Solubilization ביו נטיה של נקודות קוונטיות ועל מבחני רעילות של חיידקים עקומת צמיחה הרוזן פלייט

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע סריקה בתוספת של תפוקה גבוהה (high throughput screening) להשפעות אנטי-בקטריאליות של ננו-חלקיקים, עם או ללא הצמדה לאנטיביוטיקה. כאן, נבדקות ההשפעות האנטי-בקטריאליות של נקודות קוונטיות של cadmium Telluride המצומדות ל-poly mix ו-B כדי להשיג מטרה זו. תחילה, הנקודות הקוונטיות מומסות ב-me, capto proprionic acid.

בשלב הבא, נקודות הקוונטום מצומדות ל-poly mix ו-B, ולאחר מכן חיידקים שנספחו עם אנטיביוטיקה מטופלים הן בנקודות קוונטום מצומדות לאנטיביוטיקה והן בנקודות קוונטום שאינן מצומדות. מחצית מהדגימות נחשפו לקרינה של אור כחול באורך גל של 440 nanometer למשך 30 דקות, הגורמת לנקודות הקוונטום לייצר אקסיטונים ומיני חמצן רב-פעילים, וזאת כדי להעריך את השפעת הטיפולים בנקודות קוונטום על הצמיחה וההישרדות של החיידקים. נלקחו קריאות של צפיפות אופטית ובוצעו ספירות מושבות. הנתונים שהתקבלו מעידים כי יישום של נקודות קוונטום של כדמיום טלוריד המצומדות לאנטיביוטיקה, ולאחריו קרינה, מניב את ההשפעות הקטליות החזקות ביותר מבין התנאים שנבדקו.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעה של נקודות קוונטיות של קדמיום טלוריד וההצמדה שלהן ל-polyx in B על גדילת E coli, ניתן להחילה אותה גם על סוגים אחרים של ננוחלקיקים ואנטיביוטיקה במגוון זני חיידקים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה, כיוון שכל עודף של MPA יגרום לאגרגציה של הנקודות הקוונטיות, ואם ינשוף החוצה אפילו כמות קטנה של toline, הדבר יהרוס את המסנן.

אף על פי שהיום נדגים שיטה להערכת ההשפעות האנטי-בקטריאליות של נקודות קוואנטום KE IDE המשובצות באנטיביוטיקה, ניתן להשתמש בשיטה דומה עם סוגים אחרים של נקודות קוואנטום, כגון אינדיום פוספט, אבץ סולפט וקדמיום יודה אבץ סולפט. התחילו את הפרוצדורה בהכנת תמיסה של נקודות קוואנטום של קדמיום טלוריד או CDTE בטולואן בריכוז 15 µM בתוך מבחנה מזכוכית; מדדו את הצפיפות האופטית או ה-OD באמצעות ספקטרוסקופיית ספיגה, והעבירו בעזרת פיפט 200 µL מתמיסת המקור הזו למבחנה מזכוכית.

אין להשתמש בפלסטיק. לאחר מכן, הוסיפו 800 µL של toluene, 1 mL של borate buffer בריכוז 200 mM, ו-2 µL של MER capto proprionic acid או MPA בריכוז 11.5 M; סגרו את הבקבוקון ונערה אותו בעוצמה במשך 30 עד 60 שניות. לאחר הניעור, הפאזות המימיות והאורגניות יופרדו באופן ספונטני.

הפאזה המימית תהפוך לצבע של נקודות הקוונטום. כדי להימנע משכבת הריצוף, הסירו אותה, ולאחר מכן הסירו את פאזת נקודות הקוונטום והעבירו אותה למבחנה נקייה. כדי לטהר את נקודות הקוונטום המומסות, העבירו אותן למסנן צנטריפוגה של 500 microliter.

הוסיפו 100 µL של באפר Borate בריכוז 50 mM וסובבו ב-3000 ×g למשך 13 דקות. חזרו על שטיפה זו ארבע פעמים. לאחר השטיפה האחרונה, השעו את הנקודות הקוונטיות השטופות ב-500 µL של באפר Borate, ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C.

