Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

קיים צורך דחוף בספירת CD4 במחיר נגיש לצורך ניטור מחלת ה-HIV באזורים עם משאבים מוגבלים. סרטון זה מדגים בדיקת סקר זולה בנקודת הטיפול (point of care), שבה מספר תאי ה-CD4 נקבע על סמך נוכחותו של מעכב הפרוטאז Alpha one PI ברוק. לצורך כך, הנבדק או המטופל מקבל תחילה סוכריית לימון כדי לעודד הפרשה של נוזל סרוזי אל תוך הרוק.

הרוק נאסף לכלי דגימה ומועבר ללוח סריקה בעל 96 בארות. לאחר מכן, מתווספת כמות רוויה של הפרוטינאזה porcine pancreatic elastase לרוק, שם היא נקשרת ומעכבת את alpha one pi. לאחר מכן, מתווסף סובסטרט קולורימטרי לאלסטז.

כל elastase שנותר ללא קשירה מ 끊ה את התסבסב, מה שגורם לשינוי צבע משקוף לצהוב. Kumasi blue מתווסף לבארות כדי לצבוע את סך החלבון, ומדידות קולורימטריות מבוצעות באמצעות קורא מיקרופלטה. לבסוף, נקבע היחס בין alpha one PI לסך החלבון, והוא משמש להערכה מדויקת של ספירת CD four על בסיס ערך אינדקס.

קיימים מספר יתרונות לטכניקה זו על פני השיטה הקיימת, שהיא ציטומטריית זרימה. ניתן לבצע את הבדיקה בשטח ללא איסוף דם, שהוא תהליך טראומטי ויקר, ללא שימוש בנוגדנים מונוקלונאליים, שהם יקרים, ללא צורך בהכשרה טכנית וללא צורך בקירור או בהובלת דגימות. שיטה זו מסירה מחסום קריטי להתערבות במקרי AIDS ועשויה להשפיע באופן משמעותי על העלויות ועל תוצאות הבריאות של המטופלים ועל תדירות ההדבקה ב-HIV, אשר לכל אלה השפעה מרכזית על הכלכלה העולמית.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופן שבו Alpha ו-PI מווסתים את מספר תאי ה-CD4 T באמצעות היצמדות ונדידה, אך ניתן להחילה גם על מערכות אחרות, כגון האופן שבו מעכבי חלבונים אחרים מווסתים את ההיצמדות ואת נדידת התאים של סוגי תאים אחרים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר גילינו כי רמות ה-Alpha one PI בחולים נגועים ב-HIV היו נמוכות כל כך, עד שהן למעשה מגבילות את מספר תאי ה-CD4 T שמגיעים לדם. התחילו את הפרוטוקול בהכנת תמיסות העבודה הדרושות עבור כל מיקרופלטה שבה תשתמשו.

הכינו 60 milliliters של תמיסת tris, buffered saline או TBS בריכוז 0.05 molar וב-pH של 7.8. בנוסף, עבור כל מיקרופלט, הכינו six milliliters של elastase הלבלב מחזיר (porcine pancreatic elastase) מסוג 1 או PPE. נערו היטב את תרחיף ה-PPE ולאחר מכן דללו אותו ב-TBS לריכוז של כ-0.01 units per milliliter.

בשלב הבא, הכינו תמיסת מקור בריכוז 0.1 מולרי של הסובסטרט הצבעני SA three NA ב-DMSO. יש להשתמש בתמיסת מקור זו באופן מיידי, או לאחסנה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס אם היא לא תשמש לשימוש מיידי. הכינו שש מיליליטר של תמיסת עבודה עבור כל מיקרופלטה על ידי דילול של 1:100 ב-TBS. לבסוף, הכינו תמיסת מקור של 10% kumasi brilliant blue R two 50 ב-TBS, והשתמשו בה באופן מיידי או אחסנו אותה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס אם היא לא תשמש לשימוש מיידי.

הכינו שישה מיליליטרים לכל מיקרופלטה על ידי דילול של תמיסת המקור ביחס של 1:1000 ב-TBS. בעת טיפול ברוק, חשוב לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה, כאשר נסיין המחקר או המטופל נמצא במצב עמידה. מקמו SGO בפה כדי לעודד הפרשת סרום.

תפקידו של חולה ה-HIV בהדגמה זו מבוצע על ידי עוזר מחקר. סוכרייה מהלכה בטעם לימון ללא סוכר היא פתרון נוח עבור חולי HIV שסובלים לעיתים קרובות מאדנטוליה (אובדן שיניים) ואינם מסוגלים ללעס מסטיק; יש לבלוע כפי שנדרש במהלך שלוש הדקות הראשונות, ולאחר מכן לאסוף רוק מכל הפה לכלי דגימה במשך שלוש הדקות הבאות. פעולה זו תספק כ-2 mL של רוק.

אם הרוק לא ישמש באופן מיידי, יש להקפיאו ולאחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס; ביום העיבוד יש להמיס את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, ניתן לאחסן את הרוק בטמפרטורה של שתיים עד ארבע מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים. יש להעביר כל דגימה ובקרת איכות בtriplicate לצלחת 96 בארות בעלת תחתית שטוחה כדי להקים את המערך, תוך הוספת 130 µL של TBS לכל אחת מבארות הדגימה ובארות הבקרה.

לאחר מכן יש להימנע ממוצין, שהוא צמיגי ואינו מכיל תסריג סרום. העבירו 20 µL של רוק לכל אחד משלושה בארי בדיקה ושלושה בארי ביקורת שלילית. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של TBS לבארי ביקורת חיובית וערבבו באמצעות פיפטינג.

