זיהוי ובידוד של תאים מתחלקים לאט בGlioblastoma האנושי באמצעות Carboxy fluorescein Succinimidyl אסתר (CFSE)
29 באפריל 2012
פרוטוקול וידאו זה מדגים את היישום של צבע carboxyfluorescein succinimidyl אסתר הניאון (CFSE) לזיהוי וההפרדה של תת אוכלוסיות שונות של תאים בגליובלסטומה האנושית המבוססות על תדר של חלוקת תא.
פרוטוקול וידאו זה מדגים זיהוי ובידוד של תאים בעלי קצב חלוקה איטי בגלובלסטומה אנושית באמצעות carboxy fluorescein succinimidyl ester, CFSE. תאי גידול של גלובלסטומה גודלים תחילה באמצעות בדיקת neurosphere. לאחר מכן, הספירות שהתקבלו מופרדות לתאים בודדים ונצבעים ב-CFSE.
התאים הטעונים ב-CFSE נזרעים שוב. בתרבית של ספירות נוירונים, הספירות המתקבלות מופרדות לתאים בודדים ומועברות במכשיר לציטומטריית זרימה. תאים המתחלקים באיטיות ובמהירות מזוהים וממוינים על בסיס עוצמת הפלואורסצנציה כפונקציה של חלוקת התאים.
הטרוגניות בתדרים היא מאפיין חיוני בסרטן. הטרוגניות זו תומכת בעמידות הגידול ומהווה מכשול משמעותי בפיתוח טיפול יעיל לחלוטין. לפיכך, קריטי לפתח כלים ובדיקות כדי לחקור ולהבין הטרוגניות זו, המוגדרת מבחינה גנטית, פנוטיפית ותפקודית.
בפרוטוקול וידאו זה, אנו מתארים שיטה המשתמשת ב-flues ו-I-C-F-S-C. טכניקה זו מאפשרת זיהוי והפרדה באמצעות ציטומטריה של זרימה של תתי-אוכלוסיות בודדות בתוך תרבית של תאים המופקים מגליובלסטומה אנושית, בעלי מאפיינים תפקודיים שונים. השתמשנו בטכניקה זו כדי לבודד ולאפיין אוכלוסיית תאי גידול המפגינה קצב חלוקה איטי, תכונה תפקודית שהוכחה כקשורה ליצירת גידולים בסרטני גליומה. תרבית כדורי גידול (Gliomas sphere Culture) מוקמת ומתוחזקת באמצעות בדיקת כדורי עצבים (neuros sphere assay), המתוארת בסרטון נפרד בכתובת המופיעה על המסך.
כאשר ספרואידי הגליומה מגיעים לגודל של 150 עד 200 מיקרון בקוטר, מסירים את המצע המכיל את הספרואידים, מעבירים אותו למבחנת תרבית רקמות סטרילית בגודל מתאים וסובבים בצנטריפוגה במהירות של 800 RPM או 110 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שופכים את הנוזל העליון ומרחפים מחדש את משקע הספרואידים ב-1 ml של trypsin EDTA שחומם מראש, ומדגירים בבניית מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים נפח שווה של מעכבי טריפסין עם שאיבה עדינה למטרה של פירוק הספרואידים לתאים בודדים.
מס suspension התאים עוברת סנטריפוגה שנית. הנוזל העליון (supernatant) מוסר והתאים מושחקים שוב ב-1 ml של מצע בסיסי לתאי גזע עצביים (neural stem cell basal medium). 10 µL של תמיססת התאים הבודדים מעורבבים היטב עם 90 µL של trypan blue ומבוצע ספירת תאים עבור כל מיליון תאים המיועדים לצביעה.
מכינים 1 ml של ריאגנט צביעה על ידי הוספה של 1 µL של צבע CFSE בריכוז 5 mM ל-1 ml של מצע בסיסי לתאי גזע עצביים, כדי להגיע לריכוז צביעה סופי של 5 µM. לאחר מכן, מערבבים את תמיסת הצביעה כראוי. מעבירים את מספר התאים הרצוי למבחנה נפרדת, צנטריפוגים ומסלקים את הנוזל העליון (supernatant).
לאחר מכן מוסיפים את תמיססת הצביעה CFSE למשקע ומערבבים בעדינות עד להגעה להומוגניות, ומדגירים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להפסיק את תהליך הצביעה. מוסיפים חמישה עד עשרה נפחים של מצע בסיסי לתאי גזע עצביים (neuro stem cell basal medium) קרים מאוד (בקרח) לתאים הטעונים ב-CFSE ומערבבים היטב. לאחר מכן סובבים את תרחיף התאים בצנטריפוגה ושופכים את הנוזל העליון (supernatant).