הם יהיו יציבים למשך שבוע עד שבועיים. כדי להעריך את ריכוז הנקודות הקוונטיות, מדדו את ספקטרום הבליעה והפליטה. איור זה מציג נקודות קוונטיות של CDTE תחת תאורה של מנורת UV וספקטרום פליטה לפני ואחרי הפיכתן למסיסות במים, דבר המראה שינוי זניח בתכונות האופטיות כתוצאה מהחלפת הליגנדים.

חלק זה של הפרוטוקול רלוונטי לכל ננו-חלקיק שלרוליזד במים בעל מטען שלילי, כולל moss, נקודות קוונטיות מסחריות, חלקיקי מתכת ועוד. בדוגמה זו, האנטיביוטיקה poly mixen B או PMB תחובר לנקודות הקוונטיות ביחס מולרי של 30 ל-1. PMB טעון חיובית ומסדר את עצמו באופן עצמוני ללא צורך בצימוד. ריאגנטים: המיס PMB ומים.

בריכוז של 60 µM. עבור פלטה של 96 בארות עם 0.3 mL חיידקים לכל בארה ברפליקות של ארבעה (quad duplicates). 0.5 mL של צימוד בריכוז 200 nM מספיקים להכנת התמיסה, על ידי הוספת 100 µL של נקודות קוונטום בריכוז 1 µM בבופר בורת 50 mM לפרוטובקת מיקרו-צנטריפוגה.

לאחר מכן, הוסף 50 µL של תמיסת האנטיביוטיקה PMB בריכוז 10 x או 60 µM במים למבחנת הצמידה. הוסף 50 µL מים למבחנת הביקורת. השלם את הנפח ל-0.5 mL באמצעות באפר ate בריכוז 50 mM. מגן על המבחנות מהאור בעזרת נייר אלומיניום והנח אותן על רוטטור למשך שעה אחת.

אם התרחשה אגרגציה, חזרו על התהליך של הצמדה (conjugation) עם ריכוזים נמוכים יותר של האנטיביוטיקה. בצעו טיטרציה של הריכוז כלפי מעלה עד שהחלקיקים אינם עוברים אגרגציה, לצורך שטיפת התכונות המוצמדות. שפכו את התמיסות דרך מסנן עם סף חיתוך של 10,000 למשקל מולקולרי, המתאים לרוב האנטיביוטיקות אך לא לחלבונים או לנוגדנים.

לבסוף, העריכו את מספר מולקולות האנטיביוטיקה לכל קוונטום באמצעות ספקטרוסקופיית בליעה או פלואורסצנציה, ג'ל אלקטרופורזה או ספקטרוסקופיית פוריאר-אינפרא-רד. איור זה מציג את ספקטרי הבליעה והפליטה הטיפוסיים של נקודות הקוונטום לפני הצמדת PMB, ואת הפליטה לאחר הוספת 160 מולר של שווי ערך של PMB.

כאן מוצג הקשר בין היחס של PMB לבין עוצמת הפליטה של הנקודה הקוונטית, המסומנת על ידי הריבועים, ומיקום שיאו של אורך הגל, המסומן על ידי המשולשים. ככל שריכוז ה-PMB עולה, עוצמת הפליטה של ה-QD פוחתת, מה שגורם להסטה של אורך גל שיא הפליטה. את החלק הבא של הפרוטוקול מבצעים כדי לקבוע את ריכוז העיכוב החציוני, או IC 50, של האנטיביוטיקה ואת הרעילות הקוונטית בערב, יומיים לפני ניסוי הצמימוד.

בצע זריעה של 10 milliliters של מצע LB מקולוניה רעננה של e coli. למחרת, שעה עד שעתיים לפני הניסוי, מלא את כל הבארות של פלטת 96 בארות שקופה. בעזרת מצע גידול, יש לסדר את פלטת הבדיקה כפי שמוצג כאן.

יש להעביר את הדגימות לצלחות בשלוש חזרות, וריכוזי האנטיביוטיקה צריכים להקיף טווח רחב מספיק כך שיכלול ריכוז אחד שמעכב את החיידקים באופן מינימלי וריכוז אחד שהורג את כולם. יש לכלול גם בשלוש חזרות את כל הבארות המכילות נקודות קוונטיות בריכוזים שבהם ייעשה שימוש בניסויי הצמידות. באמצעות פיפט רב-ערוצי, יש למלא את הבארות המתאימות ב-1 עד 50 microliters של תרבית חיידקים.

