנול מימי חם ואתר דיאל, תוך הסרה זהירה ושמירה של השכבה המימית הכחולה. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות את הכמות וכן את נוכחותו או היwezigותו של LPS ושל זני חיידקים, כמו גם את אופן אורך שרשרת ה-O antigen, באמצעות הפרדה ב-SDS page ואנליזות western blot עם נוגדנים ספציפיים ל-LPS או צביעה ישירה של הפוליסכרידים בג'ל.היתרון של טכניקה זו בהשוואה לטיפול בפרוטאז של Hitchcock ו-Brown הוא שטכניקה זו מובילה לדגימות LPS טהור שניתן להפרידן בצורה טובה יותר באמצעות SDS page ו-western blotting. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הסינתזה והבקרה של ליפופוליסכריד ב-VIR כמעט בכל חיידק גראם-שלילי, כולל e coli ו-salmonella, כמו גם בפתוגנים של הגנה ביולוגית ופתוגנים מתהווה כגון Ella ו-Acetobacter בהתאמה לצמיחת חיידקים. לצורך מיצוי LPS, הכינו תרבית ללילה של חיידקי גראם-שליליים בחמישה מיליליטר של LB בתוספת אנטיביוטיקה.במידת הצורך, גדלו את התרבית למשך לילה באינקובטור עם ניעור במהירות של 200 RPM ובטמפרטורה של 37 degrees Celsius. השתמשו ב-LB כדי לדלל את התרבית ביחס של 1 ל-10, ולאחר מכן מדדו את הצפיפות האופטית ב-600 nanometers בהתבסס על התוצאה. הכינו תרחיף של 1.5 milliliter של החיידקים עם צפיפות אופטית סופית ב-600 nanometers של 0.5.שקעו את החיידקים במיקרו-צנטריפוגה ב-10,600 ×g למשך 10 דקות. לאחר מכן הסירו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). להפקת LPS הכינו את התמיסות הבאות: תמיסת SDS ריכוז 1X, אתנול עם 4% beta-mercaptoethanol או BME, תמיסת SDS 4%, וגליצרול 20% ב-0.1 M Tris-HCl pH 6.8 עם מעט bromophenol blue, וכן תמיסות בריכוז 10 mg/mL של DNase I, RNase ו-Proteinase K במים מזוקקים סטריליים לצורך ריסספנסיון.כדי להבטיח שמשקע החיידקים יסומסס לחלוטין, יש להוסיף 200 µL של באפר 1X SDS ולערבב על ידי שאיבה ושחרור חוזרים של התמיסה עם פיפט. יש להרתיח באיטיות את החיידקים הסומסמים במקלחית למשך 15 דקות. לאחר מכן, יש להמתין עד שבעמידה בטמפרטורת החדר התמיסה תתקרר במשך 15 דקות.כשלב אופציונלי, הוסיפו 5 µL מכל אחד מתמיסות ה-DNA וה-RNA והדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. הוסיפו 10 µL מתמיסת protease K והדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 59 °C למשך שלוש שעות. הוסיפו לכל דגימה 200 µL של tris, פנול רווי, קרח.סגרו את הפקקים היטב וערבבו כל מבחנה במיקסר (vortex) למשך 5 עד 10 שניות. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 °C למשך 15 דקות. תוך כדי ערבוב במיקסר, קררו אותן מדי פעם לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, תחת מapay, הוסיפו מיליליטר אחד של אתיל אתר בטמפרטורת החדר לכל דגימה וערבלו במכשיר vortex למשך 5 עד 10 שניות. צנטריגו את הדגימות ב-20,600 ×g למשך 10 דקות והוציאו אותן בזהירות מהצנטריפוגה. שלפו את השכבה הכחולה התחתונה מכל דגימה, תוך הימנעות מהשכבה הצלולה העליונה.הוסיפו 200 µL נוספים של tris קר בקרח, פנול רווי, וחזרו על תהליך המיצוי בכל מבחנה. הוסיפו 200 µL של באפר SDS בריכוז 2X. הפרידו 5 עד 15 µL מכל דגימת LPS על ג'לים של פוליאקרילאמיד SDS בריכוז 8% עד 15%.מוצג כאן ג'ל SDS-PAGE בריכוז 12% של דגימות LPS שהוכנו מזנים שונים של bur cold area de losa, שבודדו מדגימות ליחה של חולי סיסטיקורבון. תבניות הפסים השונות משקפות את המספרים השונים של יחידות חוזרות של אנטיגן O המחוברות לאוליגוסכרידים של הליבה. מספר דומה של יחידות חוזרות ניתן לראות בדגימות אחת ושש.זכרו כי עבודה עם פנול דאתיל אתר (phenol dathyl ether) עלולה להיות מסוכנת, ולכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מיגון אישי, כולל חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן, ויש לבצע ניסויים אלו בתוך מנדף במהלך ביצוע הפרוטוקול. חשוב לבצע את האקסטרקציות במהירות כדי למנוע אובדן של הדגימות במהלך העיבוד. לאחר ביצוע פרוטוקול זה, יש להשתמש ב-Western immuno blotting או בשיטות להדמיית הליפופוליסכריד באמצעות silver STR או שיטות אחרות, על מנת להדגים את הקרבה בין הזנים.

purification-visualization-lipopolysaccharide-from-gram-negative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. העשרה של ליפופרוטאינים חיידקיים והכנת ליפופפטידים N-terminal לקביעה מבנית על ידי ספקטרומטריית מסה. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את העשרת הליפופרוטאינים החיידקיים באמצעות חומר ניקוי לא יוני שעובר הפרדת פאזה עם ההתחממות. באמצעות שינויי טמפרטורה רציפים ושלבי צנטריפוגה, ליפופרוטאינים מחולקים באופן סלקטיבי לשלב חומר הניקוי, בעוד שמזהמים שאינם ליפופרוטאין מוסרים. לאחר מכן הליפופרוטאינים המועשרים משקעים, נשטפים ומושעים מחדש ליישומים במורד הזרם.

