הדמיה וניתוח של זרימת הדם ואת צריכת החמצן microcirculation כבד: בקשה דגם הפטיטיס חריפה

פותחה מערכת אופטית להדמיית מיקרו-סירקולציה בכבד עם אריתרוציטים פלואורסצנטיים ולמדידת הלחץ החלקי של חמצן בכלי המיקרו באמצעות הדמיית פוספו בסיוע לייזר. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי ניתוח מבנה מיקרו-וסקולרי, קוטר, מהירות זרימת דם ומתח חמצן. במיקרו-סירקולציה של הכבד, הדם זורם מפורטל ES למרכז E, ויוצר שיפוע חמצן בין השניים.

ריכוז החמצן בכבד משפיע הן על ביטוי האנזימים והן על הפתולוגיה, מה שהופך את ניתוח זרימת הדם ומדידת החמצן. נושאי מחקר חשובים. השיטה הניסיונית שלנו כוללת מתן תוך ורידי של תאי דם אדומים המסומנים בפלורסנט.

על מנת לדמיין מיקרו-סירקולציה באמצעות פלואורסצנטיות למדידת לחץ חלקי של חמצן, אנו נותנים תוך ורידי פלדיום פורפירין, הפולט זרחן בזרם הדם כאשר הוא מעורר על ידי לייזר במידה התלויה בריכוז החמצן שמסביב. תהליך זה מאפשר ניתוח כמותי של חמצן, מדידת לחץ חלקי במיקרו-סירקולציה של הכבד הראתה לחץ חלקי של חמצן ורידי מרכזי של 59.8 ו-38.9 מילימטרים של כספית בהתאמה, מה שמדגים מדידה יעילה של ריכוז החמצן. לאחר מכן, יישמנו את המתודולוגיה הזו על מודל הפטיטיס.

מצאנו לחץ חלקי מוגבר של חמצן בפורטל ES סינוסואידלי ומרכזי, אך הפרש לחץ מופחת בין הפורטל למרכזי. סביר להניח שהסיבה לכך היא ירידה בצריכת החמצן באזור Ven המרכזי עקב נמק הפטוציטים. תוצאות אלה מראות כי המתודולוגיה שלנו של שימוש במערכת אופטית למדידת המודינמיקה של הכבד וצריכת חמצן מסוגלת להבהיר מנגנונים של מחלות כבד שונות במיקרו-סירקולציה של הכבד.

שיפוע חמצן הוא פרמטר חיוני הכולל ביטויים של אנזימים באזורים פריפורטליים ופרה-מרכזיים, סוגים של מחלות כבד הקשורות להתפלגות מיקרו, ולכן חשוב לכמת את זרימת הדם וצריכת החמצן. כדי להבהיר את המנגנונים, היתרון של השיטה שלנו הוא ללא מגע ומדידה אופטית רציפה יכולה לכמת את זרימת הדם, קוטר כלי הפיצוץ ושיפוע החמצן במיקרו סירקולציה של הכבד. דם מלא נלקח מעכבר תורם והאריתרוציטים נשטפו פעמיים עם PBS על ידי צנטריפוגה ב-400 גרם למשך חמש דקות.

לאחר מכן, ממיסים שני מיליגרם של FITC במיליליטר אחד, 100 מילימולר של DI נתרן מימן פוספט לפני סינון דרך קרום נקבוביות של 0.2 מיקרון. לאחר מכן הניחו תמיסת FITC של מיליליטר אחד במבחנה יחד עם תמיסה מיומנת של 0.15 מיליליטר שלוש מילי-מולריות, 0.25 מיליליטר 180 מילי-מולרי נתרן מימן פוספט, ו-1.5 מיליליטר 100 מילי-מולרי נתרן מימן פוספט והקש כדי לערבב. שמור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים לפני שטיפת ה-RBCs המוכתמים פעמיים עם PBS.

לאחר מכן, הניחו כמות קטנה של תרחיף RBC על מגלשת זכוכית ואשרו גם מראה RBC רגיל וגם פלואורסצנטיות מספקת השעו 0.1 מיליליטר של RBCs ב-0.9 מיליליטר PBS ושמרו אותו ארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש הבא, ממיסים 500 מיליגרם BSA ב-10 מיליליטר PBS. לאחר מכן מוסיפים 30 מיליגרם של פורפירין פלדיום ומערבבים צנטריפוגה למשך הלילה, התמיסה להסרת כל פורפירין פלדיום לא פתור ומסנן את ה-SUP natin דרך קרום רהוט של 0.2 מיקרון, מיליליטר אחד של סינון לתוך מבחנות ומאחסנים במינוס 20 מעלות צלזיוס. הקפידו להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.

כדי לדמיין את המיקרוסירקולציה במיקרוסקופ, חותכים חור בקוטר 20 מילימטר בצלחת פלסטיק ומכסים את החור בזכוכית כיסוי מרובעת 30 מילימטרים לצד. מורחים את אונת הכבד הראשית על צלחת פלסטיק במצב נוטה לאחר קנולציה של וריד זנב. לאחר מכן, השתמש בחלקים מרובים של שלושה מילימטר על שמונה מילימטר של ניילון פלסטיק כדי לכסות את האזור המקיף את האונה כדי למנוע תנועה מהנשימה והייבוש.