הריכוז יהיה תלוי בקצב הגדילה של הזן הספציפי ויצריך כיול בהתאם. כדי לנטר את הגדילה, הניחו את הפלטה בקורא פלטות והגדירו קריאה כל 10 דקות למשך שעתיים באורך גל של 600 nanometers. כאשר כל התאים יגיעו ל-OD של 0.1 עד 0.15, הוציאו את הפלטה מקורא הפלטות והפסיקו את ההקלטה.

בשלב הבא, הוסיפו את ה-PMB בנקודות קוונטיות לבארים המתאימות ובשלוש חזרות, וכסו מחצית מהפלטה בנייר אלומיניום. לאחר מכן, הניחו את הפלטה תחת מנורה מותאמת של 440 nanometer המורכבת מ-LEDs של 2.4 milliwatt למשך 30 דקות כדי לחשוף את הצד המואר של הפלטה. לאחר החשיפה לאור, הכניסו את הפלטה לקורא הפלטות ורשמו OD 600 בכל 10 דקות למשך חמש עד 12 שעות, בהתאם לקצב הגדילה. שמרו על טמפרטורה נמוכה מ-32 degrees Celsius במידת האפשר כדי למנוע התייבשות של התרביות באמצעות התוכנה.

שרטטו את עקומות הגדילה בנקודת זמן נבחרת מול לוגריתם הריכוז, וקבעו את ה-IC 50 של האנטיביוטיקה באמצעות משוואת היל (Hill equation) המופיעה על המסך, כאשר H הוא מקדם היל. Y max היא נקודת הגדילה הגבוהה ביותר ו-Y min היא נקודת אפס, באופן אידיאלי גם היא על רמה (plateau). בסוף תקופת ההקלטה, בארות שקופות יעידו על מוות תאי מלא, ומדרג של צפיפות תאים אמור להופיע לאורך ריכוזי התרופה העולים.

על החיידקים להראות עקומות גדילה בצורת S כפי שמוצג כאן. מיקומו של שיאו של מישור הגדילה (plateau) ישתנה מאוד בין זן לזן ותלוי גם בטמפרטורה. ניתן לבחור נקודת זמן נתונה כנקודה מייצגת ולשרטט את הערכים מול log של האנטיביוטיקה כדי לקבל את ה-IC 50 להערכת הנקודות הקוונטיות.

ניתן גם להשרטט את השרידות מול הלוגריתם של ריכוז הנקודות הקוונטיות, אך השגת הרג bacterial משמעותי באמצעות נקודות קוונטיות לבדן בריכוז המשמש בניסוי היא נדירה. לאחר שנקבעה הרעילות של הנקודות הקוונטיות והאנטיביוטיקה לבדן, ניתן להחיל את אותו הפרוטוקול כדי לקבוע את הרעילות של האנטיביוטיקה. מוצגות נקודות קוונטיות מצומדות.

להלן דוגמה למערך הבדיקה. שימו לב כי הצמידים נבדקים בריכוזים עולים בשיטת quad duplicate; יש לכלול פס ביקורת של חיידקים בלבד, פס של תרופה בלבד ובארות דגימה עבור נקודות קוונטיות בלבד. ניתן להשתמש בקריאות OD 600 כדי להפיק עקומות גדילה, ואני רואה ערכי IC50 כפי שהיה קודם לכן.

איור זה מציג דוגמה לתצמידים בעלי רעילות דומה לזו של אנטיביוטיקה לבדה, ודוגמה לתצמידים בעלי רעילות גבוהה יותר. כדי לקבוע את מספר היחידות יוצרות המושבות או ה-CFU עבור כל תנאי, בחרו באer או יותר בארי מתוך פלטת 96 הבארים המטופלת לצורך ביצוע ספירת מושבות. בצעו דילול סדרה של כל אחת מהדגימות הבקטריאליות שנבחרו באמצעות תמיסת סלין.

לביצוע פעולה זו, העבירו בפיפט 180 µL של תמיסת סליין לעמודות המתאימות. העבירו 20 µL של תמיסת החיידקים ודללו אותם עם 180 µL של תמיסת סליין. החליפו את טיפ הפיפט, ערבבו והעבירו 20 µL של תמיסת החיידקים המדוללת לתוך 180 µL של תמיסת סליין.