העשרת ליפופרוטאינים חיידקיים באמצעות הפרדת פאזה של דטרגנט לא יוני

מקור: הו, י. ואחרים. ניתוח אינטראקציות בין אנדוביוטיקה למיקרוביום המעי האנושי באמצעות מערכות תסיסה במבחנה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) להערכת פירוק אקסופוליסכרידים (EPS) על ידי מיקרוביום צואה אנושי. קטעי EPS בסופרנטנטים של תסיסה מופרדים לפי גודל וקוטביות באמצעות TLC, ואז מוצגים כרצועות צבעוניות לאחר צביעה ספציפית לפחמימות.

ביצוע כרומטוגרפיה בשכבה דקה להערכת פירוק אקסופוליסכריד חיידקי

סרטון זה מדגים את ההפרדה מבוססת הכרומטוגרפיה הדקה של חומצות מיקוליות. שיטה זו מפרידה את החומצות המיקוליות השונות – ליפידים ארוכי שרשרת הנמצאים בדופן התא של מיקובקטריה – בהתבסס על הקוטביות שלהם.

הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה של גרסאות חומצה מיקולית: שיטה להפרדת שומנים בדופן התא המיקובקטריאלי על בסיס קוטביות

בידוד ואפיון של תחום שומנים בדם של lipopolysaccharide (LPS) מחיידקי גרם שלילי מספק תובנה מנגנוני תא שטח על בסיס של עמידות לאנטיביוטיקה, הישרדות והכושר בקטריאלי, ואיך כימי שומנים מגוונים מינים מולקולריים דיפרנציאלי לווסת תגובות חיסוניים מולדים מארחות.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

דופן התא החיידקי מורכבת מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המוצלבים על ידי פפטידים. כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים מספקת רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשניים של הרכב פפטידוגליקני. אנו מציגים הליך לבידוד קירות התא (sacculi) והכנתם לאחר מכן לניתוח באמצעות UPLC.

בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים

חומצות שומן פוספוליפידים לספק מידע על המבנה של קהילות חיידקי אדמה. אנו מציגים שיטות חילוץ מתוך דגימות קרקע בתערובת כלורופורם חד פאזיים, חלוקה של שומני חילוץ באמצעות עמודות מיצוי שלב מוצק, methanolysis לייצר אסטרים מתיל חומצות שומן, אשר מנותחים על ידי גז כרומטוגרפיה נימים.

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

העשרת של חיידקי lipoproteins באמצעות שלב ללא יונית חומרים פעילי שטח למחיצות בשיטת מתואר שימוש ישיר במבחני TLR או יישומים אחרים. צעדים נוספים מפורטים להתכונן lipopeptides tryptic N-מסוף אפיון מבניים באמצעות ספקטרומטר מסה.

העשרה של Lipoproteins חיידקי והכנה של N-מסוף Lipopeptides לקביעת מבנה באמצעות ספקטרומטר מסה

חיידקים גראם שליליים מייצרים שתי ממברנות בעלי הפרדה. הקרום החיצוני מחולק מהקרום הפנימי על ידי פריפלמטר ושכבת פטיפדוגליקן. היכולת לבודד את הbilayers כפול של חיידקים אלה היה קריטי להבנת הפיזיולוגיה שלהם פתוגנזה.

הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם שליליים לתוך שברים פנימיים וחיצוניים ממברנה עם כוונונים טכניים עבור בעלי הביטוח העצמי

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

פרוטוקול מוצג כדי לחלץ את התוכן השומנים הכולל של דופן התא של מגוון רחב של mycobacteria. יתר על כן, מיצוי ופרוטוקולים אנליטיים של סוגים שונים של חומצות מיקוליות מוצגים. פרוטוקול כרומטוגרפי בשכבה דקה לניטור תרכובות מיקובקטיות אלה מסופק גם כן.

ניתוח הרכב השומנים של מיקובקטריה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה

גנגליוסידים הם גליקוספינגוליפידים נושאי חומצה סיאלית הנמצאים בשפע במיוחד במוח. טבעם האמפיפתי דורש טכניקות מיצוי וטיהור אורגניות/מימיות כדי להבטיח התאוששות אופטימלית וניתוחים מדויקים. מאמר זה מספק סקירות כלליות של מיצוי גנגליוסיד בקנה מידה אנליטי ומכין, טיהור, וניתוח כרומטוגרפיה שכבה דקה.

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

למד שיטת הפקה מימית-פנולית לטיהור LPS מחיידקים גראם שליליים. השיטה מאפשרת ניתוח באמצעות SDS-PAGE וויזואליזציה ב-Western blot לחקר פתוגנזה חיידקית ותגובות חיסוניות.

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

גלה סרטונים נוספים