בשלב זה, אמורה להופיע שכבה של תאים בתחתית המבחנה עם גוון ירוק המעיד על הצלחת הצביעה. כדי להסיר עודפי צבע CFSE, מבצעים שתי עד שלוש שטיפות על ידי השהיית המשקע ב-1 mL של מדיום בסיסי לתאי גזע עצביים, סבוב בצנטריפוגה והשלכת הנוזל העליון.
לאחר השטיפה השלישית, התאים מושעים מחדש ב-1 ml של מצע בסיסי לתאי גזע עצביים, ומבוצע ספירת תאים כפי שתואר קודם לכן לצורך זריעת התאים. מצע מלא לתאי גזע עצביים מועשר ב-EGF בריכוז סופי של 20 ng/ml. לאחר מכן, תאים מקבוצות הטעונות והבלתי טעונות ב-CFSE מתווספים למבחנות המתאימות להן כדי להגיע לריכוז סופי של 50,000 תאים ל-ml.
לאחר מכן מערבבים היטב את תרחיפי התאים וזורעים אותם בבקבוקוני תרבית רקמה סטריליים. את הבקבוקונים מסמנים. ניתן לנטר את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לוודא את הצביעה ב-CFSE, ולאחר מכן מניחים אותם באינקובטור לח עם 37°C ו-5%CO2 למשך חמישה עד 10 ימים.
כדי לאמת את צביעת ה-CFSE באמצעות ציטומטריה זרימה, מעבירים 500,000 תאים מקבוצות ביקורת שליליות שטעונות ואינן טעונות ב-CFSE למבחנות fax נפרדות. את הציטומטר הזרימה מכיילים בהתאם להוראות במדריך למשתמש עבור הפרמטרים הרלוונטיים. ראשית, מריצים את תאי הביקורת שאינם טעונים ורושמים את האירועים על בסיס מאפייני פיזור קדמי (forward scatter) ופיזור צדי (side scatter), ולאחר מכן, בגרף היסטוגרמה של תדירות התאים לעומת עוצמת ה-CFSE, מבצעים gating לאוכלוסיית התאים העיקרית כדי לאמת את רמת עוצמת פלואורסצנציית ה-CFSE.
בשלב הבא, התאים הטעונים ב-CFSE נסרקים באמצעות אותם פרמטרים ששימשו עבור תאי הבקרה, כפי שניתן לראות. תאים חיוביים ל-CFSE מראים עוצמת פלואורסצנציה הגבוהה בסדרי גודל מאשר תאי הבקרה. כאשר ספירות הגליומה הגיעו לגודל ממוצע של כ-150 עד 200 microns בקוטר.
מעבירים את הספירות (spheres) ומכינים סספנזיה של תאים בודדים משתי הקבוצות, זו הטעונה ב-CFSE וזו שאינה טעונה, כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, מרחיפים מחדש את התאים בנפח מתאים של 1x PBS סטרילי ומבצעים ספירת תאים כדי להסיק תאים מתים או פגומים. בעת מיון באמצעות ציטומטריית זרימה, מוסיפים propidium iodide בריכוז של 1 µL ל-ml של סספנזיית התאים, כדי לאסוף תאים בעלי קצב חלוקה איטי ותאים בעלי קצב חלוקה מהיר.
בעת המיון, מכינים שתי מבחנות תרבית רקמה סטריליות של 15 ml, כשבכל אחת מהן 1 ml של מצע תרבית מלא לתאי גזע עצביים. לאחר מכן, התאים מונחים על קרח במהלך ההעברה למעבדה לציטומטריה זורמת. ראשית, תרחיף התאים מקבוצת התאים שאינם טעונים מועבר דרך הציטומטר הזורם.
האירועים ממופים על בסיס פיזור קדמי (forward scatter) מול פיזור צדי (side scatter) כדי להוציא תאים מתים או פגומים. התאים ממופים על בסיס פיזור צדי מול תגובתיות ל-PI, ואוכלוסיית תאים חיה בודדת מוגדרת כשער (gated) כאוכלוסייה אחת. לאחר מכן, אוכלוסיית תאים הומוגנית מתוך אוכלוסייה אחת נבחרת על בסיס תכונות פיזור קדמי וצדי ומוגדרת כשער כאוכלוסייה שתיים. אוכלוסייה שתיים ממופה לאחר מכן בהיסטוגרמה על בסיס שכיחות תאים מול עוצמת CFSE בסולם לוגריתמי, תוך שימוש באותם פרמטרים ובאותה אסטרטגיית סינון (gating).