בשלב זה, חשוב להימנע מערבוב במיקסר (vortexing) שעלול ליצור בועות בעת פיפוט הרוק, ולהימנע מפיפוט של חלקיקים מוצקים וריר. לאחר מכן, נעזער את תמיסת העבודה של ה-pancreatic elastase (PPE) החיובית היטב כדי לערבב אותה, ולאחר מכן נוסיף 50 µL לבארי הדגימה ולבארי הביקורת החיובית, ולבארי הביקורת השלילית.

הוסיפו 50 µL של TBS. אין צורך לערבב מכיוון שהנפח שהוסף גדול מספיק כדי לאפשר התפלגות אחידה לתוך תערובת הרוק. דגרו את הפלטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הוסף 50 µL של תמיסת העבודה של מצע האלאסטאז SA three NA לכל באער. לאחר מכן, הדגר למשך 45 דקות נוספות בטמפרטורה של 23 °C. לאחר שעברו 45 דקות, הוסף 50 µL של תמיסת עבודה של Kumasi blue לכל באער.

לאחר מכן, קראו את הבליעה במקרא מיקרו-פלטה (microplate reader) באורכי גל של 405 ננומטרים לגילוי פיצול SA three NA ו-595 ננומטרים לגילוי kumasi blue, המייצג את תכולת החלבון הכוללת. כדי לחשב את מדד alpha one PI, השתמשו תחילה בנוסחה הבאה לקבלת הבליעה הנורמלית עבור כל אורך גל, על ידי חלוקת ההפרש בין הממוצע של הדגימה לממוצע של הביקורת השלילית בהפרש בין הממוצע של הביקורת החיובית לממוצע של הביקורת השלילית. לאחר מכן, כדי לקבל את מדד alpha one PI, חלקו את הבליעה הנורמלית ב-405 ננומטרים בבליעה הנורמלית ב-595 ננומטרים, כפי שמוצג כאן, כדי לקבוע האם בדיקת alpha עשויה להתאים לשימוש כבדיקת סריקה בנקודת הטיפול (point of care) לניטור ספירות CD four באזורים אנדמיים עם משאבים מוגבלים.

רוק מעורר נאסף מ-20 נשים ו-11 גברים עם HIV-1 הפקידו את ביקוריהם במרפאה לטיפול שגרתי בקמרון; בדומה לתצפיות ראשוניות במהלך פיתוח בדיקת האלפא, תוך שימוש ברוק שנאסף בניו יורק, מדד alpha one PI והרוק שנאסף בקמרון נמצאו במתאם עם ספירות CD4 עם ערך R squared של 0.91 וערך P של פחות מ-0.0001. הקשר הוגדר באמצעות עקומה סיגמואידלית בעלת שלושה פרמטרים, דבר התואם לקשר של תגובה למינון. רווחי הסמך והניבוי של 95% מוצגים בקוים כחולים ואדומים בהתאמה.

במחקר קודם, קבענו שתאי T חיוביים ל-CD4 מראים מחזוריות סינוסואידלית עם מחזוריות של 23 פלוס מינוס 3.5 ימים בנבדקים עם HIV-1 ובנבדקים עם הגרסה התורשית של חסר ב-alpha one PI, מסוג PIZZ. מוצג כאן דוגמה מייצגת של ניתוח עקומה סינוסואידלית ממוחשב של מחזוריות CD4 בבקרה בריאה ללא HIV, המציגה מחזוריות של 27 ימים. ניתוח עקומה סינוסואידלית ממוחשב של שינויים בתאי T חיוביים ל-CD4 בשישה נבדקים הניב ערכים לאמפליטודה משיא לשיא ולציר התנודה כמצופה. ציר התנודה נמצא במתאם עם האמפליטודה עם ערך R-squared של 0.96 וערך p של 0.009.

במטופלים עם ספירת תאי T חיוביים ל-CD4 נמוכה, השינויים המחזוריים בספירת תאי T חיוביים ל-CD4 היו קטנים, ובמטופלים עם ספירת תאי T חיוביים ל-CD4 גבוהה, השינויים המחזוריים היו גדולים, מכיוון שקו הרגרסיה המוצג כאן מעריך את ציר התנודה, וציר התנודה נמצא במתאם עם האמפליטודה. ניתן לחשב את האמפליטודה עבור קו הרגרסיה כדי להעריך באיזו מידה צפויים תאי T חיוביים ל-CD4 להשתנות מעל ומתחת לקו הרגרסיה כתוצאה מהמחזוריות; לאחר השכבת האמפליטודה שחושבה ורווח הביטחון, נמצא כי האמפליטודה המסומנת בקו הירוק נמצאת בתוך רווח הביטחון של 95% המסומן בקו הכחול.

ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך 90 דקות, מרגע איסוף הרוק ועד לקבלת מספר תאי CD4 עבור המטופל. הליך זה נועד לשמש כבדיקה לסריקה לצורך ניטור רמות CD4. אם המטופל מראה שינויים משמעותיים בספירת תאי CD4, יש לבצע מעקב עבורו באמצעות flow cytometry כדי לוודא שהמדידות של רמות CD4 תקפות וכדי לסייע בקבלת החלטות טיפוליות.

בשלב הפיתוח הבא, בדיקת המיקרופלטה תומר לטכנולוגיית סטיק (dipstick), שתאפשר ביצוע בדיקות ללא צורך במכשיר או בחשמל. הסבירות להדבקה ב-HIV דרך רוק היא נמוכה, אך למטופלי HIV יש לעיתים קרובות מחלות זיהומיות אחרות כגון שחפת והפטיטיס C, לכן יש לזכור שעבודה עם רוק, בדומה לעבודה עם דם, עלולה להיות מסוכנת ביותר בשל חלקיקים זיהומיים שאינם ידועים. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות ושימוש בציוד הגנה אישי אחר בעת ביצוע הליך זה.