חזור על תהליך זה שש פעמים. לאחר מכן, קח 10 µL מכל אחת משש הדילולות האחרונות והטבל אותן על פלטת Auger מלבנית. ניתן להטביל 36 נקודות על פלטה מלבנית.

השאירו את הצלחת להתייבש במשך 15 דקות על השולחן. לאחר 15 דקות, הדגירו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 שעות. לאחר ההדגירה, ספרו את המושבות כדי לקבוע את מספר היחידות יוצרות המושבות (CFU) למילילטר. הכפילו את מספר המושבות במקדם הדילול וחלקו בנפח שהועבר לצלחת כדי לקבוע את השפעת הטיפולים על הצמיחה הבקטריאלית.

צפיפות התאים של e coli נמדדה ב-OD 600. מוצגות כאן עקומות גידול חיידקיים מייצגות עם ריכוזי תרופה שונים, מאפס ועד למות תאים מלא. הסמלים הפתוחים מייצגים PMB בלבד עם הריכוזים המצוינים.

הסמלים המלאים מייצגים את C-D-T-E-P-M-B ללא הקרנה, והסמלים המלאים למחצה מייצגים את C-D-T-E-P-M-B עם הקרנה. להקרנה לא הייתה השפעה על דגימות של PMB בלבד, לכן עקומות אלו הושמטו לצורך בהירות התצוגה. להלן גרפים של ערכי עקומת הגדילה ב-200 דקות אל מול לוג PMB, והתאמות למשוואה זו כדי לקבוע ערכי IC 50 לבקרת השפעות האור.

בוצעה עקומת תגובה עם אנטיביוטיקה בלבד עם חשיפה לאור למשך 30 דקות. איור זה מראה את השרידות הבקטריאלית ב-200 דקות לעומת ריכוז ה-QD תוך שימוש ב-CDTE qds. נצפתה רעילות מסוימת עם חשיפה לאור, אך היא נמוכה מכדי לקבוע ערך IC 50.

דבר זה מעיד כי הרעילות של CDTE לבדו בריכוזים ששימשו בניסוי הצמידה היא זניחה בהשוואה להשפעות של טיפולים שונים על צמיחת התאים. ערכי עקומת הצמיחה בדקה ה-200 שורטטו והותאמו למשוואה שהוצגה קודם לכן, כפי שמוצג כאן. תמציתי C-D-T-E-P-M-B היו רעילים יותר מאשר PMB לבדו. להשוואה, תמציתי ננו-חלקיקי זהב A-U-P-M-B לא הראו רעילות מוגברת לעומת PMB לבדו, כדי לקבוע את השפעת הטיפולים על הישרדות החיידקים.

מספר היחידות יוצרות המושבות (CFU) נקבע עבור חיידקי e coli שהוצבו בלוחית 96 בארות שטופלה ב-P-M-B-Q-D-P-M-B או ב-QD לבדו, עם או בלי הקרה ב-I למשך 30 דקות, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 32 °C למשך ארבע שעות. בוצעו דלילות סדרתיות של כל דגימה בקטריאלית באמצעות תמיסת סליין, ו-10 µL של תמיסות בריכוזים שבין 100x ל-10⁷x נזרעו על צלחות אגר. הצלחות דגרו בטמפרטורה של 37 °C והמושבות נספרו לאחר 16 שעות.

בדוגמה זו, עמודי פלטה A עד C הם חיידקים שטופלו בריכוזים עולים של CDTE. קונג'וגטים ללא הקרנה, ועמודים D עד F הם חיידקים שטופלו בריכוזים עולים של קונג'וגטים. לצד הקרנה של 30 דקות, המדללים מוצגים לאורך השורות.

הנתונים מצביעים על כך שלאחר הקרנה, לתצמידים יש עיכוב רב יותר של הצמיחה הבקטריאלית בהשוואה לתצמידים ללא הקרנה. יש לזכור שריאגנטים של ca הם רעילים ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, חלוקי מעבדה ומשקפי מגן בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע סריקה בייעול גבוה (high throughput screening) של ההשפעה האנטי-בקטריאלית של ננו-חלקיקים עם או ללא הצמדה לאנטיביוטיקה.