התאים המסומנים ב-CFSE מוערכים באמצעות ציטומטר זרימה ומנותחים. לאחר מכן, 85% התחתונים של התאים מוגדרים (gated) כתאים המתחלקים במהירות, ו-5% העליונים מוגדרים כתאים המתחלקים לאט. אוכלוסיות תאים שונות אלו, המהוות את מוקד העניין, נבחרות וממוינות לתוך מבחנות סטריליות לתרבית רקמות בנפח 15 mil המכילות 1 mil של מצע גידול מלא לתאי גזע עצביים.
יש לכוון את קצב סף המיון כך שלא יעלה על 2,500 אירועים לשנייה. לאחר סיום המיון, את התאים סובבים בצנטריפוגה, שופכים את הנוזל העליון וסוחפים מחדש את המשקע בנפח מתאים של מצע, ולאחר מכן מבצעים ספירת תאים. לאחר מכן, זורעים את התאים מהאוכלוסיות הממוינות השונות בצפיפות של 50,000 תאים ל-ml.
במדיום מלא לתאי גזע עצביים, המועשר ב-20 nanograms per ML של EGF, מדגרירים את התאים למשך חמישה עד 10 ימים לצורך גידול ספירות. זוהי דוגמה לתאים. מיד לאחר הטענה בצבע CFSE, כל התאים מראים פלורסצנציה ירוקה עזה כפי שניתן לראות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.
זוהי תמונה של כדור גליומה מייצג שהופק מתאים הטעונות ב-A-C-F-S-E שישה ימים לאחר הזריעה. שימו לב כי חלק מהתאים עדיין מראים צביעת CFSE בהירה מאוד. זוהי דוגמה להיסטוגרמה של ציטומטריית זרימה המראה כי עוצמת ה-CFSE דועכת עם הזמן.
הצבע הכחול מייצג תאים שנטענו ב-CFSE לאחרונה ומראים עוצמת פלואורסצנציה. זוהי עוצמה הגבוהה בסדרי גודל מתאים שאינם טעונים, המיוצגים בצבע אדום. הצבע הירוק מייצג את עוצמת הפלואורסצנציה שהפחיתה את עוצמתה לאורך תקופה של שישה ימים לאחר הטעינה ב-CFSE, בעקבות חלוקת התאים.
אלו הן ספירות מייצגות שגודלו שבעה ימים לאחר בידוד של אוכלוסיות המתחלקות במהירות ובאיטיות. תדירויות היווצרות הספירות אינן שונות בין שתי הקבוצות, אך התאים השומרים על CFSC גדלים לאט יותר ויוצרים ספירות קטנות יותר בהשוואה לתאים המדללים CFSC. שימוש ב-CFSC כדי לזהות ולבודד תת-אוכלוסייה של תאים על בסיס קצב חלוקת התאים מהווה נקודת מוצא לניסויים המשכיים ולאפיון נוסף.
פרוטוקול זה סיפק דוגמה לזיהוי תאים בעלי קצב חלוקה איטי בתרבית המופקת מגליומה אנושית, אך ניתן להחיל אותו גם על סוגי תאי גידול אחרים או על מערכות שאינן סרטניות. תודה שצפיתם, ואנו מקווים שפרוטוקול זה יסייע למחקרכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול וידאו זה מדגים את הזיהוי והבידוד של תאים בעלי קצב חלוקה איטי בגלובסטומה אנושית באמצעות carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). הפרוטוקול מפרט את התהליך של גידול תאי גידול גלובסטומה, פירוק תאי הגלובסטומה לתאים בודדים, ושימוש בציטומטריה של זרימה כדי למיין תאים על בסיס קצבי החלוקה שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אונקולוגיה
רקע
- גליובלסטומה היא גידול מוחי אגרסיבי מאוד.
- הבנת קצבי חלוקת התאים יכולה להנחות אסטרטגיות טיפוליות.
- CFSE הוא צבע פלואורסצנטי המשמש למעקב אחר חלוקת תאים.
- ציטומטריה של זרימה מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות תאים על בסיס פלואורסצנציה.
מטרת המחקר
- לזיהוי תתי-אוכלוסיות שונות של תאי גליובלסטומה.
- להפרדה בין תאים בעלי קצב חלוקה איטי ומהיר לצורך ניתוחים נוספים.
- לשיפור ההבנה של הביולוגיה של הגידול ותגובות לטיפול.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת נוירוספירות (Neurosphere assay) לגידול תאי גליובלסטומה.
- פירוק של ספירות לתאים בודדים.
- צביעת תאים ב-CFSE.
- ציטומטריית זרימה למיון על בסיס עוצמת פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאי גליובלסטומה בעלי קצב חלוקה איטי ומהיר.
- מיון תאים יעיל באמצעות ציטומטריית זרימה על בסיס פלואורסצנציית CFSE.