דמיין את זרימת הכבד באמצעות מיקרוסקופ שידור וודא שאין קיפאון בזרימת הדם בשדה הראייה למשך 15 דקות לפחות. כדי להתבונן בזרימת הדם יש להזריק בהדרגה. נקודתי שני מיליליטר של RBCs המסומנים בפלואורסצנט.

כדי למדוד את לחץ החמצן החלקי יש להזריק 0.2 מיליליטר של תמיסת פורפירין פלדיום. RBCs המסומנים ב-FITC יהוו חמישית מכל ה-RBCs במחזור באזור החזותי, ירגשו את ה-FITC על ידי הקרנתו עם מנורת כספית המועברת דרך מסנן מעבר פס של 450 עד 490 ננומטר ויקליטו את הקרינה עם מצלמת CCD. זרחן פלדיום פורפירין חלש יחסית ודורש גלאי רגישות גבוהה וחדר חשוך.

שיאי ספיגת פורפירין פלדיום הם בסביבות 410 ו-532 ננומטר, ואורך הגל ההרמוני השני של 532 ננומטר מומלץ. אורך גל זה מיוצר על ידי לייזר דופק YAG ניאודימיום, מחבר את קרן הלייזר למיקרוסקופ הפוך ומתאים את עצמו כך שהקרן מאירה את מרכז מישור המוקד. הרזולוציה המרחבית של הלייזר תלויה בגודל הנקודה, אותו ניתן לכוונן על ידי העברת הקרן דרך חור סיכה.

חבר מסנן מעבר ארוך וצינור מכפיל פוטו למיקרוסקופ גם כדי לזהות זרחן. ה-PMT צריך להיות רגיש לאורכי גל אדומים, במיוחד בסביבות 700 ננומטר. דגימת האות הזרחני וחישוב קבוע זמן הדעיכה על ידי החלת פונקציה מעריכית.

בניסוי זה, דגמנו 500 נקודות ב-200 קילו-הרץ. לכיול, הכינו שתי תמיסות פורפירין פלדיום עם לחץ חלקי של חמצן של 150 ואפס מילימטרים כספית כל אחת. עבור אפס מילימטרים של תמיסת כספית, הוסף 1% נתרן דיהי לדגימות כדי ליצור מצב שבו חמצן נעדר במהלך הכיול.

שמור על pH דגימה של 7.4 וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מקם את העכבר על שלב המיקרוסקופ והתאם את המיקרו-כלים שעבורם ברצונך לדמיין מיקרו-סירקולציה בכבד עד לנקודת הלייזר עכברים מהירים עם גישה חופשית למים למשך הלילה, הזריקו פרצטמול ב-200 מיליגרם לק"ג תוך צפקי 24 שעות מההזרקה, הרדימו את העכבר וחשפו את הכבד בחתך חציוני. אם יש דלקת כבד, היא תיראה בקלות לעין בלתי באמצעות נמק באזור הפרה-מרכזי.

המדידה שלנו של לחץ חמצן חלקי וכלי מיקרו כבד בעכברים הראתה לחץ חמצן ממוצע עבור קרקעות פורטל, סינוסים וורידים מרכזיים של 59.8, 48.2 ו-38.9 מילימטרים של כספית בהתאמה. במילים אחרות, שיפוע החמצן מהפורטל למרכז ES מצביע על שחרור מספיק של חמצן מ-RBCs כשהם עוברים דרך הסינוסואידים. הכנו עכברים המושרים על ידי אצטמינופן למדידת מיקרו-כלי כבד.

כמודל פתולוגי לדוגמה, מצאנו כי לחצים חלקיים של חמצן בוורידים פורטליים, סינוסואידליים ומרכזיים Es היו גבוהים יותר בקבוצת האצטמינופן בהשוואה לעכברים רגילים. הפרש הלחץ החלקי של החמצן בין הוורידים הפורטליים והמרכזיים היה 20.9 מילימטר כספית לעכברים רגילים ו-16.9 מילימטרים כספית לעכברי מודל הפטיטיס. הפרש הלחץ החלקי של החמצן בין הוורידים הפורטליים והמרכזיים היה 20.9 מילימטר כספית לעכברים רגילים ו-16.9 מילימטרים כספית לעכברי מודל הפטיטיס.

שיפוע החמצן במיקרו-סירקולציה של הכבד נוצר בעיקר עקב אספקת חמצן מה-ven הפורטלי הנצרך על ידי הפטוציטים, נמק הפטוציטים באזור הווריד המרכזי הנגרם על ידי אצטמינופן מביא לירידה בצריכת החמצן, מיקרו-סירקולציה במורד הזרם, ולכן בעיות הקשורות להמודינמיקה. אספקת חמצן וצריכת חמצן מעורבים בצורות רבות של מחלות כבד. עשינו מודל דלקת כבד חריפה ומצאנו עלייה במתח החמצן בכלי מיקרו.

ניתן להשתמש במערכת האופטית שלנו כדי לחקור מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי ניתוח מבנה מיקרו-וסקולרי, במקום חלוקת זרימה וצריכת חמצן.