טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק LPS מחיידקים גרם-שליליים. הדבר משיג תחילה על ידי גידול של תרבית חיידקים של חמישה מיליליטרים במהלך הלילה במצע מתאים, והתאמה של צפיפות התרבית (optical density) ב-600 ננומטר לערך של 0.5. לאחר מכן, החיידקים משקעים באמצעות מיקרו-צנטריפוגציה והתאים מושעים מחדש בבופר tris המכיל SDS ו-beam או capto ethanol.

לאחר מכן, מרתיחים את ליסאטי התאים ומטפלים בהם באמצעות פרוטאז ונוקלאז. לבסוף, מבצעים שתי חילוצים רצופים עם פנול מימי חם ואתר דיאל, תוך הסרה זהירה ושמירה של השכבה המימית הכחולה. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות את הכמות וכן את נוכחותו או היwezigותו של LPS ושל זני חיידקים, כמו גם את אופן אורך שרשרת ה-O antigen, באמצעות הפרדה ב-SDS page ואנליזות western blot עם נוגדנים ספציפיים ל-LPS או צביעה ישירה של הפוליסכרידים בג'ל.

היתרון של טכניקה זו בהשוואה לטיפול בפרוטאז של Hitchcock ו-Brown הוא שטכניקה זו מובילה לדגימות LPS טהור שניתן להפרידן בצורה טובה יותר באמצעות SDS page ו-western blotting. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הסינתזה והבקרה של ליפופוליסכריד ב-VIR כמעט בכל חיידק גראם-שלילי, כולל e coli ו-salmonella, כמו גם בפתוגנים של הגנה ביולוגית ופתוגנים מתהווה כגון Ella ו-Acetobacter בהתאמה לצמיחת חיידקים. לצורך מיצוי LPS, הכינו תרבית ללילה של חיידקי גראם-שליליים בחמישה מיליליטר של LB בתוספת אנטיביוטיקה.

במידת הצורך, גדלו את התרבית למשך לילה באינקובטור עם ניעור במהירות של 200 RPM ובטמפרטורה של 37 degrees Celsius. השתמשו ב-LB כדי לדלל את התרבית ביחס של 1 ל-10, ולאחר מכן מדדו את הצפיפות האופטית ב-600 nanometers בהתבסס על התוצאה. הכינו תרחיף של 1.5 milliliter של החיידקים עם צפיפות אופטית סופית ב-600 nanometers של 0.5.

שקעו את החיידקים במיקרו-צנטריפוגה ב-10,600 ×g למשך 10 דקות. לאחר מכן הסירו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). להפקת LPS הכינו את התמיסות הבאות: תמיסת SDS ריכוז 1X, אתנול עם 4% beta-mercaptoethanol או BME, תמיסת SDS 4%, וגליצרול 20% ב-0.1 M Tris-HCl pH 6.8 עם מעט bromophenol blue, וכן תמיסות בריכוז 10 mg/mL של DNase I, RNase ו-Proteinase K במים מזוקקים סטריליים לצורך ריסספנסיון.

כדי להבטיח שמשקע החיידקים יסומסס לחלוטין, יש להוסיף 200 µL של באפר 1X SDS ולערבב על ידי שאיבה ושחרור חוזרים של התמיסה עם פיפט. יש להרתיח באיטיות את החיידקים הסומסמים במקלחית למשך 15 דקות. לאחר מכן, יש להמתין עד שבעמידה בטמפרטורת החדר התמיסה תתקרר במשך 15 דקות.

כשלב אופציונלי, הוסיפו 5 µL מכל אחד מתמיסות ה-DNA וה-RNA והדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. הוסיפו 10 µL מתמיסת protease K והדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 59 °C למשך שלוש שעות. הוסיפו לכל דגימה 200 µL של tris, פנול רווי, קרח.

סגרו את הפקקים היטב וערבבו כל מבחנה במיקסר (vortex) למשך 5 עד 10 שניות. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 °C למשך 15 דקות. תוך כדי ערבוב במיקסר, קררו אותן מדי פעם לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, תחת מapay, הוסיפו מיליליטר אחד של אתיל אתר בטמפרטורת החדר לכל דגימה וערבלו במכשיר vortex למשך 5 עד 10 שניות. צנטריגו את הדגימות ב-20,600 ×g למשך 10 דקות והוציאו אותן בזהירות מהצנטריפוגה. שלפו את השכבה הכחולה התחתונה מכל דגימה, תוך הימנעות מהשכבה הצלולה העליונה.

הוסיפו 200 µL נוספים של tris קר בקרח, פנול רווי, וחזרו על תהליך המיצוי בכל מבחנה. הוסיפו 200 µL של באפר SDS בריכוז 2X. הפרידו 5 עד 15 µL מכל דגימת LPS על ג'לים של פוליאקרילאמיד SDS בריכוז 8% עד 15%.

מוצג כאן ג'ל SDS-PAGE בריכוז 12% של דגימות LPS שהוכנו מזנים שונים של bur cold area de losa, שבודדו מדגימות ליחה של חולי סיסטיקורבון. תבניות הפסים השונות משקפות את המספרים השונים של יחידות חוזרות של אנטיגן O המחוברות לאוליגוסכרידים של הליבה. מספר דומה של יחידות חוזרות ניתן לראות בדגימות אחת ושש.

זכרו כי עבודה עם פנול דאתיל אתר (phenol dathyl ether) עלולה להיות מסוכנת, ולכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מיגון אישי, כולל חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן, ויש לבצע ניסויים אלו בתוך מנדף במהלך ביצוע הפרוטוקול. חשוב לבצע את האקסטרקציות במהירות כדי למנוע אובדן של הדגימות במהלך העיבוד. לאחר ביצוע פרוטוקול זה, יש להשתמש ב-Western immuno blotting או בשיטות להדמיית הליפופוליסכריד באמצעות silver STR או שיטות אחרות, על מנת להדגים את הקרבה בין הזנים.