- השגת תובנות לגבי דינמיקת החלוקה של תאי גליובלסטומה.
- השלכות פוטנציאליות עבור טיפולים ממוקדים בגליובלסטומה.
מסקנות
- CFSE הוא כלי בעל ערך לחקר חלוקת תאים בגליובלסטומה.
- הבנת אוכלוסיות התאים יכולה לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את ההשלכות של ממצאים אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
זיהוי תתי-אוכלוסיות בעלות קצב חלוקה איטי בגלעומה (glioblastoma) נותן מענה להטרוגניות של הגידול, המהווה מחסום מרכזי ליעילות טיפולית. גישה זו מאפשרת הפחתת סיכונים פונקציונלית של פנוטיפים דמויי תאי גזע סרטניים על ידי קישור קצב החלוקה לפוטנציאל ליצירת גידול. השיטה תומכת בביטחון ניבוי באימות מטרות על ידי בידוד תאים המוגדרים פנוטיפית למחקרים מכניסטיים וטיפוליים בהמשך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד תאים בעלי מחזור חלוקה איטי המועשרים בפעילות של תאי גזע סרטניים.
- ערך תפעולי: מספק בדיקה פנוטיפית הניתנת לשחזור לצורך תיקוף תפקודי של מטרות המבוסס על קינטיקת חלוקה.
- ערך אסטרטגי: תומך בביטחון חיזוי ובמיון פורטפוליו על ידי הפחתת סיכונים של מטרות הקשורות ליכולת להיווצרות גידולים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות הפרופורציונליות להיסטוריית החלוקה, מה שמאפשר רזולוציה מדויקת של תתי-אוכלוסיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של קריאות הבדיקה באמצעות קינטיקת דילול של CFSE, התומכת בתהליכי סריקה הניתנים להרחבה ולשחזור.
- ערך אסטרטגי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף להערכת תרכובות על ידי הגדרת קהליות המחולקים לפי קצב החלוקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רציפות תרגומית משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים על ידי שימור פנוטיפים פונקציונליים הקשורים ליכולת היווצרות גידולים (tumorigenicity).
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאמות סיכונים באמצעות בידוד של תת-אוכלוסיות רלוונטיות מבחינה מכניסטית.
- ערך אסטרטגי: תומך בתיאום של ביומארקרים על ידי קורלציה בין שימור CFSE לבין תכונות גזעיות (stemness) פונקציונליות במערכות הרלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים כדי לאפשר בידוד מונחה-השערה של תתי-אוכלוסיות פונקציונליות לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead identification) ותיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהסרה של סיכונים מכניסטיים על ידי קישור חלוקה איטית ליכולת התחלה של גידול במודלים של גליובלסטומה.
- סריקה: מספק אוכלוסיות תאים בעלות רזולוציה כמותית ומוכנות לבדיקה, המבוססות על היסטוריית החלוקה, לצורך סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קריאות כמותיות המבוססות על ציטומטריה של זרימה של עוצמת פלואורסצנציה להשוואת קצבי חלוקה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי בידוד תאים בעלי פוטנציאל מוכח ליצירת ספירות וליצירת גידולים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור סטרטיפיקציה פנוטיפית בין סוגי גידולים ובבדיקות תפקודיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד של תאים בעלי מחזור איטי, המוגדרים פנוטיפית, עם תכונות דמויות תאי גזע.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה וחזרתיות באמצעות קינטיקת חצייה עקבית של CFSE וסינון (gating) בציטומטריה של זרימה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך/עצירה (go/no-go) על ידי כך שמאפשר תיקוף פונקציונלי מוקדם של יעדים הקשורים לעמידות של הגידול.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכונים על ידי העשרה של תאים בעלי רלוונטיות טיפולית גבוהה יותר בגל时候בלסטומה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות נוירוספירות, זרימה ציטומטרית (flow cytometry) וטיפול בצבעים פלואורסצנטיים.
- תלוי בגישה לצייטומטרים בעלי גילוי פלואורסצנציה לוגריתמי ויכולות מיון תאים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי צביעה ואסטרטגיות gating בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה עבור יעילויות שונות של דיסוציאציה של גידולים ורקעי אוטופלואורסצנציה.
- מגבלות מעשיות כוללות רעילות של הצבע בריכוזים גבוהים ודילול האות מעבר ל-8–10 חלוקות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:02
Title
1:43
Preparing Glioblastoma Single Cell Suspension
0:44
Introduction
3:06
Staining with Cell Trace Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Green Fluorescent Dye
5:37
Flow Cytometry Analysis of CFSE Stained Glioblastoma Cells
6:44
Isolation of the Slow-dividing Cell Population using Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)
10:02
Representative Results
11:12
Conclusion
